Massenspektrometrie bei Peptiden erklärt

Massenspektrometrie bei Peptiden: Wie wird die molekulare Identität untersucht?

Bei der Qualitätskontrolle von Forschungspeptiden werden häufig mehrere Analysetechniken kombiniert. HPLC kann Informationen über die chromatografische Reinheit liefern, aber ein hoher Hauptpeak beweist nicht automatisch, dass das richtige Peptid vorhanden ist.

Um die molekulare Identität weiter zu untersuchen, wird häufig die Massenspektrometrie eingesetzt.

Massenspektrometrie, meist als MS abgekürzt, ist eine analytische Technik zur Messung des Masse-Ladungs-Verhältnisses ionisierter Moleküle. Bei der Peptidanalyse kann die gemessene Molekülmasse mit der theoretisch erwarteten Masse der Aminosäuresequenz verglichen werden.

Wenn diese Werte übereinstimmen, unterstützt dies die Identifizierung des untersuchten Peptids. Dennoch liefert auch die Massenspektrometrie allein kein vollständiges Bild der Qualität.

In diesem Blog erläutern wir, wie Massenspektrometrie funktioniert, warum Peptide mehrere Massensignale erzeugen können und wie MS-Ergebnisse gemeinsam mit HPLC und anderen Analysemethoden interpretiert werden.

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Was ist Massenspektrometrie?

Massenspektrometrie ist eine Analysetechnik, bei der Moleküle in geladene Teilchen, sogenannte Ionen, umgewandelt werden.

Diese Ionen werden anschließend anhand ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses getrennt und gemessen.

Dieses Verhältnis wird dargestellt als:

m/z

Dabei steht:

• m für Masse;
• z für elektrische Ladung.

Ein Massenspektrometer misst daher nicht immer direkt die vollständige Molekülmasse. Das Instrument misst das Verhältnis von Masse zu Ladung.

Bei größeren Molekülen, einschließlich vieler Peptide, können mehrere Ladungen entstehen. Dadurch kann dasselbe Peptid an verschiedenen Stellen im Massenspektrum sichtbar sein.

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Warum wird die Massenspektrometrie bei der Peptidanalyse eingesetzt?

Ein Peptid besteht aus einer spezifischen Abfolge von Aminosäuren.

Jede Aminosäurekombination hat eine theoretisch berechenbare Molekülmasse.

Mithilfe der Massenspektrometrie kann untersucht werden, ob die gemessene Masse mit diesem theoretischen Wert übereinstimmt.

Eine MS-Analyse kann beitragen zu:

• Bestätigung der molekularen Identität;
• Vergleich mit der theoretischen Molekülmasse;
• Nachweis bestimmter chemischer Modifikationen;
• Analyse von Abbauprodukten;
• Untersuchung von Peptidvarianten;
• Vergleich zwischen Produktionschargen.

Eine übereinstimmende Masse stützt die Identität eines Peptids.

Das Ergebnis muss jedoch immer gemeinsam mit der Analysemethode und anderen Qualitätsdaten bewertet werden.

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Wie hoch ist die theoretische Molekülmasse?

Die theoretische Molekülmasse wird auf Grundlage folgender Faktoren berechnet:

• die Aminosäuresequenz;
• die Anzahl der Aminosäuren;
• mögliche chemische Modifikationen;
• die Molekülform;
• spezifische Endgruppen.

Wenn Aminosäuren gemeinsam eine Peptidkette bilden, entstehen Peptidbindungen.

Bei der Bildung jeder Peptidbindung wird ein Wassermolekül abgespalten. Daher ist die Masse eines vollständigen Peptids nicht einfach die Summe aller einzelnen Aminosäuren.

Auch Modifikationen können die Masse beeinflussen.

Beispiele sind:

• Amidierung;
• Acetylierung;
• Phosphorylierung;
• Oxidation;
• Anlagerung von Fettsäureketten;
• Bildung von Disulfidbrücken.

Die theoretische Masse muss daher für die exakte Molekülstruktur berechnet werden.

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Was bedeutet Molekulargewicht?

Die Begriffe Molekülmasse und Molekulargewicht werden häufig synonym verwendet.

In Laborberichten wird der Wert normalerweise angegeben in:

• Dalton, abgekürzt Da;
• Kilodalton, abgekürzt kDa.

Ein Dalton entspricht ungefähr der Masse eines Wasserstoffatoms.

Ein Peptid mit einer Molekülmasse von 3.000 Da hat also eine Masse von ungefähr 3 kDa.

Die Molekülmasse von Peptiden kann sich je nach Folgendem stark unterscheiden:

• Kettenlänge;
• Aminosäurezusammensetzung;
• Chemische Modifikationen.

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Wie funktioniert ein Massenspektrometer?

Ein Massenspektrometer besteht normalerweise aus verschiedenen Komponenten.

1. Probeneinführung

Das Peptid wird zunächst vorbereitet und in das Instrument eingebracht.

Die Probenvorbereitung kann Einfluss haben auf:

• Signalstärke;
• Nachweisbarkeit;
• Ionenbildung;
• Hintergrundsignale.

2. Ionisation

Die Moleküle werden elektrisch geladen.

Häufig verwendete Techniken für die Peptidanalyse sind:

• Elektrospray-Ionisation;
• matrixunterstützte Laser-Desorption/Ionisation.

3. Massenanalyse

Die gebildeten Ionen werden anhand ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses getrennt.

4. Detektion

Der Detektor registriert die Ionen.

5. Datenverarbeitung

Die gemessenen Signale werden in ein Massenspektrum umgewandelt.

Dieses Spektrum enthält Peaks, die den detektierten Ionen entsprechen.

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Was ist Elektrospray-Ionisation?

Elektrospray-Ionisation, abgekürzt ESI, ist eine häufig verwendete Ionisationstechnik für Peptide.

Während der ESI wird eine flüssige Probe durch eine feine Öffnung geleitet, während eine elektrische Spannung angelegt wird.

Dadurch entstehen elektrisch geladene Tröpfchen.

Wenn das Lösungsmittel verdampft, bleiben geladene Moleküle zurück.

Ein wichtiges Merkmal der ESI ist, dass größere Moleküle mehrere elektrische Ladungen erhalten können.

Ein Peptid kann beispielsweise vorkommen als:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Dabei steht M für die Molekülmasse des Peptids.

Durch mehrere Ladungen entstehen verschiedene m/z-Signale für dasselbe Molekül.

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Warum hat ein Peptid mehrere Peaks?

Wenn ein Peptid mehrere Protonen aufnimmt, entstehen verschiedene Ladungsformen.

Angenommen, ein Peptid hat eine Molekülmasse von ungefähr 3.000 Da.

Mögliche Signale sind dann ungefähr:

• eine positive Ladung: m/z etwa 3.001;
• zwei positive Ladungen: m/z etwa 1.501;
• drei positive Ladungen: m/z etwa 1.001.

Diese Signale können alle zu demselben Peptid gehören.

Die Software kann diese Ladungsverteilung verwenden, um die ursprüngliche Molekülmasse zu berechnen.

Dieser Prozess wird als Dekonvolution bezeichnet.

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Was ist ein dekonvolutiertes Massenspektrum?

Eine rohe ESI-Messung kann mehrere Ladungspigmente enthalten.

Das kann die Interpretation komplex machen.

Mit Dekonvolutionssoftware werden die verschiedenen Ladungsformen in eine geschätzte Molekülmasse umgerechnet.

Das dekonvolutierte Spektrum kann dadurch einfacher verglichen werden mit:

• der theoretischen Masse;
• einem Referenzstandard;
• Produktspezifikationen.

Die Qualität der Berechnung hängt ab von:

• Signalstärke;
• Auflösung;
• Hintergrundrauschen;
• Softwareeinstellungen;
• Vorhandensein überlappender Komponenten.

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Was ist MALDI?

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, abgekürzt MALDI, ist eine weitere Ionisierungstechnik.

Das Peptid wird mit einem Matrixmaterial vermischt und auf eine Messplatte aufgetragen.

Ein Laser aktiviert die Matrix, wodurch Peptidionen entstehen.

MALDI erzeugt häufig hauptsächlich einfach geladene Ionen.

Dadurch kann das Spektrum einfacher erscheinen als ein ESI-Spektrum.

MALDI wird häufig mit einem Time-of-Flight-Massenanalysator kombiniert.

Diese Kombination wird bezeichnet als:

MALDI-TOF

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Was ist Time-of-Flight?

Bei einem Time-of-Flight-Massenanalysator werden Ionen durch ein elektrisches Feld beschleunigt.

Anschließend bewegen sie sich durch ein Messrohr.

Ionen mit einem niedrigeren Masse-Ladungs-Verhältnis erreichen den Detektor normalerweise schneller als Ionen mit einem höheren Verhältnis.

Die Flugzeit wird zur Berechnung des m/z-Werts verwendet.

TOF-Systeme können verwendet werden für:

• Peptididentifizierung;
• Massenbestimmung;
• Vergleich molekularer Varianten.

Die endgültige Genauigkeit hängt von der Kalibrierung, den Instrumenteneinstellungen und der Probenvorbereitung ab.

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Was ist LC-MS?

Flüssigchromatografie-Massenspektrometrie, abgekürzt LC-MS, kombiniert Flüssigchromatografie mit Massenspektrometrie.

Die Komponenten werden zunächst chromatografisch getrennt.

Anschließend werden die einzelnen Signale vom Massenspektrometer analysiert.

LC-MS kann Informationen kombinieren über:

• Retentionszeit;
• chromatografisches Profil;
• Molekülmasse;
• mögliche Verunreinigungen;
• Abbauprodukte.

Dadurch kann LC-MS mehr Einblicke liefern als eine separate HPLC- oder MS-Analyse.

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Was ist der Unterschied zwischen HPLC und Massenspektrometrie?

HPLC und Massenspektrometrie beantworten unterschiedliche analytische Fragen.

HPLC

HPLC kann Informationen liefern über:

• chromatografische Reinheit;
• relative Menge der detektierten Komponenten;
• Retentionszeiten;
• Veränderungen im chromatografischen Profil.

Massenspektrometrie

Die Massenspektrometrie kann Informationen liefern über:

• Molekülmasse;
• Mögliche Identität;
• Chemische Modifikationen;
• Bestimmte Abbauprodukte.

Ein vereinfachter Vergleich:

Daher werden beide Techniken häufig kombiniert.

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Kann bei verschiedenen Peptiden dieselbe Molekülmasse vorkommen?

Ja.

Verschiedene Aminosäuresequenzen können dieselbe oder nahezu dieselbe Gesamtmasse haben.

Diese werden manchmal isobare Strukturen genannt.

Eine übereinstimmende Masse beweist daher nicht immer, dass die vollständige Aminosäuresequenz korrekt ist.

Für eine umfassendere Identifizierung können zusätzliche Techniken erforderlich sein, wie zum Beispiel:

• Tandem-Massenspektrometrie;
• Fragmentierungsanalyse;
• Aminosäureanalyse;
• Sequenzanalyse;
• Vergleich mit einem Referenzstandard.

Die erforderliche Analysemethode hängt vom gewünschten Grad an Sicherheit ab.

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Was ist Tandem-Massenspektrometrie?

Tandem-Massenspektrometrie wird üblicherweise wie folgt abgekürzt:

MS/MS

Während der MS/MS wird ein ausgewähltes Peptidion weiter fragmentiert.

Die entstandenen Fragmente werden anschließend erneut gemessen.

Das Fragmentierungsmuster kann Informationen liefern über:

• Aminosäuresequenz;
• Position von Modifikationen;
• Peptididentität;
• Struktur von Abbauprodukten.

MS/MS kann dadurch mehr strukturelle Informationen liefern als nur die intakte Molekülmasse.

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Was sind Peptidfragmente?

Wenn eine Peptidkette während der MS/MS an bestimmten Stellen bricht, entstehen Fragmentionen.

Häufig verwendete Fragmenttypen sind:

• b-Ionen;
• y-Ionen.

Die Massen dieser Fragmente können verwendet werden, um Teile der Aminosäuresequenz zu rekonstruieren.

Die Interpretation kann komplex sein.

Nicht jedes Peptid fragmentiert auf die gleiche Weise.

Zu den möglichen Einflussfaktoren gehören:

• Aminosäurezusammensetzung;
• Elektrische Ladung;
• Peptidgröße;
• Fragmentierungsmethode;
• Chemische Modifikationen.

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Kann die Massenspektrometrie Oxidation detektieren?

Bestimmte oxidative Veränderungen verursachen eine messbare Massenänderung.

Die Addition eines Sauerstoffatoms führt beispielsweise häufig zu einer Massenzunahme von etwa 16 Da.

Dadurch kann die Massenspektrometrie dabei helfen, bestimmte Oxidationsprodukte zu identifizieren.

Die Detektion hängt ab von:

• Konzentration;
• Instrumentenauflösung;
• Analysemethode;
• Trennung von Komponenten.

Nicht jede oxidative Veränderung kann ausschließlich anhand eines einzigen Massensignals vollständig lokalisiert werden.

Dafür kann eine zusätzliche Fragmentierungsanalyse erforderlich sein.

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Kann die Massenspektrometrie die Peptidmenge bestimmen?

Nicht automatisch.

Die Intensität eines Massensignals wird beeinflusst durch:

• Ionisierungseffizienz;
• molekulare Eigenschaften;
• Lösungsmittel;
• Instrumenteneinstellungen;
• Vorhandensein anderer Komponenten.

Ein doppelt so starkes Signal bedeutet daher nicht automatisch, dass doppelt so viel Peptid vorhanden ist.

Für eine zuverlässige Quantifizierung sind validierte Methoden und geeignete Standards erforderlich.

Mögliche Techniken sind:

• quantitative LC-MS;
• interne Standards;
• isotopenmarkierte Referenzen;
• kalibrierte HPLC-Assays.

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Kann Massenspektrometrie Sterilität nachweisen?

Nein.

Massenspektrometrie zur Identitätsprüfung von Peptiden ist kein Sterilitätstest.

Das Ergebnis liefert keine direkten Informationen über:

• Bakterien;
• Pilze;
• mikrobielles Wachstum;
• Sterilität des Produkts.

Die Sterilität erfordert spezifische mikrobiologische Testmethoden.

Auch Endotoxine werden während einer standardmäßigen Peptid-MS-Analyse nicht automatisch bestimmt.

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Kann Massenspektrometrie Endotoxine messen?

Nicht durch eine standardmäßige Identitätsanalyse.

Endotoxine sind komplexe bakterielle Bestandteile.

Für die Endotoxinprüfung werden spezifische Methoden verwendet, wie zum Beispiel:

• Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test;
• rekombinante Faktor-C-Methoden.

Ein korrektes Massenspektrum eines Peptids beweist daher nicht, dass das Material einen niedrigen Endotoxingehalt aufweist.

Identität, Reinheit, Sterilität und Endotoxine sind separate Qualitätsparameter.

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Warum können sich Laborergebnisse unterscheiden?

Verschiedene Labore können leicht abweichende Massenwerte berichten.

Mögliche Ursachen sind:

• Instrumententyp;
• Kalibrierung;
• Ionisierungsmethode;
• Probenvorbereitung;
• Salzaddukte;
• verwendete Software;
• Auflösung;
• Interpretationsmethode.

Kleine Unterschiede bedeuten nicht automatisch, dass ein Ergebnis falsch ist.

Der gemessene Wert muss im folgenden Rahmen bewertet werden:

• Instrumentengenauigkeit;
• erwartete Molekülform;
• verwendete Analysemethode.

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Was sind Addukte?

Während der Massenspektrometrie können sich Peptidionen mit anderen geladenen Teilchen verbinden.

Beispiele sind:

• Natrium;
• Kalium;
• Ammonium.

Dadurch können zusätzliche Peaks entstehen.

Ein Natriumaddukt hat beispielsweise eine andere Masse als ein einfach protoniertes Peptidion.

Addukte bedeuten nicht automatisch, dass ein anderes Peptid vorhanden ist.

Die Interpretation erfordert Kenntnisse über:

• Probenvorbereitung;
• verwendete Puffer;
• erwartete Ionenformen.

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Welche Informationen gehören in einen MS-Bericht?

Ein professioneller Analysebericht kann unter anderem Folgendes enthalten:

• Name des Peptids;
• Chargen- oder Losnummer;
• theoretische Molekülmasse;
• gemessene Molekülmasse;
• Ionisierungsmethode;
• Typ des Massenspektrometers;
• Massenspektrum;
• Analysedatum;
• Name des Labors.

Bei einer umfassenderen Analyse können auch folgende Angaben enthalten sein:

• Messbereich;
• Auflösung;
• Massengenauigkeit;
• Fragmentierungsdaten;
• verwendete Software.

De benodigde rapportage hangt af van het onderzoeksdoel.

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Der erforderliche Berichtsumfang hängt vom Forschungsziel ab.

Massenspektrometrie und Chargenkontrolle

Jede Produktionscharge kann einzeln untersucht werden.

• Die chargenspezifische MS-Analyse unterstützt:
• Identitätskontrolle;
• Vergleich zwischen Chargen;
• Rückverfolgbarkeit;

Untersuchung von Abweichungen.

Die Chargennummer auf dem Analysebericht muss mit der Kennzeichnung auf dem Vial übereinstimmen.

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Ein massenspektrometrisches Ergebnis ohne eindeutige Chargenzuordnung hat einen geringeren Wert für die Rückverfolgbarkeit.

Wissenschaftliche Einschränkungen

Massenspektrometrie ist eine leistungsfähige Analysetechnik, aber keine vollständige Qualitätsbewertung.

• Eine übereinstimmende Molekülmasse beweist nicht automatisch:
• vollständige Aminosäuresequenz;
• hohe chromatografische Reinheit;
• Sterilität;
• richtige Peptidmenge;
• niedriger Endotoxingehalt;
• biologische Aktivität;

Langzeitstabilität.

• Für eine umfassendere Bewertung können mehrere Methoden erforderlich sein:
• LC-MS;
• HPLC;
• MS/MS;
• quantitativer Assay;
• Feuchtigkeitsanalyse;
• zusätzliche produktspezifische Tests.

Die Ergebnisse müssen gemeinsam interpretiert werden.

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Zusammenfassung

Massenspektrometrie wird eingesetzt, um die Molekülmasse von Forschungspeptiden zu untersuchen.

Die Technik misst das Masse-Ladungs-Verhältnis ionisierter Moleküle.

Bei der Peptidanalyse kann die gemessene Masse mit der theoretisch erwarteten Masse verglichen werden.

Eine Übereinstimmung unterstützt die molekulare Identifizierung.

Wichtige Analysetechniken sind:

• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;
• MS/MS.

Massenspektrometrie liefert jedoch nicht automatisch Informationen über:

• exakte Menge;
• chromatografische Reinheit;
• Sterilität;
• Endotoxine;
• biologische Aktivität.

Daher wird MS häufig mit HPLC und zusätzlichen Qualitätsanalysen kombiniert.

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Forschungshinweis

Die Forschungspeptide von Peptidera werden ausschließlich für Research Use Only (RUO) angeboten und sind für Laborforschung und analytische Anwendungen bestimmt.

Nicht für den menschlichen oder tierischen Verzehr, diagnostische Verwendung, therapeutische Anwendung oder Selbstverabreichung bestimmt.

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Kategorie:
Peptidwissen & Qualitätskontrolle

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• Link zur Sammlung von Forschungspeptiden
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