Aminosäureanalyse bei Peptiden erklärt
Aminosäureanalyse bei Peptiden: Zusammensetzung und Quantifizierung erklärt
Peptide bestehen aus Ketten von Aminosäuren. Die Reihenfolge dieser Aminosäuren bestimmt einen großen Teil der chemischen und strukturellen Eigenschaften eines Peptids.
Bei Qualitätsuntersuchungen werden häufig Techniken wie HPLC und Massenspektrometrie eingesetzt, um die Reinheit und Molekülmasse zu beurteilen. Eine ergänzende Analysemethode ist die Aminosäureanalyse, häufig als AAA abgekürzt.
Die Aminosäureanalyse kann verwendet werden, um zu untersuchen:
- welche Aminosäuren in einer Probe vorhanden sind;
- wie die gemessenen Aminosäureverhältnisse mit der erwarteten Zusammensetzung übereinstimmen;
- wie viel Peptid vorhanden ist;
- ob die Aminosäurezusammensetzung zum theoretischen Peptid passt;
- wie der Nettogehaltdes Peptids berechnet werden kann.
Die Methode funktioniert anders als HPLC und Massenspektrometrie. Bei der klassischen Aminosäureanalyse wird die Peptidkette zunächst in einzelne Aminosäuren aufgespalten. Anschließend werden diese Aminosäuren getrennt, nachgewiesen und quantifiziert.
Die Aminosäureanalyse kann wertvolle Informationen liefern, hat aber auch Einschränkungen. Während des Abbaus können sich einige Aminosäuren teilweise verändern oder verloren gehen. Daher müssen die Ergebnisse immer im Kontext der verwendeten Methode interpretiert werden.
Was ist eine Aminosäureanalyse?
Die Aminosäureanalyse ist eine Labortechnik, mit der die Aminosäurezusammensetzung einer Probe untersucht wird.
Bei einer klassischen Analyse werden in der Regel die folgenden Schritte durchgeführt:
- Probenvorbereitung;
- Hydrolyse der Peptidkette;
- Freisetzung einzelner Aminosäuren;
- Trennung der Aminosäuren;
- Nachweis und Quantifizierung;
- Vergleich mit der erwarteten Zusammensetzung.
Das Ergebnis kann dargestellt werden als:
- Menge je Aminosäure;
- Molverhältnis;
- Massenkonzentration;
- Aminosäureprofil;
- berechneter Peptidgehalt.
Was ist Hydrolyse?
Hydrolyse ist ein chemischer Prozess, bei dem Bindungen mithilfe von Wasser gespalten werden.
Bei der Aminosäureanalyse werden die Peptidbindungen aufgespalten, sodass einzelne Aminosäuren freigesetzt werden.
Eine häufig verwendete Methode ist die saure Hydrolyse.
Dabei wird die Probe über einen kontrollierten Zeitraum Folgendem ausgesetzt:
- starke Säure;
- erhöhte Temperatur;
- kontrollierte Bedingungen.
Nach der Hydrolyse liegt die ursprüngliche Peptidkette nicht mehr als intaktes Molekül vor.
Die freigesetzten Aminosäuren können anschließend einzeln untersucht werden.
Warum wird die Peptidkette abgebaut?
Ein intaktes Peptid kann Dutzende verschiedener Aminosäurereste enthalten.
Durch das Aufbrechen der Kette kann die Gesamtmenge jeder Aminosäure gemessen werden.
Nehmen wir an, ein theoretisches Peptid enthält:
- vier Alaninreste;
- zwei Glycinreste;
- drei Leucinreste;
- ein Tyrosinrest.
Nach der Hydrolyse kann untersucht werden, ob die gemessenen Verhältnisse ungefähr dieser theoretischen Zusammensetzung entsprechen.
Dies unterstützt die Beurteilung der Aminosäurezusammensetzung.
Was ist der Unterschied zwischen Aminosäurezusammensetzung und Aminosäuresequenz?
Die Aminosäureanalyse misst vor allem, welche Aminosäuren vorhanden sind und in welcher Menge.
Die Methode bestimmt nicht automatisch die exakte Reihenfolge.
Zwei verschiedene Peptide können dieselbe Aminosäurezusammensetzung, aber eine andere Reihenfolge haben.
Zum Beispiel:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Beide enthalten:
- ein Alanin;
- ein Glycinmolekül;
- ein Leucin.
Dennoch ist die Sequenz unterschiedlich.
Für die Sequenzuntersuchung sind andere Techniken erforderlich, wie zum Beispiel:
- Tandem-Massenspektrometrie;
- Fragmentanalyse;
- spezifische Sequenzierungsmethoden.
Kann eine Aminosäureanalyse die Identität bestätigen?
Eine Aminosäureanalyse kann die erwartete Zusammensetzung stützen.
Wenn das gemessene Aminosäureprofil stark von der theoretischen Zusammensetzung abweicht, kann dies Anlass für weitere Untersuchungen sein.
Ein übereinstimmendes Profil beweist jedoch nicht allein, dass die exakte Aminosäuresequenz korrekt ist.
Für eine umfassendere Identitätsbewertung können kombiniert werden:
- Molekülmasse;
- LC-MS;
- MS/MS;
- Aminosäureanalyse;
- chromatografische Daten.
Wie werden Aminosäuren getrennt?
Nach der Hydrolyse enthält die Probe ein Gemisch freier Aminosäuren.
Diese müssen analytisch voneinander getrennt werden.
Mögliche Techniken sind:
- Ionenaustauschchromatografie;
- HPLC;
- UPLC;
- Kapillarelektrophorese.
Die gewählte Technik hängt ab von:
- gewünschte Empfindlichkeit;
- Labormethode;
- Probentyp;
- erforderliche Genauigkeit.
Was ist eine Derivatisierung?
Viele Aminosäuren sind ohne zusätzliche Behandlung nur eingeschränkt detektierbar.
Daher können sie chemisch an eine detektierbare Gruppe gekoppelt werden.
Dies wird Derivatisierung genannt.
Eine Derivatisierung kann erfolgen:
- vor der chromatografischen Trennung;
- nach der chromatografischen Trennung.
Die gebildeten Derivate können beispielsweise besser gemessen werden mit:
- UV-Detektion;
- Fluoreszenzdetektion;
- Massenspektrometrie.
Vor-Säulen-Derivatisierung
Bei der Vor-Säulen-Derivatisierung werden Aminosäuren vor der chromatografischen Trennung markiert.
Anschließend werden die gebildeten Derivate über eine Säule getrennt.
Mögliche Vorteile sind:
- hohe Empfindlichkeit;
- geeignete Fluoreszenzdetektion;
- Analyse mehrerer Aminosäuren.
Die Reaktion muss reproduzierbar ablaufen.
Eine unvollständige Derivatisierung kann die Quantifizierung beeinflussen.
Post-Column-Derivatisierung
Bei der Post-Column-Derivatisierung werden Aminosäuren zunächst getrennt.
Nach der Säule reagieren sie mit einem Detektionsreagenz.
Ein bekanntes Beispiel ist die Analyse mit Ninhydrin.
Die gebildeten Reaktionsprodukte können anschließend optisch gemessen werden.
Wie wird die Aminosäuremenge bestimmt?
Für die Quantifizierung werden Referenzstandards verwendet.
Standardlösungen enthalten bekannte Mengen an Aminosäuren.
Diese werden gemessen, um eine Beziehung zwischen Folgendem herzustellen:
- Konzentration;
- Detektorsignal.
Anschließend wird die unbekannte Probe gemessen.
Anhand der Kalibrierdaten kann die Menge jeder Aminosäure berechnet werden.
Was ist ein interner Standard?
Ein interner Standard ist eine bekannte Substanz, die Proben und Kalibrierlösungen zugesetzt wird.
Dieser kann helfen, Schwankungen während der folgenden Schritte zu korrigieren:
- Probenvorbereitung;
- Injektion;
- Derivatisierung;
- Analyse.
Der interne Standard muss analytisch gut von den untersuchten Aminosäuren unterscheidbar sein.
Wie kann die Aminosäureanalyse den Peptidgehalt bestimmen?
Wenn die Aminosäurezusammensetzung eines Peptids bekannt ist, können ausgewählte Aminosäuren zur Berechnung der Peptidmenge verwendet werden.
Angenommen, jede Peptidkette enthält genau vier Alaninreste.
Wenn die Gesamtmenge an Alanin gemessen wird, kann daraus geschätzt werden, wie viele Peptidketten vorhanden waren.
Die Berechnung berücksichtigt:
- Anzahl der Residuen pro Peptid;
- Molekülmasse;
- gemessene Aminosäuremenge;
- Analysemethode.
Dies kann für einen quantitativen Peptidassay verwendet werden.
Warum werden nicht immer alle Aminosäuren verwendet?
Nicht jede Aminosäure ist gleichermaßen für die Quantifizierung geeignet.
Einige Aminosäuren können während der Hydrolyse:
- teilweise abgebaut werden;
- sich chemisch verändern;
- unvollständig freigesetzt werden;
- nur schwer zuverlässig gemessen werden.
Daher werden häufig stabile Aminosäuren ausgewählt.
Die Auswahl hängt von der Peptidsequenz und der Analysemethode ab.
Welche Aminosäuren können sich während der Hydrolyse verändern?
Eine saure Hydrolyse kann verschiedene Auswirkungen haben.
Tryptophan
Tryptophan kann während der standardmäßigen sauren Hydrolyse größtenteils abgebaut werden.
Daher sind angepasste Methoden erforderlich, wenn Tryptophan spezifisch gemessen werden soll.
Asparagin
Asparagin kann während der Hydrolyse in Aspartat umgewandelt werden.
Dadurch werden Asparagin und Aspartat bei der klassischen Analyse nicht immer getrennt berichtet.
Glutamin
Glutamin kann in Glutamat umgewandelt werden.
Dadurch können Glutamin und Glutamat gemeinsam dargestellt werden.
Serin
Serin kann während einer längeren Hydrolyse teilweise verloren gehen.
Threonin
Auch Threonin kann teilweise abgebaut werden.
Cystein
Cystein kann oxidative Veränderungen erfahren.
Für eine zuverlässige Analyse kann eine vorherige Oxidation oder eine angepasste Methode erforderlich sein.
Warum ist die Hydrolysezeit wichtig?
Die Peptidbindungen müssen ausreichend gespalten werden.
Eine zu kurze Hydrolyse kann zu Folgendem führen:
- unvollständiger Abbau;
- zu niedrigen gemessenen Aminosäurewerten.
Eine zu lange Hydrolyse kann zu Folgendem führen:
- weiterer Abbau empfindlicher Aminosäuren;
- Messverlust.
Daher werden Hydrolysezeit und Temperatur kontrolliert.
Manchmal werden mehrere Hydrolysezeiten verwendet, um Verluste oder einen unvollständigen Abbau zu untersuchen.
Was ist ein Molverhältnis?
Ein Molverhältnis beschreibt die relativen Mengen der Aminosäuren.
Angenommen, ein Peptid enthält theoretisch:
- zwei Alaninmoleküle;
- ein Glycinmolekül;
- drei Leucinmoleküle.
Das theoretische Molverhältnis ist:
2 : 1 : 3
Nach der Analyse können die gemessenen Werte normalisiert werden.
Wenn das Verhältnis nahe am theoretischen Wert liegt, stützt dies die erwartete Aminosäurezusammensetzung.
Kleine Abweichungen können entstehen durch:
- Messunsicherheit;
- Hydrolyseverlust;
- Derivatisierung;
- Integration chromatografischer Peaks.
Was bedeutet Normalisierung?
Bei der Normalisierung werden die gemessenen Aminosäurewerte in relative Verhältnisse umgerechnet.
Eine geeignete Aminosäure kann als Referenz verwendet werden.
Dadurch kann das gemessene Profil mit der theoretischen Zusammensetzung verglichen werden.
Die Normalisierung ist für die Untersuchung der Zusammensetzung nützlich, liefert aber nicht automatisch die absolute Peptidmenge.
Aminosäureanalyse im Vergleich zur HPLC-Reinheit
HPLC-Reinheit und Aminosäureanalyse messen unterschiedliche Eigenschaften.
Die HPLC-Reinheit untersucht in der Regel:
- chromatografischer Hauptpeak;
- relative Menge der Nebenpeaks.
Die Aminosäureanalyse untersucht:
- Aminosäurezusammensetzung;
- Menge ausgewählter Aminosäuren;
- mögliche Peptidquantifizierung.
Eine hohe HPLC-Reinheit beweist nicht automatisch, dass die Aminosäurezusammensetzung korrekt ist.
Eine passende Aminosäurezusammensetzung beweist nicht automatisch, dass keine peptidbezogenen Verunreinigungen vorhanden sind.
Die Techniken ergänzen sich.
Aminosäureanalyse im Vergleich zur Massenspektrometrie
Die Massenspektrometrie untersucht das Masse-Ladungs-Verhältnis von Molekülen.
Eine Messung der intakten Masse kann bestätigen, dass die Molekülmasse dem theoretischen Wert entspricht.
Die Aminosäureanalyse untersucht die Menge und das Verhältnis der Aminosäuren nach der Hydrolyse.
Beide Techniken haben unterschiedliche Stärken.
Eine Kombination kann weitere Informationen liefern:
- Identität;
- Zusammensetzung;
- Peptidgehalt.
Aminosäureanalyse versus Peptid-Assay
Die Aminosäureanalyse kann selbst als Assaymethode verwendet werden.
Ein Peptid-Assay beschreibt das Ziel:
die Peptidmenge bestimmen.
Die Aminosäureanalyse ist eine der Techniken, mit denen dieses Ziel erreicht werden kann.
Andere mögliche Assaymethoden sind:
- quantitative HPLC;
- UV-Spektrofotometrie;
- LC-MS-Quantifizierung;
- Massenbilanz.
Welchen Einfluss haben Gegenionen?
Gegenionen wie:
- Acetat;
- Chlorid;
- TFA;
tragen zur Gesamtmasse des gefriergetrockneten Materials bei.
Bei der Aminosäureanalyse werden vor allem die Aminosäurekomponenten des Peptids untersucht.
Dadurch kann die Methode helfen, zwischen Folgendem zu unterscheiden:
- Gesamtmasse des Materials;
- tatsächliche Peptidmenge.
Für eine vollständige Massenbilanz können zusätzliche Analysen erforderlich sein.
Welchen Einfluss hat Restfeuchtigkeit?
Restfeuchtigkeit trägt zum Gesamtgewicht bei, jedoch nicht zur Aminosäurezusammensetzung.
Bei der Berechnung des Nettogehalts an Peptid kann eine Feuchtigkeitsanalyse zusätzliche Informationen liefern.
Eine umfassende Massenbilanz kann Folgendes umfassen:
- Peptidgehalt;
- Wassergehalt;
- Gegenionengehalt;
- sonstige Komponenten.
Kann eine Aminosäureanalyse Verunreinigungen nachweisen?
Einige abweichende Aminosäuresignale können auf unerwartete Komponenten hinweisen.
Die Methode ist jedoch nicht darauf ausgelegt, jede mögliche Verunreinigung nachzuweisen.
Für Folgendes können andere Techniken erforderlich sein:
- organische Verunreinigungen;
- Restlösemittel;
- Metalle;
- mikrobiologische Kontamination;
- Endotoxine.
Was kann in einem Analysenzertifikat stehen?
Ein Analysenzertifikat kann beispielsweise folgende Informationen enthalten:
- Test: Aminosäureanalyse;
- Analysemethode;
- gemessene Aminosäureverhältnisse;
- theoretische Verhältnisse;
- berechneter Peptidgehalt;
- Testdatum;
- Chargennummer.
Nicht jedes Analysenzertifikat enthält eine Aminosäureanalyse.
Wenn nur HPLC und MS durchgeführt wurden, lässt sich daraus keine vollständige Aminosäurequantifizierung ableiten.
Warum ist die Chargenzuordnung wichtig?
Eine Aminosäureanalyse muss der untersuchten Charge zugeordnet sein.
Wichtige Angaben sind:
- Losnummer;
- Produktname;
- Analysedatum;
- Labor;
- Analysemethode.
Ein Analysebericht ohne eindeutige Chargenzuordnung ist für die Rückverfolgbarkeit weniger wertvoll.
Was bedeutet Messunsicherheit?
Jede quantitative Analyse beinhaltet Messunsicherheit.
Bei der Aminosäureanalyse können folgende Variationsquellen auftreten:
- Probenvorbereitung;
- Hydrolyse;
- Aminosäureverlust;
- Derivatisierung;
- Kalibrierung;
- chromatografische Trennung;
- Peak-Integration.
Daher sollten Ergebnisse nicht als absolut fehlerfrei betrachtet werden.
Warum ist die Methodenvalidierung wichtig?
Eine Methode muss für den vorgesehenen Zweck geeignet sein.
Bei der quantitativen Aminosäureanalyse können relevante Validierungsmerkmale sein:
- Genauigkeit;
- Präzision;
- Linearität;
- Spezifität;
- Messbereich;
- Robustheit;
- Wiederholbarkeit.
Eine Methode, die für ein qualitatives Aminosäureprofil geeignet ist, reicht nicht automatisch für eine exakte Peptidquantifizierung aus.
Wissenschaftliche Einschränkungen
Die Aminosäureanalyse hat wichtige Einschränkungen.
Die Methode bestimmt nicht eigenständig:
- exakte Aminosäuresequenz;
- Molekülmasse;
- HPLC-Reinheit;
- dreidimensionale Struktur;
- Biologische Aktivität;
- Sterilität;
- Endotoxingehalt.
Darüber hinaus können sich einige Aminosäuren während der Hydrolyse verändern.
Für eine umfassende Qualitätsbewertung müssen mehrere Analysetechniken kombiniert werden.
Zusammenfassung
Die Aminosäureanalyse untersucht die Zusammensetzung und Menge der Aminosäuren in einem Peptid.
Bei der klassischen Analyse wird die Peptidkette zunächst durch Hydrolyse aufgespalten.
Anschließend werden die Aminosäuren:
- getrennt;
- detektiert;
- quantifiziert;
- mit der theoretischen Zusammensetzung verglichen.
Die Aminosäureanalyse kann verwendet werden für:
- Kontrolle der Aminosäurezusammensetzung;
- Bewertung der Stoffmengenverhältnisse;
- Quantifizierung des Peptidgehalts;
- Unterstützung der Identitätsbestätigung.
Die Methode hat Einschränkungen, da sich bestimmte Aminosäuren während der Hydrolyse verändern können.
Daher wird die Aminosäureanalyse vorzugsweise kombiniert mit:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- Peptid-Assay;
- Restfeuchteanalyse;
- Gegenionenanalyse.
Forschungsausschluss
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