Peptid referencia standardok magyarázata
Peptid-referenciastandardok: miért fontos az analitikai összehasonlítás
A kutatási célú peptidek minőségi elemzésénél gyakran használnak olyan technikákat, mint:
- HPLC;
- LC-MS;
- peptidvizsgálat;
- aminosav-elemzés;
- UV-spektrofotometria.
Ezek a műszerek mérési adatokat szolgáltatnak, de egy detektorjelnek vagy kromatográfiás csúcsnak nem automatikusan van pontos jelentése.
Egy ismeretlen minta megbízható azonosításához vagy mennyiségi meghatározásához összehasonlítható egy olyan anyaggal, amelynek releváns tulajdonságait már gondosan meghatározták.
Az ilyen anyagot referenciastandardnak nevezik.
Egy jól jellemzett peptid-referenciastandard felhasználható:
- azonosítás;
- retenciós idők összehasonlítása;
- kvantifikálás;
- kalibrálás;
- HPLC-módszerek értékelése;
- szennyeződések vizsgálata;
- bomlástermékek elemzése;
- a mérési nyomonkövethetőség támogatása.
Az analitikai eredmény minősége ezért nemcsak a laboratóriumi műszertől függ. Fontos a felhasznált referenciastandard identitása, tisztasága, peptidtartalma, tárolása és dokumentációja is.
A referenciastandard emellett nem automatikusan azonos egy tetszőleges, magas HPLC-százalékos mintával. Kvantitatív felhasználás esetén egyértelműnek kell lennie, hogy mennyi tényleges peptid van jelen, és mely nem peptid jellegű komponensek járulnak hozzá a teljes tömeghez.
Ebben a blogbejegyzésben áttekintjük, mik a peptid-referenciastandardok, miben különböznek az elsődleges és másodlagos standardok, és miért fontos az analitikai összehasonlítás a megbízható peptidelemzéshez.
Mi az a peptid-referenciastandard?
A peptid-referenciastandard gondosan jellemzett anyag, amelyet összehasonlítási alapként használnak a laboratóriumi elemzés során.
A kutatási céltól függően olyan tulajdonságokat állapíthatnak meg, mint:
- aminosavszekvencia;
- moleculaire massa;
- azonosság;
- HPLC-tisztaság;
- peptidtartalom;
- víztartalom;
- elleniontartalom;
- releváns szennyeződések jelenléte;
- tárolási stabilitás.
A standard ezután felhasználható egy ismeretlen minta analitikai összehasonlítására.
A szükséges jellemzés az alkalmazástól függ.
Az azonosításhoz használt standardnak nem mindig kell pontosan ugyanazoknak a követelményeknek megfelelnie, mint a kvantitatív vizsgálathoz használt standardnak.
Miért van szükség analitikai összehasonlításra?
Egy laboratóriumi műszer fizikai vagy kémiai jelet mér.
Példák:
- UV-elnyelés;
- fluoreszcencia;
- kromatográfiás csúcsterület;
- tömeg–töltés arány;
- ionintenzitás.
A jel nem automatikusan egyenlő a peptid pontos mennyiségével.
Ehhez megbízható összefüggésre van szükség a következők között:
- ismert mennyiség;
- mért jel;
- ismeretlen minta.
Egy referenciastandard segíthet ennek az összefüggésnek a megállapításában.
Egyszerű példa
Tegyük fel, hogy egy laboratórium egy peptid mennyiségét szeretné meghatározni kvantitatív HPLC-vel.
A laboratórium különböző oldatokat készít egy jellemzett referenciastandardból:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Minden oldatot elemeznek.
A mért csúcsterületeket az ismert koncentrációk függvényében ábrázolják.
Ebből kalibrációs görbe készül.
Ezt követően megmérik az ismeretlen mintát.
A koncentráció a minta jelének kalibrációs görbével való összehasonlításával számítható ki.
A számítás megbízhatósága többek között a következőktől függ:
- a referenciastandard minősége;
- a koncentráció helyes kiszámítása;
- pontos bemérés;
- pontos pipettázás;
- a módszer linearitása;
- az oldatok stabilitása.
Mi az a primer referenciastandard?
A primer referenciastandard olyan anyag, amelynek releváns tulajdonságait átfogóan meghatározták.
A standard több, egymástól független analitikai technikával is jellemezhető.
Lehetséges vizsgálatok:
- HPLC;
- LC-MS;
- aminosav-elemzés;
- vízmeghatározás;
- ellenion-elemzés;
- NMR;
- elemanalízis;
- tömegmérleg.
A cél annak nagy megbízhatósággal történő meghatározása, hogy:
- milyen anyag van jelen;
- mennyire tiszta;
- a kívánt komponensből mennyi van jelen;
- mely korrekciós tényezőkre van szükség.
A primer standard ezt követően más standardok kvalifikálására használható.
Mi az a szekunder referenciastandard?
A szekunder referenciastandardot más néven:
- munkastandard;
- munkastandard;
- belső referenciastandard.
Ezt a standardot primer vagy hivatalosan elismert referenciastandarddal való összehasonlítással kvalifikálják.
Szekunder standard használható rutinszerű laboratóriumi elemzésekhez.
Lehetséges előnyök:
- nagyobb elérhetőség;
- alacsonyabb költségek;
- a primer standard megőrzése;
- hatékonyabb rutinszerű használat.
A szekunder standardot azonban rendszeresen ellenőrizni és megfelelően tárolni kell.
Miért nem használják mindig a primer standardot?
A primer standardok:
- korlátozottan állnak rendelkezésre;
- költségesek;
- kis mennyiségben állnak rendelkezésre;
- specifikus hivatalos analitikai módszerekhez készülnek.
Ha egy szekunder standardot primer standarddal kvalifikálnak, rutinvizsgálatok végezhetők anélkül, hogy a primer standardot folyamatosan használni kellene.
A megbízhatóság a kvalifikáció minőségétől függ.
Mit jelent a munkastandard kvalifikációja?
A kvalifikáció azt jelenti, hogy a munkastandard tulajdonságait szisztematikusan megvizsgálják, és összehasonlítják egy megfelelő referenciával.
Egy kvalifikációs program a következőkből állhat:
- identitásvizsgálat;
- HPLC-tisztaság;
- peptidvizsgálat;
- víztartalom;
- elleniontartalom;
- kromatogramok összehasonlítása;
- tömegspektrumok összehasonlítása;
- stabilitásértékelés.
A szükséges vizsgálatok a tervezett felhasználástól függenek.
Identitás és mennyiségi meghatározás
Egy referenciastandardnak többféle analitikai funkciója lehet.
Identitási standard
Az identitási standarddal azt vizsgálják, hogy egy ismeretlen minta megfelel-e a várt peptidnek.
Lehetséges összehasonlítások:
- HPLC-retentietidő;
- moleculaire massa;
- massaspectrometrisch profiel;
- spectroscopische eigenschappen.
Kwantitatieve standaard
Een kwantitatieve standaard wordt gebruikt om de hoeveelheid peptide te bepalen.
Daarvoor moet het werkelijke peptidegehalte voldoende betrouwbaar bekend zijn.
Een hoge HPLC-zuiverheid alleen is daarvoor meestal niet voldoende.
Waarom is HPLC-zuiverheid niet voldoende?
Een peptide kan bijvoorbeeld een HPLC-zuiverheid van 99% hebben.
Dat betekent niet automatisch dat 99% van de totale massa uit de peptide bestaat.
Het materiaal kan daarnaast bevatten:
- water;
- acetaat;
- chloride;
- TFA;
- zouten;
- andere niet-chromatografisch gemeten componenten.
Voor een kwantitatieve standaard moet daarom onderscheid worden gemaakt tussen:
- chromatografische zuiverheid;
- totale materiaalmassa;
- netto peptidegehalte.
Wat is de toegewezen waarde?
Een referentiestandaard kan een toegewezen waarde hebben.
Deze waarde beschrijft bijvoorbeeld:
- peptidtartalom;
- tisztaság;
- concentratie;
- potentie;
- hoeveelheid per verpakking.
De toegewezen waarde moet gebaseerd zijn op geschikte analytische gegevens.
Ook kan een correctiefactor worden vermeld.
Wat is een correctiefactor?
Een correctiefactor wordt gebruikt om de gewogen hoeveelheid materiaal om te rekenen naar de werkelijke hoeveelheid peptide.
Stel:
- gewogen materiaal: 10,0 mg;
- toegewezen peptidegehalte: 85%;
- werkelijke peptidehoeveelheid: 8,5 mg.
Wanneer deze correctie niet wordt toegepast, kan de berekende concentratie worden overschat.
Waarom is netto peptide content belangrijk?
Net peptide content beschrijft het aandeel van de werkelijke peptide in het onderzochte materiaal.
Bij de berekening kunnen factoren worden meegenomen zoals:
- restvocht;
- tegenionen;
- organische componenten;
- anorganische componenten.
Voor kwantitatieve analyse is dit vaak relevanter dan alleen de HPLC-zuiverheid.
Welke rol speelt aminozuuranalyse?
Aminozuuranalyse kan worden gebruikt om het peptidegehalte te bepalen.
De peptideketen wordt daarbij gehydrolyseerd tot afzonderlijke aminozuren.
Geselecteerde aminozuren worden vervolgens gekwantificeerd.
Wanneer bekend is hoeveel van deze aminozuren in iedere peptideketen aanwezig zijn, kan de hoeveelheid peptide worden berekend.
Aminozuuranalyse kan daardoor bijdragen aan de waardetoekenning van een referentiestandaard.
Welke rol speelt massaspectrometrie?
Massaspectrometrie kan helpen bij het bevestigen van:
- moleculaire massa;
- azonosság;
- bepaalde modificaties;
- degradatieproducten.
LC-MS kan chromatografische scheiding combineren met massadetectie.
Een overeenkomstige moleculaire massa ondersteunt de identiteit, maar bewijst niet zelfstandig:
- pontos peptidmennyiség;
- volledige sequentie;
- az összes szennyezőanyag hiánya.
Daarom worden vaak meerdere technieken gecombineerd.
Welke rol speelt MS/MS?
Bij tandem-massaspectrometrie wordt een geselecteerd peptide-ion gefragmenteerd.
De fragmenten kunnen informatie geven over de aminozuurvolgorde.
MS/MS kan daardoor aanvullende ondersteuning bieden voor:
- sequentiebevestiging;
- a módosítások lokalizálása;
- a bomlástermékek azonosítása.
Az analitikai teljesítmény az alábbiaktól függ:
- peptidméret;
- fragmentáció;
- műszerfelbontás;
- adatfeldolgozás.
Milyen szerepet tölt be a HPLC?
A HPLC a következőkre használható:
- retenciós idők összehasonlítása;
- a kromatográfiás tisztaság értékelése;
- mellékcsúcsok vizsgálata;
- kvantitatív assay;
- stabilitásvizsgálat.
Összehasonlításkor a referenciát és a mintát ugyanazon ellenőrzött módszerrel kell elemezni.
Fontos paraméterek:
- oszloptípus;
- mozgófázis;
- hőmérséklet;
- áramlási sebesség;
- detektálási hullámhossz.
Mi a kalibrációs görbe?
A kalibrációs görbe a meghatározott koncentrációk és a mért detektorjelek közötti kapcsolatot írja le.
A megbízható kalibrációs görbét az alábbiak alapján kell értékelni:
- linearitás;
- mérési tartomány;
- reprodukálhatóság;
- eltérések;
- az analitikai módszerhez való alkalmasság.
Az ismeretlen koncentrációt a validált mérési tartományon belül számítják ki.
A tartományon kívüli extrapoláció további bizonytalanságot okozhat.
Mi a linearitás?
A linearitás azt írja le, hogy a mért jel milyen mértékben változik a koncentrációval arányosan.
A koncentráció megduplázódásakor lineáris tartományban a jel ennek megfelelő változása várható.
A kapcsolatnak nem kell minden módszer esetében, minden koncentrációtartományban lineárisnak lennie.
Ezért a releváns mérési tartományt kísérletileg vizsgálják.
Mit jelent az analitikai visszavezethetőség?
Az analitikai vagy metrológiai visszavezethetőség leírja, hogyan kapcsolódik egy mérési eredmény egy elismert referenciához dokumentált összehasonlítási láncon keresztül.
Fontos elemek:
- használt standard;
- tanúsítvány;
- hozzárendelt érték;
- kalibrálás;
- analitikai módszer;
- mérési bizonytalanság;
- dokumentáció.
A visszavezethetőség támogatja az eredmények összehasonlíthatóságát az alábbiak között:
- különböző mérési napok;
- laboratóriumok;
- műszerek;
- gyártási tételek.
Mi a metrológiai visszavezethetőség?
A metrológia a mérés tudománya.
A metrológiai visszavezethetőség dokumentált és megszakítás nélküli összehasonlítási láncot igényel egy meghatározott referenciához. Minden lépés hozzájárul a teljes mérési bizonytalansághoz.
Peptidelemzés esetén a gyakorlati visszavezethetőség többek között az alábbiaktól függhet:
- referenciastandard;
- hozzárendelt peptidtartalom;
- kalibrált mérleg;
- térfogati eszközök;
- analitikai módszer.
Mi a mérési bizonytalanság?
Minden analitikai mérés bizonytalanságot tartalmaz.
Lehetséges források:
- a referenciaminta bizonytalansága;
- mérés;
- pipettázás;
- hígítás;
- műszer-variabilitás;
- kalibrálás;
- csúcsterminálás;
- minta-előkészítés.
A mérési bizonytalanság nem jelenti azt, hogy egy eredmény megbízhatatlan.
Leírja azt a becsült tartományt, amelyen belül a tényleges érték ésszerűen elhelyezkedhet.
Miért kell a standardoknak tételspecifikusnak lenniük?
A referenciamintákat is gyártási tételekben állítják elő.
A különböző gyártási tételek eltérhetnek a következőkben:
- peptidtartalom;
- víztartalom;
- elleniontartalom;
- tisztasági profil;
- stabilitás.
Ezért egyértelműnek kell lennie, hogy a referenciamintából melyik gyártási tételszámot használták.
Mi szerepel egy referenciastandard tanúsítványán?
Egy tanúsítvány a következőkről tartalmazhat információt:
- név;
- katalógusszám;
- tételszám;
- hozzárendelt érték;
- tervezett felhasználás;
- tárolási feltételek;
- érvényességi információk;
- analitikai módszerek;
- korrekciós tényező.
Nem minden tanúsítvány tartalmazza ugyanazokat az adatokat.
A standardot a hozzá tartozó utasítások szerint kell használni.
Miért fontosak a tárolási feltételek?
Egy referenciastandard a tárolás során megváltozhat.
Lehetséges folyamatok:
- oxidáció;
- dezamidáció;
- nedvességfelvétel;
- aggregáció;
- bomlás.
Ezért a következőkre vonatkozó feltételek határozhatók meg:
- hőmérséklet;
- fény elleni védelem;
- nedvesség elleni védelem;
- felbontás utáni használat;
- tárolási idő.
A nem megfelelően tárolt standard hibás összehasonlításokhoz vezethet.
Mi a lejárati dátum?
Néhány referenciastandardnak meghatározott lejárati dátuma van.
Más standardok a következőkkel működnek:
- érvényesség ellenőrzése;
- újraminősítési dátum;
- aktuális tételállapot.
A laboratóriumnak ellenőriznie kell, hogy a standard a használat időpontjában megfelelő és érvényes-e.
Mi az újraminősítés?
Az újraminősítés egy referenciastandard újbóli értékelése.
Lehetséges vizsgálatok:
- HPLC;
- LC-MS;
- peptidvizsgálat;
- víztartalom;
- egy elsődleges standarddal való összehasonlítás.
Újraminősítésre lehet szükség a következők után:
- előre meghatározott használati idő;
- hosszú távú tárolás;
- a megjelenés megváltozása;
- eltérő analitikai eredmény.
Miért fontosak a szennyezésstandardok?
Nemcsak a kívánt peptid használható standardként.
Ismert szennyeződések vagy degradációs termékek is szolgálhatnak referenciaként.
Példák:
- oxidációs termékek;
- dezamidált variánsok;
- fragmensek;
- deléciós szekvenciák;
- aggregációhoz kapcsolódó komponensek.
Ezek a standardok segíthetnek a mellékcsúcsok azonosításában és mennyiségi meghatározásában.
Mik azok a degradációs standardok?
Egy degradációs standard egy ismert bomlási variánst képvisel.
Ez a következők vizsgálatára használható:
- hol eluál egy degradációs termék;
- milyen molekulatömeg van jelen;
- mennyire érzékeny az analitikai módszer;
- mennyi degradációs termék van jelen.
Nem minden degradációs termék áll rendelkezésre tiszta standardként.
Referenciastandardok és módszervalidálás
Egy analitikai módszernek bizonyíthatóan alkalmasnak kell lennie a tervezett célra.
Az ICH Q2(R2) az analitikai eljárások validálásának alapelveit írja le. A releváns jellemzők többek között a specificitás, a pontosság, a precizitás, a linearitás és a mérési tartomány lehetnek.
A referenciastandardok a következők vizsgálatára használhatók:
- pontosság;
- specificitás;
- linearitás;
- kvantitatív tartomány;
- módszerteljesítmény.
Mi a pontosság?
A pontosság azt írja le, hogy a mért eredmény milyen közel van egy elfogadott referenciaértékhez.
Egy jól jellemzett standard felhasználható egy analitikai módszer pontosságának vizsgálatára.
Mi a precizitás?
A precizitás azt írja le, hogy az ismételt mérési eredmények milyen közel vannak egymáshoz.
Egy módszer adhat nagyon precíz eredményeket, amelyek mégis rendszeresen eltérnek a valódi értéktől.
Ezért a precizitás és a pontosság egyaránt fontos.
Mi a specificitás?
A specificitás azt írja le, hogy az analitikai módszer kellőképpen meg tudja-e különböztetni a kívánt komponenst a többi komponenstől.
Példák:
- szennyezőanyagok;
- bomlástermékek;
- formulációs komponensek;
- ellenionok.
A megfelelő referenciastandard segíthet a főcsúcs azonosításában.
Kaphat két laboratórium eltérő eredményeket?
Igen.
Az eltéréseket a következők okozhatják:
- referenciastandard;
- analitikai módszer;
- minta-előkészítés;
- berendezés;
- kalibrálás;
- adatfeldolgozás;
- mérési bizonytalanság.
Jól jellemzett standardok és validált módszerek alkalmazása javíthatja az összehasonlíthatóságot.
Egy kereskedelmi peptid automatikusan referenciastandardnak minősül?
Nem.
Egy kereskedelmi peptid alkalmas lehet kutatási anyagként, de nem minősített referenciastandard automatikusan.
Standardként való használathoz egyértelműen meg kell határozni:
- azonosság;
- peptidtartalom;
- tisztaság;
- víztartalom;
- elleniontartalom;
- tárolási stabilitás;
- dokumentáció.
A követelmények az analitikai céltól függenek.
Hivatalos gyógyszerkönyvi referenciastandardok
Hivatalos szervezetek meghatározott gyógyszerkönyvi alkalmazásokhoz bocsátanak rendelkezésre referenciastandardokat.
Példák:
- USP-referenciastandardok;
- Európai Gyógyszerkönyv-referenciastandardok;
- WHO nemzetközi kémiai referenciavegyületek.
Ezeket a standardokat a kapcsolódó hivatalos módszerekben vagy dokumentációban leírt alkalmazásokhoz szánják.
Nem minden kutatási peptidhez létezik hivatalos gyógyszerkönyvi standard.
Tudományos korlátok
A referenciastandard javítja az analitikai összehasonlíthatóságot, de nem old meg minden mérési kihívást.
A megbízhatóság továbbra is a következőktől függ:
- analitikai módszer;
- minta-előkészítés;
- műszer;
- kalibrálás;
- tárolás;
- adatfeldolgozás;
- mérési bizonytalanság.
A megfelelő HPLC-retenciós idő önmagában nem bizonyítja a teljes molekuláris azonosságot.
A megfelelő molekulatömeg önmagában nem bizonyítja automatikusan:
- helyes, teljes szekvencia;
- pontos peptidmennyiség;
- az összes szennyezőanyag hiánya.
Ezért több, egymást kiegészítő analitikai technikát alkalmaznak.
Összefoglalás
A peptid-referenciastandard jól jellemzett anyag, amely analitikai összehasonlítási alapként szolgál.
A referenciastandardok a következőkre alkalmazhatók:
- azonosítás;
- HPLC-összehasonlítás;
- kalibrálás;
- peptidvizsgálat;
- kvantifikálás;
- módszervalidálás;
- szennyezőanyagok elemzése.
Az elsődleges standardot átfogóan jellemzik.
A másodlagos vagy munkastandardot megfelelő elsődleges referenciához képest minősítik, és rutinszerű elemzésre használható.
Kvantitatív alkalmazásokhoz önmagában általában nem elegendő a HPLC-tisztaság. A peptidtartalmat, a víztartalmat, az ellenionokat és más releváns komponenseket is értékelni kell.
A megbízható analitikai összehasonlításhoz szükséges:
- megfelelő referenciastandard;
- helyes értékhozzárendelés;
- tétel-nyomonkövethetőség;
- ellenőrzött tárolás;
- validált vizsgálati módszer;
- a mérési bizonytalanság értékelése.
Hivatalos források és tudományos hivatkozások
-
ICH Q2(R2) — Analitikai eljárások validálása
Az analitikai eljárások validálására vonatkozó nemzetközi irányelv, többek között a specificitás, a pontosság, a precizitás, a linearitás és a mérési tartomány tekintetében. -
USP — Hivatalos referenciastandardok
Az USP a referenciastandardokat többek között az azonosság, a hatáserősség, a tisztaság és a minőség vizsgálatához átfogóan jellemzett anyagokként írja le. -
Európai Gyógyszerkönyvi referenciastandardok — EDQM
Az EDQM-katalógus hivatalosan érvényes referenciastandardokat tartalmaz az Európai Gyógyszerkönyvben leírt alkalmazásokhoz. -
WHO — Nemzetközi kémiai referenciavegyületek
A WHO-ICRS-eket a WHO kémiai referenciavegyületekre vonatkozó irányelveihez igazodó eljárásokkal állapítják meg. -
NIST — Metrológiai nyomonkövethetőség
A NIST a metrológiai nyomonkövethetőséget a meghatározott referenciákhoz vezető, dokumentált és megszakítás nélküli kalibrálási láncként írja le. -
NIST — Standard referensanyagok
A NIST jól jellemzett összetételű vagy tulajdonságú referensanyagokat fejleszt és tanúsít a megbízható és összehasonlítható mérések támogatására. -
FDA — Gyógyszerek és biológiai készítmények analitikai eljárásai és módszervalidálása
Az FDA irányelvei az analitikai módszerek validálása során alkalmazott referenciastandardok használatával és minősítésével foglalkoznak.
Kutatási nyilatkozat
A Peptidera kutatási peptidjeit kizárólag Research Use Only (RUO) céljára kínáljuk, laboratóriumi kutatásra és analitikai alkalmazásokra.
Nem emberi vagy állati fogyasztásra, diagnosztikai használatra, terápiás alkalmazásra vagy önadagolásra szánt.
Kategória:
Peptidismeret és minőség-ellenőrzés
Kapcsolódó Peptidera-termékek:
Kutatási peptidek tételazonosítással és elérhető független analitikai minőségi adatokkal
Kapcsolódó belső blogok:
- PB-0230 — Peptidtisztaság és HPLC
- PB-0231 — Tömegspektrometria peptideknél
- PB-0233 — Peptidvizsgálat: tisztaság és peptidtartalom
- PB-0238 — Ellenionok peptideknél
- PB-0239 — Aminosav-elemzés peptideknél
- PB-0241 — Felügyeleti lánc a peptidvizsgálat során
Belső hivatkozási javaslatok:
- A PB-0230 hivatkozása a HPLC-retenciós időhöz és a kromatográfiás összehasonlításhoz
- A PB-0231 hivatkozása az LC-MS-hez, a molekulatömeghez és az MS/MS-hez
- A PB-0233 hivatkozása a kvantitatív peptidvizsgálatokhoz
- A PB-0238 hivatkozása az ellenionokhoz és a nettó peptidtartalomhoz
- A PB-0239 hivatkozása az aminosav-elemzéshez és az érték hozzárendeléséhez
- A PB-0241 hivatkozása a standardok és minták nyomonkövethetőségéhez
- A Peptidera független elemzési tanúsítványokat tartalmazó oldalának hivatkozása
- A kutatási peptidek gyűjteményének hivatkozása