Tömegspektrometria peptidek esetében – magyarázat

Tömegspektrometria peptidek esetében: hogyan vizsgálják a molekuláris azonosságot?

A kutatási célú peptidek minőség-ellenőrzése során gyakran több analitikai technikát kombinálnak. A HPLC információt adhat a kromatográfiás tisztaságról, de egy magas főcsúcs önmagában nem bizonyítja automatikusan, hogy a megfelelő peptid van jelen.

A molekuláris azonosság további vizsgálatához gyakran tömegspektrometriát alkalmaznak.

A tömegspektrometria, röviden MS, olyan analitikai technika, amely ionizált molekulák tömeg-töltés arányát méri. A peptidek elemzésekor a mért molekulatömeg összehasonlítható az aminosavsorrend alapján elméletileg várt tömeggel.

Ha ezek az értékek megegyeznek, az alátámasztja a vizsgált peptid azonosítását. A tömegspektrometria azonban önmagában sem ad teljes képet a minőségről.

Ebben a blogbejegyzésben bemutatjuk, hogyan működik a tömegspektrometria, miért produkálhatnak a peptidek több tömegsignált, és hogyan értelmezik az MS-eredményeket HPLC-vel és más analitikai módszerekkel együtt.

---

Mi a tömegspektrometria?

A tömegspektrometria olyan analitikai technika, amelynek során a molekulákat töltött részecskékké, vagyis ionokká alakítják.

Ezeket az ionokat ezt követően a tömeg-töltés arányuk alapján választják szét és mérik meg.

Ezt az arányt a következőképpen jelölik:

m/z

Ekkor:

• m a tömeghez;
• z az elektromos töltéshez.

A tömegspektrométer tehát nem mindig közvetlenül a teljes molekulatömeget méri. A műszer a tömeg és a töltés arányát méri.

Nagyobb molekulák, köztük számos peptid esetében, több töltés is kialakulhat. Emiatt ugyanaz a peptid a tömegspektrum különböző pontjain is megjelenhet.

---

Miért használják a tömegspektrometriát a peptidek elemzésében?

Egy peptid aminosavak meghatározott sorrendjéből áll.

Minden aminosav-kombinációnak van elméletileg kiszámítható molekulatömege.

A tömegspektrometria felhasználható annak vizsgálatára, hogy a mért tömeg megfelel-e ennek az elméleti értéknek.

Az MS-elemzés hozzájárulhat a következőkhöz:

• a molekuláris azonosság megerősítése;
• összehasonlítás az elméleti molekulatömeggel;
• bizonyos kémiai módosulások kimutatása;
• bomlástermékek elemzése;
• peptidvariánsok vizsgálata;
• gyártási tételek összehasonlítása.

A megfelelő tömeg alátámasztja egy peptid azonosítását.

Az eredményt azonban mindig az analitikai módszerrel és más minőségi adatokkal együtt kell értékelni.

---

Mi az elméleti molekulatömeg?

Az elméleti molekulatömeg kiszámítása a következők alapján történik:

• az aminosavsorrend;
• az aminosavak száma;
• esetleges kémiai módosítások;
• a molekula térbeli formája;
• specifikus végcsoportok.

Amikor az aminosavak peptidláncot alkotnak, peptidkötések jönnek létre.

Minden peptidkötés kialakulásakor egy vízmolekula hasad le. Ezért egy teljes peptid tömege nem egyszerűen az összes szabad aminosav tömegének összege.

A módosítások szintén befolyásolhatják a tömeget.

Példák:

• amidálás;
• acetilezés;
• foszforiláció;
• oxidáció;
• zsírsavláncok hozzáadása;
• diszulfidhidak képződése.

Ezért az elméleti tömeget a pontos molekulaszerkezet alapján kell kiszámítani.

---

Mit jelent a molekulatömeg?

A molekulatömeg és a molekuláris tömeg kifejezéseket gyakran felváltva használják.

Laboratóriumi jelentésekben az értéket általában a következő mértékegységben adják meg:

• dalton, rövidítve Da;
• kilodalton, rövidítve kDa.

Egy dalton tömege körülbelül egy hidrogénatom tömegének felel meg.

Egy 3 000 Da molekulatömegű peptid tömege tehát körülbelül 3 kDa.

A peptidek molekulatömege jelentősen eltérhet az alábbiaktól függően:

• lánchossz;
• aminosav-összetétel;
• kémiai módosítások.

---

Hogyan működik a tömegspektrométer?

A tömegspektrométer általában több különböző részből áll.

1. Mintabevitel

A peptidet először előkészítik, majd bejuttatják a műszerbe.

A mintaelőkészítés hatással lehet a következőkre:

• jelintenzitás;
• detektálhatóság;
• ionképződés;
• háttérjelek.

2. Ionizáció

A molekulák elektromosan töltötté válnak.

A peptidanalízis gyakran alkalmazott technikái:

• elektrospray ionizáció;
• mátrixszal segített lézeres deszorpció/ionizáció.

3. Tömegelemzés

A keletkezett ionokat tömeg-töltés arányuk alapján választják szét.

4. Detektálás

A detektor regisztrálja az ionokat.

5. Adatfeldolgozás

A mért jeleket tömegspektrummá alakítják.

Ez a spektrum a detektált ionoknak megfelelő csúcsokat tartalmaz.

---

Mi az elektrospray ionizáció?

Az elektrospray ionizáció, röviden ESI, a peptidek gyakran alkalmazott ionizációs technikája.

Az ESI során folyékony mintát vezetnek át egy finom nyíláson, miközben elektromos feszültséget alkalmaznak.

Ennek hatására elektromosan töltött cseppek alakulnak ki.

Amikor az oldószer elpárolog, töltött molekulák maradnak vissza.

Az ESI fontos jellemzője, hogy a nagyobb molekulák több elektromos töltést is felvehetnek.

Egy peptid például a következő formákban fordulhat elő:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Itt az M a peptid molekulatömegét jelöli.

A több töltés miatt ugyanahhoz a molekulához különböző m/z-jelek tartoznak.

---

Miért van egy peptidnek több csúcsa?

Amikor egy peptid több protont vesz fel, különböző töltésállapotok alakulnak ki.

Tegyük fel, hogy egy peptid molekulatömege körülbelül 3 000 Da.

A lehetséges jelek körülbelül a következők:

• egy pozitív töltés: m/z körülbelül 3.001;
• két pozitív töltés: m/z körülbelül 1.501;
• három pozitív töltés: m/z körülbelül 1.001.

Ezek a jelek mind ugyanahhoz a peptidhez tartozhatnak.

A szoftver ezt a töltéseloszlást felhasználva kiszámíthatja az eredeti molekulatömeget.

Ezt a folyamatot dekonvolúciónak nevezik.

---

Mi az a dekonvolúcióval kapott tömegspektrum?

Egy nyers ESI-mérés több töltéscsúcsot is tartalmazhat.

Ez megnehezítheti az értelmezést.

A dekonvolúciós szoftver a különböző töltésállapotokat egyetlen becsült molekulatömeggé számítja át.

A dekonvolúcióval kapott spektrum így könnyebben összehasonlítható a következővel:

• az elméleti tömeg;
• egy referencia-standard;
• termékspecifikációk.

A számítás minősége a következőktől függ:

• jelintenzitás;
• felbontás;
• háttérzaj;
• szoftverbeállítások;
• átfedő komponensek jelenléte.

---

Mi az a MALDI?

A Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, röviden MALDI, egy másik ionizációs technika.

A peptidet mátrixanyaggal keverik össze, majd egy mérőlemezre viszik fel.

A lézer aktiválja a mátrixot, aminek következtében peptidionok keletkeznek.

A MALDI gyakran főként egyszeresen töltött ionokat hoz létre.

Ennek köszönhetően a spektrum egyszerűbbnek tűnhet, mint egy ESI-spektrum.

A MALDI-t gyakran time-of-flight-tömeganalizátorral kombinálják.

Ezt a kombinációt így nevezik:

MALDI-TOF

---

Mi az a time-of-flight?

A time-of-flight-tömeganalizátorban az ionokat elektromos tér gyorsítja fel.

Ezután egy mérőcsövön haladnak keresztül.

Az alacsonyabb tömeg/töltés arányú ionok általában gyorsabban érik el a detektort, mint a magasabb arányú ionok.

A repülési idő alapján számítható ki az m/z-érték.

A TOF-rendszerek a következőkre használhatók:

• peptidazonosítás;
• tömeghatározás;
• molekuláris változatok összehasonlítása.

A végső pontosság a kalibrálástól, a műszerbeállításoktól és a minta-előkészítéstől függ.

---

Mi az LC-MS?

A folyadékkromatográfia-tömegspektrometria, röviden LC-MS, a folyadékkromatográfiát tömegspektrometriával kombinálja.

A komponenseket először kromatográfiásan választják el.

Ezután a tömegspektrométer elemzi az egyes jeleket.

Az LC-MS a következőkről képes kombinált információt nyújtani:

• retenciós idő;
• kromatográfiai profil;
• molekulatömeg;
• lehetséges szennyeződések;
• bomlástermékek.

Ennek köszönhetően az LC-MS több információt nyújthat, mint egy különálló HPLC- vagy MS-elemzés.

---

Mi a különbség a HPLC és a tömegspektrometria között?

A HPLC és a tömegspektrometria különböző analitikai kérdésekre ad választ.

HPLC

A HPLC a következőkről adhat információt:

• pontos mennyiség;
• a detektált komponensek relatív mennyisége;
• retenciós idők;
• a kromatográfiai profil változásai.

Tömegspektrometria

A tömegspektrometria információt adhat a következőkről:

• molekulatömeg;
• lehetséges azonosság;
• kémiai módosítások;
• bizonyos bomlástermékek.

Egyszerűsített összehasonlítás:

Ezért a két technikát gyakran kombinálják.

---

Előfordulhat-e ugyanaz a molekulatömeg különböző peptideknél?

Igen.

Különböző aminosav-szekvenciák azonos vagy közel azonos teljes tömegűek lehetnek.

Ezeket néha izobár struktúráknak nevezik.

Ezért az egyező tömeg nem mindig bizonyítja, hogy a teljes aminosavsorrend helyes.

A részletesebb azonosításhoz további technikákra lehet szükség, például:

• tandem-tömegspektrometria;
• fragmentációs elemzés;
• aminosav-elemzés;
• szekvenciaelemzés;
• referenciaszabvánnyal való összehasonlítás.

A szükséges elemzési módszer a kívánt bizonyosságtól függ.

---

Mi az a tandem-tömegspektrometria?

A tandem-tömegspektrometriát általában így írják:

MS/MS

Az MS/MS során egy kiválasztott peptidiont tovább fragmentálnak.

A keletkezett fragmentumokat ezt követően újra megmérik.

A fragmentációs minta a következőkről adhat információt:

• aminosavsorrend;
• a módosítások helye;
• peptidazonosság;
• a bomlástermékek szerkezete.

Az MS/MS így több szerkezeti információt adhat, mint csupán az ép molekula tömege.

---

Mik azok a peptidfragmentumok?

Amikor egy peptidlánc az MS/MS során meghatározott helyeken felhasad, fragmentumionok keletkeznek.

Gyakori fragmentumtípusok:

• b-ionok;
• y-ionok.

Ezen fragmentumok tömege felhasználható az aminosav-szekvencia egyes részeinek rekonstruálására.

Az értelmezés összetett lehet.

Nem minden peptid fragmentálódik ugyanúgy.

A következő tényezők lehetnek hatással:

• aminosav-összetétel;
• elektromos töltés;
• peptidméret;
• fragmentációs módszer;
• kémiai módosítások.

---

Kimutatható-e oxidáció tömegspektrometriával?

Bizonyos oxidatív változások mérhető tömegváltozást okoznak.

Például egyetlen oxigénatom hozzáadása gyakran körülbelül 16 Da tömegnövekedést eredményez.

Ezáltal a tömegspektrometria segíthet bizonyos oxidációs termékek azonosításában.

A detektálás a következőktől függ:

• koncentráció;
• műszerfelbontás;
• elemzési módszer;
• komponensek elválasztása.

Nem minden oxidatív változás lokalizálható teljes mértékben kizárólag egyetlen tömegszignál alapján.

Ehhez további fragmentációs elemzésre lehet szükség.

---

Meghatározhatja-e a tömegspektrometria a peptide mennyiségét?

Nem automatikusan.

A tömegszignál intenzitását a következők befolyásolják:

• ionizációs hatékonyság;
• molekuláris tulajdonságok;
• oldószer;
• műszerbeállítások;
• más komponensek jelenléte.

Ezért a kétszer erősebb jel nem jelenti automatikusan azt, hogy kétszer annyi peptid van jelen.

A megbízható mennyiségi meghatározáshoz validált módszerekre és megfelelő standardokra van szükség.

Lehetséges technikák:

• kvantitatív LC-MS;
• belső standardok;
• izotóposan jelölt referenciák;
• kalibrált HPLC-vizsgálatok.

---

Bizonyítható-e a sterilitás tömegspektrometriával?

Nem.

A peptidazonosításra szolgáló tömegspektrometria nem sterilitási vizsgálat.

Az eredmény nem ad közvetlen információt a következőkről:

• baktériumok;
• gombák;
• mikrobiológiai szaporodás;
• a termék sterilitása.

A sterilitás vizsgálatához speciális mikrobiológiai vizsgálati módszerek szükségesek.

Az endotoxinokat sem határozzák meg automatikusan egy standard peptid-MS-elemzés során.

---

Mérhetők endotoxinok tömegspektrometriával?

Nem standard identitásvizsgálattal.

Az endotoxinok összetett bakteriális komponensek.

Az endotoxinok vizsgálatára speciális módszereket alkalmaznak, például:

• Limulus Amebocyte Lysate-teszt;
• rekombináns faktor C-módszerek.

Ezért egy peptid helyes tömegspektruma nem bizonyítja, hogy az anyag endotoxinszintje alacsony.

Az identitás, a tisztaság, a sterilitás és az endotoxinok egymástól elkülönülő minőségi paraméterek.

---

Miért térhetnek el egymástól a laboratóriumi eredmények?

A különböző laboratóriumok kissé eltérő tömegértékeket adhatnak meg.

Lehetséges okok:

• műszertípus;
• kalibrálás;
• ionizációs módszer;
• minta-előkészítés;
• sóadduktumok;
• használt szoftver;
• felbontás;
• értelmezési módszer.

A kis eltérések nem jelentik automatikusan azt, hogy az eredmény helytelen.

A mért értéket a következők figyelembevételével kell értékelni:

• a műszer pontossága;
• várt molekuláris forma;
• használt analitikai módszer.

---

Mik azok az adduktumok?

A tömegspektrometria során a peptidionok más töltött részecskékhez kapcsolódhatnak.

Példák:

• nátrium;
• kálium;
• ammónium.

Ezáltal további csúcsok jelenhetnek meg.

Például egy nátrium-adduktum tömege eltér egy egyszerűen protonált peptidion tömegétől.

Az adduktumok nem jelentik automatikusan azt, hogy egy másik peptid van jelen.

Az értelmezéshez ismerni kell:

• minta-előkészítés;
• használt pufferek;
• várt ionformák.

---

Milyen információknak kell szerepelniük egy MS-jelentésben?

Egy professzionális elemzési jelentés többek között a következőket tartalmazhatja:

• a peptid neve;
• tétel- vagy lot szám;
• elméleti molekulatömeg;
• mért molekulatömeg;
• ionizációs módszer;
• a tömegspektrométer típusa;
• tömegspektrum;
• az elemzés dátuma;
• a laboratórium neve.

Részletesebb elemzés esetén a következők is feltüntethetők:

• mérési tartomány;
• felbontás;
• tömegakkurátus;
• fragmentációs adatok;
• használt szoftver.

De benodigde rapportage hangt af van het onderzoeksdoel.

---

A szükséges jelentés a kutatási céltól függ.

Tömegspektrometria és tétel-ellenőrzés

Minden gyártási tétel külön is vizsgálható.

• A tételspecifikus MS-elemzés az alábbiakat támogatja:
• azonosság-ellenőrzés;
• tételek közötti összehasonlítás;
• nyomonkövethetőség;

eltérések vizsgálata.

Az elemzési jelentésen szereplő tételszámnak meg kell egyeznie a fiolán feltüntetett azonosítóval.

---

Az egyértelmű tételazonosítás nélküli tömegspektrometriás eredmény korlátozottabb értékű a nyomonkövethetőség szempontjából.

Tudományos korlátok

A tömegspektrometria hatékony analitikai technika, de nem teljes körű minőségértékelés.

• Az egyező molekulatömeg önmagában nem bizonyítja automatikusan a következőket:
• teljes aminosav-szekvencia;
• magas kromatográfiás tisztaság;
• kromatográfiás tisztaság;
• megfelelő peptidmennyiség;
• alacsony endotoxinszint;
• biológiai aktivitás;

hosszú távú stabilitás.

• Átfogóbb értékeléshez több módszerre lehet szükség:
• A MALDI-TOF;
• HPLC;
• MS/MS;
• kvantitatív vizsgálat;
• stabilitásvizsgálat;
• nedvességelemzés;

további, termékspecifikus vizsgálatok.

---

Az eredményeket együttesen kell értelmezni.

Összefoglalás

A tömegspektrometriát a kutatási peptidek molekulatömegének vizsgálatára használják.

A technika az ionizált molekulák tömeg-töltés arányát méri.

Peptidelemzés során a mért tömeg összehasonlítható az elméletileg várt tömeggel.

Egy egyezés alátámasztja a molekuláris azonosítást.

• Fontos analitikai technikák:
• Az ESI-MS;
• A MALDI-TOF;
• Az LC-MS;

Az MS/MS.

• A tömegspektrometria azonban nem ad automatikusan információt a következőkről:
• pontos mennyiség;
• kromatográfiás tisztaság;
• endotoxinok;
• biológiai aktivitás.

Ezért az MS-t gyakran HPLC-vel és további minőségvizsgálatokkal kombinálják.

---

Kutatási felelősségi nyilatkozat

A Peptidera kutatási peptidjeit kizárólag Research Use Only (RUO) céljára kínálják, és laboratóriumi kutatásra, valamint analitikai alkalmazásokra szánják.

Nem emberi vagy állati fogyasztásra, diagnosztikai használatra, terápiás alkalmazásra vagy önadagolásra szolgál.

---

Kategória:
Peptidismeret és minőség-ellenőrzés

Kapcsolódó Peptidera-termékek:
Fagyasztva szárított kutatási peptidek tételazonosítással és elérhető analitikai minőségi adatokkal

Kapcsolódó belső blogbejegyzések:

• PB-0227 — Fagyasztva szárított peptidek és liofilizálás
• PB-0228 — Peptidfiolák és a csomagolás sértetlensége
• PB-0229 — Tételszámok és nyomonkövethetőség
• PB-0230 — Peptidtisztaság és HPLC
• Mi az analitikai tanúsítvány?

Belső linkjavaslatok:

• Link a PB-0230 oldalára a HPLC és az MS közötti különbségről
• Link a PB-0229 oldalára a tételspecifikus elemzéshez
• Link a tömegspektrometriás vizsgálati eredmények COA-oldalára
• Link a kutatási peptidek gyűjteményére
• Link a független laboratóriumi elemzés oldalára