Aminosav-analízis peptideknél magyarázattal
A peptidek aminosav-analízise: az összetétel és a mennyiségi meghatározás magyarázata
A peptidek aminosavláncokból állnak. Ezen aminosavak sorrendje nagymértékben meghatározza a peptid kémiai és szerkezeti tulajdonságait.
A minőségvizsgálat során gyakran alkalmaznak olyan technikákat, mint a HPLC és a tömegspektrometria, a tisztaság és a molekulatömeg értékelésére. Egy kiegészítő analitikai módszer az aminosav-analízis, amelyet gyakran AAA rövidítéssel jelölnek.
Az aminosav-analízis a következők vizsgálatára használható:
- mely aminosavak vannak jelen egy mintában;
- hogyan felelnek meg a mért aminosavarányok a várt összetételnek;
- mennyi peptid van jelen;
- hogy az aminosav-összetétel megfelel-e az elméleti peptidnek;
- hogyan számítható ki a nettó peptidtartalom.
A módszer eltér a HPLC-től és a tömegspektrometriától. A klasszikus aminosav-analízis során a peptidláncot először egyes aminosavakra bontják. Ezt követően ezeket az aminosavakat elválasztják, kimutatják és mennyiségileg meghatározzák.
Az aminosav-analízis értékes információkat nyújthat, de korlátai is vannak. A lebontás során egyes aminosavak részben megváltozhatnak vagy elveszhetnek. Ezért az eredményeket mindig az alkalmazott módszer összefüggésében kell értelmezni.
Mi az aminosav-analízis?
Az aminosav-analízis olyan laboratóriumi technika, amellyel egy minta aminosav-összetételét vizsgálják.
A klasszikus analízis során általában a következő lépéseket végzik el:
- a minta előkészítése;
- a peptidlánc hidrolízise;
- az egyes aminosavak felszabadítása;
- az aminosavak elválasztása;
- kimutatás és mennyiségi meghatározás;
- összehasonlítás a várt összetétellel.
Az eredmény a következőképpen adható meg:
- aminosavankénti mennyiség;
- mólárány;
- tömegkoncentráció;
- aminosavprofil;
- kiszámított peptidtartalom.
Mi a hidrolízis?
A hidrolízis olyan kémiai folyamat, amelyben a kötések víz segítségével hasadnak fel.
Az aminosav-analízis során a peptidkötéseket felbontják, így egyes aminosavak szabadulnak fel.
Az egyik gyakran alkalmazott módszer a savas hidrolízis.
Ennek során a mintát meghatározott ideig a következőknek teszik ki:
- erős sav;
- megemelt hőmérséklet;
- szabályozott körülmények.
Hidrolízis után az eredeti peptidlánc már nem létezik ép molekulaként.
A felszabaduló aminosavak ezt követően külön-külön vizsgálhatók.
Miért bontják le a peptidláncot?
Egy ép peptid több tucat különböző aminosavmaradékot tartalmazhat.
Door de keten af te breken, kan de totale hoeveelheid van ieder aminozuur worden gemeten.
Stel dat een theoretisch peptide bevat:
- vier alanineresiduen;
- twee glycineresiduen;
- drie leucineresiduen;
- één tyrosineresidu.
Na hydrolyse kan worden onderzocht of de gemeten verhoudingen ongeveer overeenkomen met deze theoretische samenstelling.
Dit ondersteunt de beoordeling van de aminozuursamenstelling.
Wat is het verschil tussen aminozuursamenstelling en aminozuurvolgorde?
Aminozuuranalyse meet vooral welke aminozuren aanwezig zijn en in welke hoeveelheid.
De methode bepaalt niet automatisch de exacte volgorde.
Twee verschillende peptiden kunnen dezelfde aminozuursamenstelling hebben, maar een andere volgorde.
Bijvoorbeeld:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Beide bevatten:
- één alanine;
- egy glicin;
- één leucine.
Toch is de sequentie verschillend.
Voor sequentieonderzoek zijn andere technieken nodig, zoals:
- tandem-massaspectrometrie;
- fragmentanalyse;
- specifieke sequencingmethoden.
Kan aminozuuranalyse de identiteit bevestigen?
Aminozuuranalyse kan de verwachte samenstelling ondersteunen.
Wanneer het gemeten aminozuurprofiel sterk afwijkt van de theoretische samenstelling, kan dit aanleiding zijn voor aanvullend onderzoek.
Een overeenkomend profiel bewijst echter niet zelfstandig dat de exacte aminozuurvolgorde correct is.
Voor een bredere identiteitsbeoordeling kunnen worden gecombineerd:
- molekulatömeg;
- LC-MS;
- MS/MS;
- aminozuuranalyse;
- chromatografische gegevens.
Hoe worden aminozuren gescheiden?
Na hydrolyse bevat het monster een mengsel van vrije aminozuren.
Deze moeten analytisch van elkaar worden gescheiden.
Mogelijke technieken zijn:
- ionenwisselingschromatografie;
- HPLC;
- UPLC;
- capillaire elektroforese.
De gekozen techniek hangt af van:
- gewenste gevoeligheid;
- laboratoriummethode;
- monstertype;
- benodigde nauwkeurigheid.
Wat is derivatisering?
Veel aminozuren hebben zonder aanvullende behandeling een beperkte detecteerbaarheid.
Daarom kunnen zij chemisch worden gekoppeld aan een detecteerbare groep.
Dit wordt derivatisering genoemd.
Derivatisering kan plaatsvinden:
- vóór chromatografische scheiding;
- na chromatografische scheiding.
De gevormde derivaten kunnen beter worden gemeten met bijvoorbeeld:
- UV-detectie;
- fluorescentiedetectie;
- massaspectrometrie.
Prekolomderivatisering
Bij prekolomderivatisering worden aminozuren vóór de chromatografische scheiding gelabeld.
Daarna worden de gevormde derivaten via een kolom gescheiden.
Mogelijke voordelen zijn:
- hoge gevoeligheid;
- geschikte fluorescentiedetectie;
- meerdere aminozuren analyseren.
A reakciónak reprodukálható módon kell lejátszódnia.
A tökéletlen derivatizálás befolyásolhatja a mennyiségi meghatározást.
Oszlop utáni derivatizálás
Az oszlop utáni derivatizálás során az aminosavakat először elválasztják.
Az oszlop után detektáló reagenssel reagálnak.
Jól ismert példa a ninhidrines analízis.
A keletkezett reakciótermékek ezt követően optikailag mérhetők.
Hogyan határozzák meg az aminosav mennyiségét?
A mennyiségi meghatározáshoz referencia-standardokat használnak.
A standardoldatok ismert mennyiségű aminosavakat tartalmaznak.
Ezeket annak megállapítására mérik, hogy milyen kapcsolat áll fenn az alábbiak között:
- koncentráció;
- detektorból származó jel.
Ezután megmérik az ismeretlen mintát.
A kalibrációs adatok segítségével kiszámítható az egyes aminosavak mennyisége.
Mi a belső standard?
A belső standard olyan ismert anyag, amelyet a mintákhoz és a kalibráló oldatokhoz adnak.
Ez segíthet korrigálni az alábbiak során fellépő ingadozásokat:
- minta-előkészítés;
- injektálás;
- derivatizálás;
- analízis.
A belső standardnak analitikailag jól megkülönböztethetőnek kell lennie a vizsgált aminosavaktól.
Hogyan határozható meg a peptidtartalom aminosav-analízissel?
Ha egy peptid aminosav-összetétele ismert, kiválasztott aminosavak felhasználhatók a peptid mennyiségének kiszámítására.
Tegyük fel, hogy minden peptidlánc pontosan négy alaninreziduumot tartalmaz.
Ha megmérik az alanin teljes mennyiségét, abból megbecsülhető, hány peptidlánc volt jelen.
A számítás figyelembe veszi:
- a peptidenkénti reziduumok száma;
- molekulatömeg;
- a mért aminosav mennyisége;
- analitikai módszer.
Ez mennyiségi peptidassay-hez használható.
Miért nem használnak mindig minden aminosavat?
Nem minden aminosav egyformán alkalmas a mennyiségi meghatározásra.
Egyes aminosavak hidrolízis során:
- részlegesen lebomlanak;
- kémiailag megváltoznak;
- nem szabadulnak fel teljesen;
- nehezen mérhetők megbízhatóan.
Ezért gyakran stabil aminosavakat választanak.
A választás a peptidszekvenciától és az analitikai módszertől függ.
Mely aminosavak változhatnak meg hidrolízis során?
A savas hidrolízisnek különböző hatásai lehetnek.
Triptofán
A triptofán standard savas hidrolízis során nagyrészt lebomolhat.
Ezért módosított módszerekre van szükség, amikor a triptofánt specifikusan kell mérni.
Aszparagin
Az aszparagin hidrolízis során aszpartáttá alakulhat.
Ezért az aszparagin és az aszpartát klasszikus analízis során nem mindig kerül külön jelentésre.
Glutamin
A glutamin glutamáttá alakulhat.
Ezáltal a glutamin és a glutamát együttesen jeleníthető meg.
Szerin
A szerin hosszú ideig tartó hidrolízis során részben elveszhet.
Treonin
A treonin is részlegesen lebomolhat.
Cisztein
A cisztein oxidatív változásokon mehet keresztül.
A megbízható analízishez előzetes oxidációra vagy módosított módszerre lehet szükség.
Miért fontos a hidrolízis ideje?
A peptidkötéseket megfelelő mértékben le kell bontani.
A túl rövid hidrolízis a következőkhöz vezethet:
- nem teljes lebontás;
- túl alacsony mért aminosavértékek.
A túl hosszú hidrolízis a következőkhöz vezethet:
- érzékeny aminosavak további lebomlása;
- mérési veszteség.
Ezért a hidrolízis idejét és hőmérsékletét ellenőrzik.
Néha több hidrolízisidőt alkalmaznak a veszteség vagy a nem teljes lebontás vizsgálatára.
Mi a mólarány?
A mólarány az aminosavak relatív számát írja le.
Tegyük fel, hogy egy peptid elméletileg a következőket tartalmazza:
- két alanin;
- egy glicin;
- három leucin.
Az elméleti mólarány:
2 : 1 : 3
Az analízis után a mért értékek normalizálhatók.
Ha az arány közel van az elméleti értékhez, ez alátámasztja a várt aminosav-összetételt.
Kisebb eltérések a következők miatt alakulhatnak ki:
- mérési bizonytalanság;
- hidrolízis miatti veszteség;
- derivatizálás;
- kromatográfiás csúcsok integrálása.
Mit jelent a normalizálás?
Normalizáláskor a mért aminosavértékeket relatív arányokká számítják át.
Egy megfelelő aminosav referenciaként használható.
Ez lehetővé teszi a mért profil összehasonlítását az elméleti összetétellel.
A normalizálás hasznos az összetétel vizsgálatához, de nem adja meg automatikusan a peptid abszolút mennyiségét.
Aminosav-analízis kontra HPLC-tisztaság
A HPLC-tisztaság és az aminosav-analízis különböző tulajdonságokat mér.
A HPLC-tisztaság általában az alábbiakat vizsgálja:
- kromatográfiás főcsúcs;
- a mellékcsúcsok relatív mennyisége.
Az aminosav-analízis az alábbiakat vizsgálja:
- aminosav-összetétel;
- a kiválasztott aminosavak mennyisége;
- lehetséges peptidkvantifikálás.
A nagy HPLC-tisztaság nem bizonyítja automatikusan, hogy az aminosav-összetétel helyes.
A megfelelő aminosav-összetétel nem bizonyítja automatikusan, hogy nincsenek peptidhez kapcsolódó szennyeződések.
A technikák kiegészítik egymást.
Aminosav-analízis kontra tömegspektrometria
A tömegspektrometria a molekulák tömeg/töltés arányát vizsgálja.
Az intakt tömegmérés alátámaszthatja, hogy a molekulatömeg megfelel az elméleti értéknek.
Az aminosav-analízis a lebontás után vizsgálja az aminosavak mennyiségét és arányát.
Mindkét technikának megvannak a maga erősségei.
A kombináció több információt adhat az alábbiakról:
- identitás;
- összetétel;
- peptidtartalom.
Aminosav-analízis a peptidvizsgálattal szemben
Az aminosav-analízis önmagában is használható vizsgálati módszerként.
A peptidvizsgálat célja a következő:
a peptid mennyiségének meghatározása.
Az aminosav-analízis az egyik olyan technika, amellyel ez a cél elérhető.
További lehetséges vizsgálati módszerek:
- kvantitatív HPLC;
- UV-spektrofotometria;
- LC-MS-kvantifikálás;
- tömegmérleg.
Milyen hatással vannak az ellenionok?
Ilyen ellenionok például:
- acetát;
- klorid;
- TFA;
hozzájárulnak a liofilizált anyag teljes tömegéhez.
Az aminosav-analízis során elsősorban a peptid aminosav-összetevőit vizsgálják.
Ezáltal a módszer segíthet különbséget tenni a következők között:
- teljes anyagtömeg;
- tényleges peptidmennyiség.
A teljes tömegmérleghez további analízisekre lehet szükség.
Milyen hatással van a maradék nedvesség?
A maradék nedvesség hozzájárul a teljes tömeghez, de nem az aminosav-összetételhez.
A nettó peptidtartalom kiszámításakor a nedvességvizsgálat kiegészítő információt adhat.
Egy átfogó tömegmérleg a következőket tartalmazhatja:
- peptidtartalom;
- víztartalom;
- ellenion-tartalom;
- egyéb komponensek.
Kimutathatók-e szennyeződések aminosav-analízissel?
Egyes eltérő aminosavjelek váratlan komponensekre utalhatnak.
A módszert azonban nem úgy tervezték, hogy minden lehetséges szennyeződést kimutasson.
Más technikákra lehet szükség a következőkhöz:
- szerves szennyeződések;
- maradék oldószerek;
- fémek;
- mikrobiológiai szennyeződés;
- endotoxinok.
Mi szerepelhet egy COA-ban?
Az analitikai tanúsítvány többek között ilyen információkat tartalmazhat:
- vizsgálat: aminosav-analízis;
- analitikai módszer;
- mért aminosav-arányok;
- elméleti arányok;
- számított peptidtartalom;
- vizsgálat dátuma;
- tételszám.
Nem minden COA tartalmaz aminosav-analízist.
Ha csak HPLC-t és MS-t végeztek, abból nem vezethető le teljes körű aminosav-kvantifikálás.
Miért fontos a tételhez való kapcsolás?
Az aminosav-analízist össze kell kapcsolni a vizsgált gyártási tétellel.
Fontos adatok:
- tételszám;
- termék neve;
- analízis dátuma;
- laboratórium;
- analitikai módszer.
Az egyértelmű gyártási tételhez nem kapcsolt analitikai jelentés kevésbé értékes a nyomonkövethetőség szempontjából.
Mit jelent a mérési bizonytalanság?
Minden kvantitatív analízis mérési bizonytalanságot tartalmaz.
Az aminosav-analízis során a változékonyság forrásai lehetnek:
- minta-előkészítés;
- hidrolízis;
- aminosavveszteség;
- derivatizálás;
- kalibrálás;
- kromatográfiás elválasztás;
- csúcsterminálás.
Ezért az eredményeket nem szabad abszolút hibamentesnek tekinteni.
Miért fontos a módszervalidálás?
Egy módszernek alkalmasnak kell lennie a kitűzött célra.
A kvantitatív aminosav-elemzés releváns validálási jellemzői lehetnek:
- pontosság;
- precizitás;
- linearitás;
- specificitás;
- mérési tartomány;
- robosztusság;
- megismételhetőség.
A minőségi aminosavprofil meghatározására alkalmas módszer nem feltétlenül elegendő a pontos peptidkvantifikáláshoz.
Tudományos korlátok
Az aminosav-elemzésnek fontos korlátai vannak.
A módszer önmagában nem határozza meg:
- pontos aminosavsorrend;
- molekulatömeg;
- HPLC-tisztaság;
- háromdimenziós szerkezet;
- biológiai aktivitás;
- sterilitás;
- endotoxintartalom.
Emellett egyes aminosavak a hidrolízis során megváltozhatnak.
Az átfogó minőségértékeléshez több analitikai technikát kell kombinálni.
Összefoglalás
Az aminosav-elemzés a peptidekben található aminosavak összetételét és mennyiségét vizsgálja.
A klasszikus elemzés során a peptidláncot először hidrolízissel bontják le.
Ezt követően az aminosavakat:
- elválaszthatók;
- kimutathatók;
- mennyiségileg meghatározhatók;
- az elméleti összetétellel összehasonlítva.
Az aminosav-elemzés felhasználható:
- az aminosav-összetétel ellenőrzése;
- a mólarányok értékelése;
- a peptidtartalom mennyiségi meghatározása;
- az identitás megerősítése.
A módszer korlátokkal rendelkezik, mivel egyes aminosavak a hidrolízis során megváltozhatnak.
Ezért az aminosav-elemzést előnyös az alábbiakkal kombinálni:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- peptidvizsgálat;
- maradék-nedvesség elemzése;
- ellenion-elemzés.
Kutatási felelősségkizárás
A Peptidera kutatási peptidjeit kizárólag Research Use Only (RUO) céljára kínálják, és laboratóriumi kutatásra, valamint analitikai alkalmazásokra szolgálnak.
Emberi vagy állati fogyasztásra, diagnosztikai felhasználásra, terápiás alkalmazásra vagy önbeadásra nem alkalmas.
Peptidismeretek és minőség-ellenőrzés
Kapcsolódó Peptidera-termékek:
Liofilizált kutatási peptidek tételazonosítással és rendelkezésre álló analitikai minőségi adatokkal
Kapcsolódó belső blogbejegyzések:
- PB-0230 — Peptidtisztaság és HPLC
- PB-0231 — Tömegspektrometria peptidek esetében
- PB-0233 — Peptidvizsgálat: tisztaság a peptidtartalommal szemben
- PB-0234 — Maradék nedvesség liofilizált peptidekben
- PB-0238 — Ellenionok peptidekben
Belső linkjavaslatok:
- Link a PB-0233 oldalához az aminosav-elemzésről mint peptidvizsgálatról
- Link a PB-0230 oldalához a HPLC-tisztaságtól való eltérésről
- Link a PB-0231 oldalához a molekulatömegről és a szekvenciaelemzésről
- Link a PB-0234 oldalához a maradék nedvességről és a nettó peptidtartalomról
- Link a PB-0238 oldalához az ellenionokról és a tömegmérlegről
- Link a Peptidera analitikai tanúsítványokat tartalmazó oldalához
- Link a kutatási peptidek gyűjteményéhez