Peptidreinheit: Was bedeutet 99 % HPLC?
Peptidreinheit erklärt: Was sagt ein HPLC-Prozentsatz tatsächlich aus?
Bei Forschungspeptiden wird häufig ein Reinheitsprozentsatz angegeben. Werte wie 98 %, 99 % oder 99,5 % Reinheit werden regelmäßig verwendet, um die Qualität eines Peptids zu beschreiben.
Ein hoher Prozentsatz scheint einfach zu interpretieren zu sein: Je höher die Zahl, desto besser das Produkt. In der Praxis ist die Peptidreinheit jedoch komplexer.
Ein HPLC-Ergebnis liefert Informationen über die relative Zusammensetzung einer analysierten Probe. Der Prozentsatz beweist jedoch nicht automatisch:
- dass das richtige Peptid vorhanden ist;
- dass die Aminosäuresequenz vollständig korrekt ist;
- dass die angegebene Peptidmenge im Vial stimmt;
- dass das Material steril ist;
- dass es frei von Endotoxinen ist;
- dass alle möglichen Verunreinigungen gemessen wurden.
Um die Peptidqualität sorgfältig zu beurteilen, müssen mehrere analytische Daten gemeinsam betrachtet werden.
In diesem Blog erläutern wir, wie die Peptidreinheit gemessen wird, was ein HPLC-Prozentsatz bedeutet und warum Reinheit nur einen Teil der vollständigen Qualitätskontrolle darstellt.
Was bedeutet Peptidreinheit?
Die Peptidreinheit beschreibt, welcher Anteil der nachgewiesenen peptidbezogenen Komponenten mit der Hauptkomponente in der analysierten Probe übereinstimmt.
Wenn ein Analysezertifikat beispielsweise eine HPLC-Reinheit von 99% Wenn ein Analysezertifikat beispielsweise eine HPLC-Reinheit von angibt, bedeutet dies in der Regel, dass etwa 99 % des integrierten chromatografischen Signals dem Hauptpeak zugeordnet wurden.
Das bedeutet nicht automatisch, dass 99 % des Gesamtgewichts im Vial aus dem gewünschten Peptid bestehen.
Ein Vial kann neben dem Peptid auch andere Komponenten enthalten, wie zum Beispiel:
- Wasser;
- Gegenionen;
- Salze;
- Hilfsstoffe;
- Produktionsrückstände;
- nicht nachweisbare Komponenten.
Der HPLC-Prozentsatz und die tatsächliche Peptidmenge sind daher unterschiedliche Qualitätsparameter.
Was ist HPLC?
HPLC steht für High-Performance Liquid Chromatography.
Dabei handelt es sich um eine analytische Technik, mit der verschiedene chemische Komponenten in einer Probe voneinander getrennt werden können.
Bei einer HPLC-Analyse wird eine gelöste Probe durch eine Säule geleitet. Diese Säule enthält eine stationäre Phase.
Die Flüssigkeit, die durch die Säule strömt, wird als mobile Phase bezeichnet.
Die verschiedenen Moleküle reagieren nicht alle auf die gleiche Weise mit diesen Phasen. Dadurch bewegen sich einige Komponenten schneller durch die Säule als andere.
Das Ergebnis wird in einem Chromatogramm dargestellt.
Ein Chromatogramm besteht meist aus:
- eine horizontale Zeitachse;
- eine vertikale Signalachse;
- Eén of meerdere pieken.
Iedere piek vertegenwoordigt een gedetecteerde component of groep componenten.
Wat is een retentietijd?
De tijd die een component nodig heeft om door de HPLC-kolom te bewegen en de detector te bereiken, wordt de retentietijd genoemd.
De retentietijd kan worden beïnvloed door:
- Type HPLC-kolom;
- Samenstelling van de mobiele fase;
- Temperatur;
- Stroomsnelheid;
- Eigenschappen van het peptide;
- Gebruikte analysemethode.
Een overeenkomstige retentietijd kan helpen bij de vergelijking met een referentiestandaard.
Een retentietijd alleen is echter meestal onvoldoende om de identiteit van een peptide definitief te bevestigen.
Verschillende moleculen kunnen onder bepaalde omstandigheden vergelijkbare retentietijden hebben.
Daarom wordt HPLC vaak gecombineerd met massaspectrometrie.
Hoe wordt het zuiverheidspercentage berekend?
Bij veel HPLC-analyses wordt het oppervlak onder iedere chromatografische piek berekend.
Dit wordt peak-area integration genoemd.
Een vereenvoudigd voorbeeld:
- Hoofdpiek: 99%;
- Nevenpiek A: 0,5%;
- Nevenpiek B: 0,3%;
- Overige gedetecteerde pieken: 0,2%.
De gerapporteerde chromatografische zuiverheid is dan ongeveer 99%.
Deze berekening is afhankelijk van:
- Detectiemethode;
- Integratie-instellingen;
- Gekozen golflengte;
- Analysemethode;
- Nachweisgrenze;
- Monsterconcentratie.
Een zuiverheidspercentage moet daarom altijd in de context van de gebruikte methode worden geïnterpreteerd.
Wat betekent een hoofdpiek?
De grootste piek in een chromatogram wordt vaak de hoofdpiek genoemd.
Bij een goed gekarakteriseerd peptide wordt verwacht dat deze piek overeenkomt met het gewenste peptide.
Dat moet echter analytisch worden bevestigd.
Een grote piek bewijst op zichzelf niet dat de juiste moleculaire structuur aanwezig is.
Om de identiteit te ondersteunen, kunnen aanvullende technieken worden gebruikt, zoals:
- Massenspektrometrie;
- Aminosäureanalyse;
- Sequentieanalyse;
- Kernspinresonantie;
- Vergelijking met een referentiestandaard.
HPLC beschrijft voornamelijk de chromatografische samenstelling van het monster.
Welke onzuiverheden kunnen tijdens peptidesynthese ontstaan?
Veel synthetische peptiden worden geproduceerd via solid-phase peptide synthesis, meestal afgekort tot SPPS.
Tijdens dit proces worden aminozuren stapsgewijs aan een groeiende peptideketen gekoppeld.
Bij iedere stap kunnen kleine procesafwijkingen ontstaan.
Mogelijke peptidegerelateerde onzuiverheden zijn:
Verkorte peptideketens
Wanneer een aminozuur niet correct wordt gekoppeld, kan een onvolledige peptideketen ontstaan.
Dit wordt ook wel een truncatieproduct genoemd.
Deletiesequenties
Bei einer Deletionssequenz fehlen ein oder mehrere Aminosäuren in der vorgesehenen Kette.
Dadurch unterscheidet sich die Molekülmasse vom gewünschten Peptid.
Chemisch modifizierte Varianten
Während der Herstellung, Reinigung oder Lagerung können chemische Veränderungen auftreten.
Beispiele sind:
- Oxidation;
- Deamidierung;
- Hydrolyse;
- Isomerisierung.
Rückstände von Schutzgruppen
Während der Peptidsynthese werden temporäre Schutzgruppen verwendet, um unerwünschte Reaktionen zu verhindern.
Diese müssen später entfernt werden.
Eine unvollständige Entfernung kann zu Nebenkomponenten beitragen.
Aggregate
Peptidmoleküle können unter bestimmten Bedingungen größere Strukturen bilden.
Nicht jede HPLC-Methode detektiert oder charakterisiert Aggregate auf dieselbe Weise.
Ist eine HPLC-Reinheit von 99 % dasselbe wie ein Peptidgehalt von 99 %?
Nein.
Dies ist ein wichtiger Unterschied.
HPLC-Reinheit beschreibt in der Regel das relative Verhältnis der detektierten chromatografischen Komponenten.
Peptidgehalt beschreibt, wie viel tatsächliches Peptid im Verhältnis zum Gesamtmaterial vorhanden ist.
Eine gefriergetrocknete Durchstechflasche kann beispielsweise Folgendes enthalten:
- das gewünschte Peptid;
- Wasser;
- Gegenionen;
- Salze;
- Hilfsstoffe.
Diese Komponenten werden bei einer standardmäßigen HPLC-Analyse nicht unbedingt alle auf dieselbe Weise gemessen.
Daher kann eine Probe eine hohe chromatografische Reinheit aufweisen, während der Gesamtpeptidgehalt unter dem HPLC-Prozentsatz liegt.
Für die quantitative Bestimmung sind zusätzliche Analysemethoden erforderlich.
Was ist eine Peptid-Assay?
Eine Assay wird verwendet, um die Menge oder Konzentration einer bestimmten Komponente zu bestimmen.
Je nach Untersuchungsziel können verschiedene Methoden eingesetzt werden.
Beispiele sind:
- quantitative HPLC mit Referenzstandard;
- Aminosäureanalyse;
- Stickstoffanalyse;
- spektroskopische Techniken;
- Massenbilanzberechnungen.
Eine Assay beantwortet eine andere Frage als eine standardmäßige Reinheitsanalyse.
Eine Reinheitsanalyse erfordert:
Welcher Anteil der detektierten Peptidkomponenten gehört zum Hauptpeak?
Eine quantitative Assay erfordert:
Wie viel des gewünschten Peptids ist tatsächlich vorhanden?
Beide Daten können für eine umfassende Qualitätscharakterisierung relevant sein.
Warum ist Massenspektrometrie wichtig?
Massenspektrometrie, oft als MS abgekürzt, misst das Masse-Ladungs-Verhältnis ionisierter Moleküle.
Bei der Peptidanalyse kann untersucht werden, ob die gemessene Molekülmasse mit der theoretisch erwarteten Masse übereinstimmt.
Massenspektrometrie kann Folgendes leisten:
- Identitätsbestätigung;
- Nachweis bestimmter Modifikationen;
- Analyse von Abbauprodukten;
- Vergleich von Peptidvarianten.
Wenn die gemessene Masse mit der erwarteten Masse übereinstimmt, unterstützt dies die Identifizierung.
Dennoch liefert die Massenspektrometrie nicht automatisch vollständige Informationen über:
- Reinheitsanteil;
- exakte Menge;
- Sterilität;
- Endotoxine;
- biologische Aktivität.
Daher ergänzen sich HPLC und Massenspektrometrie.
Was ist LC-MS?
LC-MS kombiniert Flüssigkeitschromatografie mit Massenspektrometrie.
Zunächst werden die Komponenten chromatografisch getrennt. Anschließend werden die einzelnen Signale mittels Massenspektrometrie weiter untersucht.
Diese Kombination kann Informationen liefern über:
- Retentionszeit;
- Molekülmasse;
- mögliche Verunreinigungen;
- Abbauprodukte;
- chemische Modifikationen.
LC-MS kann dadurch mehr analytische Informationen liefern als eine einzelne Technik.
Die Qualität der Ergebnisse bleibt abhängig von:
- Probenvorbereitung;
- Instrumenteneinstellungen;
- Methodenvalidierung;
- Referenzmaterialien;
- fachkundige Interpretation.
Warum können verschiedene Labore unterschiedliche Ergebnisse messen?
Dasselbe Peptid kann in verschiedenen Laboren leicht abweichende Ergebnisse liefern.
Mögliche Ursachen sind:
- unterschiedliche HPLC-Säulen;
- andere mobile Phasen;
- abweichende Gradienten;
- andere Detektionswellenlängen;
- Unterschiede bei der Probenvorbereitung;
- andere Integrationseinstellungen;
- Instrumentenvariation.
Ein Unterschied bedeutet nicht automatisch, dass eine der Analysen falsch ist.
Um Ergebnisse gut vergleichen zu können, muss auch die Analysemethode betrachtet werden.
Ein Prozentsatz ohne Informationen über die Methode bietet nur einen begrenzten Kontext.
Was ist Methodenvalidierung?
Eine analytische Methode muss nachweislich für den vorgesehenen Zweck geeignet sein.
Dies wird als Methodenvalidierung bezeichnet.
Mögliche Validierungsmerkmale sind:
- Spezifität;
- Richtigkeit;
- Präzision;
- Linearität;
- Messbereich;
- Nachweisgrenze;
- Bestimmungsgrenze;
- Robustheit.
Eine Methode zur Identitätsprüfung ist nicht automatisch für eine genaue Quantifizierung geeignet.
Daher muss im Voraus klar sein, welche analytische Fragestellung untersucht wird.
Was ist die Nachweisgrenze?
Jede Analysemethode hat eine Grenze, unterhalb derer eine Komponente nicht zuverlässig detektiert werden kann.
Dies wird als Nachweisgrenze bezeichnet.
Eine Komponente, die in einem Chromatogramm nicht sichtbar ist, ist daher nicht automatisch vollständig abwesend.
Die Konzentration kann unterhalb der Nachweisgrenze liegen.
Darüber hinaus können bestimmte Stoffe:
- nicht auf den verwendeten Detektor reagieren;
- außerhalb des Messbereichs liegen;
- während der Probenvorbereitung verloren gehen;
- nicht ausreichend getrennt werden.
Die Aussage „nicht detektiert“ ist daher nicht immer dasselbe wie „nicht vorhanden“.
Kann ein Chromatogramm manipuliert werden?
Ein Chromatogramm muss genügend Informationen enthalten, um professionell bewertet werden zu können.
Wichtige Angaben sind:
- Produktname;
- Chargennummer;
- Analysedatum;
- verwendete Methode;
- Detektoreinstellungen;
- Retentionszeiten;
- Peakintegration;
- Labordaten.
Allein ein Bild mit einem großen Peak und einer Prozentangabe bietet nur eine eingeschränkte Überprüfbarkeit.
Auch Integrationseinstellungen können beeinflussen, welche Signale in die Berechnung einbezogen werden.
Eine transparente Berichterstattung ist daher wichtig.
Welche Informationen gehören auf ein zuverlässiges COA?
Ein Analysezertifikat kann unter anderem Folgendes enthalten:
- Name des Peptids;
- Aminosäuresequenz;
- Chargen- oder Losnummer;
- Herstellungsdatum;
- Testdatum;
- HPLC-Ergebnis;
- Chromatogramm;
- massenspektrometrisches Ergebnis;
- theoretische Molekülmasse;
- gemessene Molekülmasse;
- verwendete Analysemethoden;
- Name des Labors.
Nicht jedes COA enthält alle Bestandteile.
Welche Informationen benötigt werden, hängt vom Produkt und Forschungsziel ab.
Ein umfassendes COA kann für mehr Transparenz sorgen, doch die Zuverlässigkeit hängt auch von der Qualität der Analyse ab.
Ist eine hohe Reinheit immer erforderlich?
Die gewünschte Reinheit hängt vom Forschungsziel ab.
Bei einigen analytischen Anwendungen können sehr geringe Mengen an Nebenkomponenten Einfluss haben auf:
- Messergebnisse;
- Rezeptorforschung;
- Zellforschung;
- Reproduzierbarkeit.
Ein höheres Reinheitsniveau kann dann wünschenswert sein.
Ein höherer Prozentsatz bedeutet jedoch nicht automatisch, dass alle anderen Qualitätsmerkmale besser sind.
Ein Peptid mit einer HPLC-Reinheit von 99,5 % kann beispielsweise dennoch:
- eine abweichende Menge enthalten;
- falsch gelagert worden sein;
- nicht ausreichend identifiziert sein;
- einen erhöhten Restfeuchtegehalt aufweisen;
- eine beschädigte Verpackung aufweisen.
Die Qualität muss daher multidimensional bewertet werden.
Reinheit und Chargenunterschiede
Jede Produktionscharge hat ihren eigenen Produktions- und Analyseprozess.
Daher können sich die Reinheitsergebnisse zwischen Chargen unterscheiden.
Eine Analyse einer einzelnen Charge darf nicht automatisch als Beleg für alle zukünftigen Chargen verwendet werden.
Die chargenspezifische Analyse unterstützt:
- Rückverfolgbarkeit;
- Vergleich;
- Qualitätskontrolle;
- Untersuchung von Abweichungen.
Die Chargennummer auf dem Vial muss daher mit der Nummer auf dem Analysezertifikat übereinstimmen.
Reinheit und Stabilität
Eine hohe anfängliche Reinheit garantiert nicht, dass diese während einer langfristigen Lagerung erhalten bleibt.
Mögliche Abbauprozesse sind:
- Oxidation;
- Hydrolyse;
- Deamidierung;
- Aggregation.
Die Geschwindigkeit wird beeinflusst durch:
- Temperatur;
- Feuchtigkeit;
- Licht;
- Sauerstoff;
- Aminosäuresequenz;
- Verpackung.
Stabilitätsuntersuchungen können verwendet werden, um Veränderungen im chromatografischen Profil im Laufe der Zeit zu verfolgen.
Wissenschaftliche Einschränkungen
Keine einzelne Analysemethode vermittelt eigenständig ein vollständiges Bild der Peptidqualität.
HPLC kann wichtige Informationen über die chromatografische Reinheit liefern, hat aber Einschränkungen.
Ein HPLC-Prozentwert beweist nicht automatisch:
- Identität;
- exakte Peptidmenge;
- Aminosäuresequenz;
- Sterilität;
- Endotoxingehalt;
- biologische Aktivität;
- Langzeitstabilität.
Daher werden mehrere Analysemethoden kombiniert.
Eine vollständige Qualitätsbewertung kann Folgendes umfassen:
- HPLC;
- Massenspektrometrie;
- quantitative Bestimmung;
- Feuchtigkeitsanalyse;
- Stabilitätsuntersuchung;
- zusätzliche produktspezifische Tests.
Zusammenfassung
Die Peptidreinheit ist ein wichtiger Qualitätsparameter, aber ein HPLC-Prozentwert muss korrekt interpretiert werden.
Ein Wert von 99 % bedeutet in der Regel, dass etwa 99 % des integrierten chromatografischen Signals dem Hauptpeak zugeordnet wurden.
Das bedeutet nicht automatisch, dass:
- 99 % des Fläschchengewichts aus Peptid bestehen;
- die Identität vollständig bestätigt ist;
- die angegebene Menge korrekt ist;
- das Material steril ist;
- alle möglichen Verunreinigungen ausgeschlossen sind.
Für eine umfassendere Qualitätsbewertung müssen HPLC-Ergebnisse mit anderen Daten kombiniert werden, wie zum Beispiel:
- Massenspektrometrie;
- Chargeninformationen;
- quantitative Analyse;
- Lagerdaten;
- Stabilitätsuntersuchung.
Peptidqualität besteht daher aus mehr als nur einem Prozentwert.
Forschungshinweis
Die Forschungspeptide von Peptidera werden ausschließlich für Research Use Only (RUO) angeboten und sind für Laborforschung und analytische Anwendungen bestimmt.
Nicht für den menschlichen oder tierischen Verzehr, diagnostische Verwendung, therapeutische Anwendung oder Selbstverabreichung bestimmt.
Kategorie:
Peptidwissen & Qualitätskontrolle
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