Aminoskābju analīze peptīdos izskaidrota
Aminoskābju analīze peptīdos: sastāvs un kvantificēšana skaidrojumā
Peptīdi sastāv no aminoskābju ķēdēm. Šo aminoskābju secība lielā mērā nosaka peptīda ķīmiskās un strukturālās īpašības.
Kvalitātes pārbaudēs bieži izmanto tādas metodes kā HPLC un masspektrometriju, lai novērtētu tīrību un molekulmasu. Papildu analīzes metode ir aminoskābju analīze, ko bieži saīsina kā AAA.
Aminoskābju analīzi var izmantot, lai noskaidrotu:
- kuras aminoskābes ir paraugā;
- kā izmērītās aminoskābju attiecības atbilst paredzamajam sastāvam;
- cik daudz peptīda ir;
- vai aminoskābju sastāvs atbilst teorētiskajam peptīdam;
- kā var aprēķināt neto peptīdu saturu.
Šī metode darbojas citādi nekā HPLC un masspektrometrija. Klasiskajā aminoskābju analīzē peptīdu ķēde vispirms tiek sašķelta līdz atsevišķām aminoskābēm. Pēc tam šīs aminoskābes tiek atdalītas, noteiktas un kvantificētas.
Aminoskābju analīze var sniegt vērtīgu informāciju, taču tai ir arī ierobežojumi. Sadalīšanās laikā dažas aminoskābes var daļēji mainīties vai tikt zaudētas. Tāpēc rezultāti vienmēr jāinterpretē, ņemot vērā izmantotās metodes kontekstu.
Kas ir aminoskābju analīze?
Aminoskābju analīze ir laboratorijas metode, ar kuru nosaka parauga aminoskābju sastāvu.
Klasiskajā analīzē parasti veic šādus soļus:
- parauga sagatavošanu;
- peptīdu ķēdes hidrolīzi;
- atsevišķu aminoskābju atbrīvošanu;
- aminoskābju atdalīšanu;
- noteikšanu un kvantificēšanu;
- salīdzinājumu ar paredzamo sastāvu.
Rezultātu var attēlot kā:
- daudzums katrai aminoskābei;
- molārā attiecība;
- masas koncentrācija;
- aminoskābju profils;
- aprēķinātais peptīdu saturs.
Kas ir hidrolīze?
Hidrolīze ir ķīmisks process, kurā saites tiek sašķeltas ar ūdens palīdzību.
Aminoskābju analīzē peptīdu saites tiek sašķeltas, tādējādi atbrīvojot atsevišķas aminoskābes.
Plaši izmantota metode ir skābā hidrolīze.
Šajā procesā paraugs kontrolētu laika periodu tiek pakļauts:
- stiprai skābei;
- paaugstinātai temperatūrai;
- kontrolētos apstākļos.
Pēc hidrolīzes sākotnējā peptīdu ķēde vairs nepastāv kā neskarta molekula.
Atbrīvotās aminoskābes pēc tam var izpētīt atsevišķi.
Kāpēc peptīdu ķēde tiek sašķelta?
Neskarts peptīds var saturēt desmitiem dažādu aminoskābju atlieku.
Sadalot ķēdi, var izmērīt katras aminoskābes kopējo daudzumu.
Pieņemsim, ka teorētisks peptīds satur:
- četrus alanīna atlikumus;
- divus glicīna atlikumus;
- trīs leicīna atlikumus;
- vienu tirozīna atlikumu.
Pēc hidrolīzes var pārbaudīt, vai izmērītās attiecības aptuveni atbilst šim teorētiskajam sastāvam.
Tas palīdz novērtēt aminoskābju sastāvu.
Kāda ir atšķirība starp aminoskābju sastāvu un aminoskābju secību?
Aminoskābju analīze galvenokārt nosaka ,kuras aminoskābes ir klātesošas un kādā daudzumā.
Metode automātiski nenosaka precīzo secību.
Diviem atšķirīgiem peptīdiem var būt vienāds aminoskābju sastāvs, bet atšķirīga secība.
Piemēram:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Abi satur:
- vienu alanīnu;
- viens glicīns;
- vienu leicīnu.
Tomēr secība ir atšķirīga.
Secības izpētei nepieciešamas citas metodes, piemēram:
- tandēma masas spektrometrija;
- fragmentu analīze;
- specifiskas sekvencēšanas metodes.
Vai aminoskābju analīze var apstiprināt identitāti?
Aminoskābju analīze var apstiprināt sagaidāmo sastāvu.
Ja izmērītais aminoskābju profils būtiski atšķiras no teorētiskā sastāva, tas var būt iemesls papildu izpētei.
Tomēr atbilstošs profils pats par sevi nepierāda, ka precīzā aminoskābju secība ir pareiza.
Plašākam identitātes novērtējumam var kombinēt:
- molekulārā masa;
- LC-MS;
- MS/MS;
- aminoskābju analīzi;
- hromatogrāfijas dati.
Kā atdala aminoskābes?
Pēc hidrolīzes paraugs satur brīvu aminoskābju maisījumu.
Tās ir analītiski jāatdala cita no citas.
Iespējamās metodes ir:
- jonu apmaiņas hromatogrāfija;
- HPLC;
- UPLC;
- kapilārā elektroforēze.
Izvēlētā metode ir atkarīga no:
- vēlamā jutība;
- laboratorijas metode;
- parauga veids;
- nepieciešamā precizitāte.
Kas ir derivatizēšana?
Daudzām aminoskābēm bez papildu apstrādes ir ierobežota nosakāmība.
Tāpēc tās var ķīmiski saistīt ar nosakāmu grupu.
To sauc par derivatizēšanu.
Derivatizēšana var notikt:
- pirms hromatogrāfiskās atdalīšanas;
- pēc hromatogrāfiskās atdalīšanas.
Izveidotos derivātus var labāk izmērīt, piemēram, izmantojot:
- UV detekcija;
- fluorescences detekcija;
- masas spektrometrija.
Pirmskolonnas derivatizēšana
Pirmskolonnas derivatizēšanas laikā aminoskābes marķē pirms hromatogrāfiskās atdalīšanas.
Pēc tam izveidotos derivātus atdala kolonnā.
Iespējamās priekšrocības ir:
- augsta jutība;
- piemērota fluorescences detekcija;
- vairāku aminoskābju analīze.
Reakcijai jānorisinās reproducējami.
Nepilnīga derivatizācija var ietekmēt kvantificēšanu.
Pēckolonnas derivatizācija
Pēckolonnas derivatizācijā aminoskābes vispirms atdala.
Pēc kolonnas tie reaģē ar detektēšanas reaģentu.
Zināms piemērs ir analīze ar ninhidrīnu.
Pēc tam izveidotos reakcijas produktus var izmērīt optiski.
Kā nosaka aminoskābes daudzumu?
Kvantificēšanai izmanto references standartus.
Standartšķīdumi satur zināmu aminoskābju daudzumu.
Tos mēra, lai noteiktu sakarību starp:
- koncentrācija;
- detektora signāls.
Pēc tam izmēra nezināmo paraugu.
Izmantojot kalibrēšanas datus, var aprēķināt katras aminoskābes daudzumu.
Kas ir iekšējais standarts?
Iekšējais standarts ir zināma viela, ko pievieno paraugiem un kalibrēšanas šķīdumiem.
Tas var palīdzēt koriģēt variācijas šādos posmos:
- parauga sagatavošana;
- injicēšanas;
- derivatizācija;
- analīzes.
Iekšējam standartam analītiski jābūt skaidri atšķiramam no analizējamām aminoskābēm.
Kā aminoskābju analīze var noteikt peptīdu saturu?
Ja peptīda aminoskābju sastāvs ir zināms, atlasītas aminoskābes var izmantot peptīda daudzuma aprēķināšanai.
Pieņemsim, ka katra peptīdu ķēde satur tieši četrus alanīna atlikumus.
Kad tiek izmērīts kopējais alanīna daudzums, pēc tā var aprēķināt, cik peptīdu ķēžu bija.
Aprēķinā ņem vērā:
- atlieku skaits vienā peptīdā;
- molekulārā masa;
- izmērītais aminoskābju daudzums;
- analīzes metode.
To var izmantot kvantitatīvai peptīdu analīzei.
Kāpēc ne vienmēr izmanto visas aminoskābes?
Ne katra aminoskābe ir vienlīdz piemērota kvantificēšanai.
Dažas aminoskābes hidrolīzes laikā var:
- daļēji sadalīties;
- ķīmiski mainīties;
- izdalīties nepilnīgi;
- var būt grūti ticami izmērīt.
Tāpēc bieži izvēlas stabilas aminoskābes.
Izvēle ir atkarīga no peptīdu secības un analīzes metodes.
Kuras aminoskābes hidrolīzes laikā var mainīties?
Skābā hidrolīze var izraisīt dažādas ietekmes.
Triptofāns
Standarta skābās hidrolīzes laikā triptofāns lielākoties var sadalīties.
Tāpēc, ja triptofāns jānosaka specifiski, ir nepieciešamas pielāgotas metodes.
Asparagīns
Hidrolīzes laikā asparagīnu var pārvērst par aspartātu.
Tāpēc klasiskajā analīzē asparagīns un aspartāts ne vienmēr tiek uzrādīti atsevišķi.
Glutamīns
Glutamīnu var pārvērst par glutamātu.
Tādējādi glutamīnu un glutamātu var attēlot kopā.
Serīns
Ilgstošas hidrolīzes laikā serīns var daļēji zaudēties.
Treonīns
Arī treonīns var daļēji sadalīties.
Cisteīns
Cisteīns var tikt pakļauts oksidatīvām izmaiņām.
Lai nodrošinātu uzticamu analīzi, var būt nepieciešama iepriekšēja oksidēšana vai pielāgota metode.
Kāpēc hidrolīzes laiks ir svarīgs?
Peptīdsaites ir pietiekami jāsadala.
Pārāk īsa hidrolīze var izraisīt:
- nepilnīgu sadalīšanu;
- pārāk zemas izmērītās aminoskābju vērtības.
Pārāk ilga hidrolīze var izraisīt:
- jutīgo aminoskābju turpmāka sadalīšanās;
- mērījumu zudumi.
Tāpēc hidrolīzes laiku un temperatūru kontrolē.
Dažkārt izmanto vairākus hidrolīzes laikus, lai izpētītu zudumus vai nepilnīgu sadalīšanu.
Kas ir molārā attiecība?
Molārā attiecība apraksta aminoskābju relatīvo skaitu.
Pieņemsim, ka peptīds teorētiski satur:
- divas alanīna molekulas;
- viens glicīns;
- trīs leicīni.
Teorētiskā molārā attiecība ir:
2 : 1 : 3
Pēc analīzes izmērītās vērtības var normalizēt.
Ja attiecība ir tuva teorētiskajai vērtībai, tas apstiprina paredzēto aminoskābju sastāvu.
Nelielas novirzes var rasties šādu iemeslu dēļ:
- mērījumu nenoteiktība;
- hidrolīzes zudumi;
- derivatizācija;
- hromatogrāfisko pīķu integrēšana.
Ko nozīmē normalizēšana?
Normalizēšanas laikā izmērītās aminoskābju vērtības pārrēķina relatīvās attiecībās.
Par atsauci var izmantot piemērotu aminoskābi.
Tādējādi izmērīto profilu var salīdzināt ar teorētisko sastāvu.
Normalizēšana ir noderīga sastāva izpētē, bet tā automātiski nenodrošina peptīda absolūto daudzumu.
Aminoskābju analīze salīdzinājumā ar HPLC tīrību
HPLC tīrība un aminoskābju analīze mēra atšķirīgas īpašības.
HPLC tīrībā parasti nosaka:
- hromatogrāfisko galveno pīķi;
- blakus pīķu relatīvo daudzumu.
Aminoskābju analīzē nosaka:
- aminoskābju sastāvs;
- izvēlēto aminoskābju daudzums;
- iespējama peptīdu kvantificēšana.
Augsta HPLC tīrība automātiski nepierāda, ka aminoskābju sastāvs ir pareizs.
Atbilstošs aminoskābju sastāvs automātiski nepierāda, ka nav ar peptīdu saistītu piemaisījumu.
Šīs metodes papildina viena otru.
Aminoskābju analīze salīdzinājumā ar masas spektrometriju
Masas spektrometrijā nosaka molekulu masas un lādiņa attiecību.
Neskartas molekulas masas mērījums var apstiprināt, ka molekulmasa atbilst teorētiskajai vērtībai.
Aminoskābju analīzē pēc sadalīšanas nosaka aminoskābju daudzumu un attiecību.
Abām metodēm ir atšķirīgas stiprās puses.
Kombinācija var sniegt vairāk informācijas par:
- identitāte;
- sastāvs;
- peptīdu saturs.
Aminoskābju analīze salīdzinājumā ar peptīda testu
Aminoskābju analīzi var izmantot arī kā testa metodi.
Peptīda tests apraksta mērķi:
noteikt peptīda daudzumu.
Aminoskābju analīze ir viena no metodēm, ar kuru šo mērķi var sasniegt.
Citas iespējamās analīzes metodes ir:
- kvantitatīvā HPLC;
- UV spektrofotometrija;
- LC-MS kvantitatīvā noteikšana;
- masas bilance.
Kāda ir pretjonu ietekme?
Pretjoni, piemēram:
- acetāts;
- hlorīds;
- TFA;
palielina liofilizētā materiāla kopējo masu.
Aminoskābju analīzē galvenokārt tiek izpētītas peptīda aminoskābju sastāvdaļas.
Tādējādi metode var palīdzēt nošķirt:
- kopējā materiāla masa;
- faktiskais peptīdu daudzums.
Pilnīgai masas bilancei var būt nepieciešamas papildu analīzes.
Kāda ir atlikušā mitruma ietekme?
Atlikušais mitrums palielina kopējo svaru, bet neietekmē aminoskābju sastāvu.
Aprēķinot tīro peptīdu saturu, mitruma analīze var sniegt papildu informāciju.
Pilnīgs masas bilances aprēķins var ietvert:
- peptīdu saturs;
- ūdens saturs;
- pretjona saturs;
- pārējās sastāvdaļas.
Vai aminoskābju analīze var atklāt piemaisījumus?
Daži novirzīti aminoskābju signāli var liecināt par neparedzētām sastāvdaļām.
Tomēr metode nav izstrādāta, lai noteiktu ikvienu iespējamo piemaisījumu.
Citi paņēmieni var būt nepieciešami, lai noteiktu:
- organiskie piemaisījumi;
- atlikušos šķīdinātājus;
- metāli;
- mikrobioloģiskais piesārņojums;
- endotoksīni.
Kas var būt norādīts COA?
Analīzes sertifikātā var būt iekļauta tāda informācija kā:
- tests: aminoskābju analīze;
- analīzes metode;
- izmērītās aminoskābju attiecības;
- teorētiskās attiecības;
- aprēķinātais peptīdu saturs;
- testēšanas datums;
- partijas numurs.
Ne katrā COA ir iekļauta aminoskābju analīze.
Ja ir veikta tikai HPLC un MS, no tā nevar iegūt pilnīgu aminoskābju kvantitatīvo noteikšanu.
Kāpēc sasaite ar partiju ir svarīga?
Aminoskābju analīzei jābūt sasaistītai ar pārbaudīto partiju.
Svarīgi dati ir:
- partijas numurs;
- produkta nosaukums;
- analīzes datums;
- laboratorija;
- analīzes metode.
Analīzes ziņojumam bez skaidras sasaistes ar partiju ir mazāka izsekojamības vērtība.
Ko nozīmē mērījuma nenoteiktība?
Katra kvantitatīvā analīze ietver mērījuma nenoteiktību.
Aminoskābju analīzē variācijas avoti var būt:
- parauga sagatavošana;
- hidrolīze;
- aminoskābju zudums;
- derivatizācija;
- kalibrēšana;
- hromatogrāfiskā atdalīšana;
- pīķu integrācija.
Tāpēc rezultātus nevajadzētu uzskatīt par absolūti nekļūdīgiem.
Kāpēc metodes validācija ir svarīga?
Metodei jābūt piemērotai paredzētajam mērķim.
Kvantitatīvā aminoskābju analīzē būtiski validācijas parametri var būt:
- pareizība;
- precizitāte;
- linearitāte;
- specifiskums;
- mērījumu diapazons;
- robustums;
- atkārtojamība.
Metode, kas ir piemērota kvalitatīvam aminoskābju profilam, automātiski nav pietiekama precīzai peptīda kvantificēšanai.
Zinātniskie ierobežojumi
Aminoskābju analīzei ir būtiski ierobežojumi.
Metode pati par sevi nenosaka:
- precīza aminoskābju secība;
- molekulārā masa;
- HPLC tīrība;
- trīsdimensiju struktūra;
- bioloģiskā aktivitāte;
- sterilitāte;
- endotoksīnu saturs.
Turklāt dažas aminoskābes hidrolīzes laikā var mainīties.
Lai visaptveroši novērtētu kvalitāti, jāapvieno vairākas analītiskās metodes.
Kopsavilkums
Aminoskābju analīzē tiek pētīts aminoskābju sastāvs un daudzums peptīdā.
Klasiskajā analīzē peptīdu ķēdi vispirms sadala hidrolīzes ceļā.
Pēc tam aminoskābes tiek:
- atdalītas;
- noteiktas;
- kvantificētas;
- salīdzinātu ar teorētisko sastāvu.
Aminoskābju analīzi var izmantot:
- aminoskābju sastāva kontroli;
- molāro attiecību novērtēšanu;
- peptīda satura kvantificēšanu;
- identitātes apstiprināšanu.
Metodei ir ierobežojumi, jo noteiktas aminoskābes hidrolīzes laikā var mainīties.
Tāpēc aminoskābju analīzi ieteicams kombinēt ar:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- peptīda tests;
- atlikušā mitruma analīze;
- pretjonu analīze.
Pētniecības atruna
Peptidera pētnieciskie peptīdi tiek piedāvāti tikai Research Use Only (RUO) nolūkiem un ir paredzēti laboratoriskiem pētījumiem un analītiskiem lietojumiem.
Nav paredzēts lietošanai cilvēkiem vai dzīvniekiem, diagnostikai, terapeitiskai lietošanai vai pašievadīšanai.
Peptīdu zināšanas un kvalitātes kontrole
Saistītie Peptidera produkti:
Liofilizēti pētnieciskie peptīdi ar partijas identifikāciju un pieejamiem analītiskās kvalitātes datiem
Saistītie iekšējie emuāra raksti:
- PB-0230 — Peptīdu tīrība un HPLC
- PB-0231 — Peptīdu masas spektrometrija
- PB-0233 — Peptīda tests: tīrība pret peptīda saturu
- PB-0234 — Atlikušais mitrums liofilizētos peptīdos
- PB-0238 — Pretjoni peptīdos
Iekšējo saišu ieteikumi:
- Saite uz PB-0233 sadaļu par aminoskābju analīzi kā peptīda testu
- Saite uz PB-0230 sadaļu par atšķirību no HPLC tīrības
- Saite uz PB-0231 sadaļu par molekulāro masu un sekvences analīzi
- Saite uz PB-0234 sadaļu par atlikušo mitrumu un peptīda neto saturu
- Saite uz PB-0238 sadaļu par pretjoniem un masas bilanci
- Saite uz Peptidera lapu ar analīžu sertifikātiem
- Saite uz pētniecisko peptīdu kolekciju