Masa spektrometrija peptīdiem izskaidrota

Masu spektrometrija peptīdiem: kā tiek pētīta molekulārā identitāte?

Pētniecības peptīdu kvalitātes kontrolē bieži apvieno vairākas analītiskās metodes. HPLC var sniegt informāciju par hromatogrāfisko tīrību, taču augsts galvenais pīķis automātiski nepierāda, ka ir klātesošs pareizais peptīds.

Lai turpinātu pētīt molekulāro identitāti, bieži izmanto masu spektrometriju.

Masu spektrometrija, ko parasti saīsina kā MS, ir analītiska metode, ar kuru mēra jonizētu molekulu masas un lādiņa attiecību. Peptīdu analīzē izmērīto molekulāro masu var salīdzināt ar teorētiski paredzamo aminoskābju secības masu.

Ja šīs vērtības sakrīt, tas apstiprina analizētā peptīda identitāti. Tomēr arī masu spektrometrija pati par sevi nesniedz pilnīgu priekšstatu par kvalitāti.

Šajā emuāra ierakstā aplūkosim, kā darbojas masu spektrometrija, kāpēc peptīdi var radīt vairākus masas signālus un kā MS rezultāti tiek interpretēti kopā ar HPLC un citām analīzes metodēm.

---

Kas ir masu spektrometrija?

Masu spektrometrija ir analītiska metode, ar kuru molekulas tiek pārvērstas lādētās daļiņās jeb jonos.

Pēc tam šie joni tiek atdalīti un izmērīti, pamatojoties uz to masas un lādiņa attiecību.

Šo attiecību apzīmē kā:

m/z

Šeit:

• m masai;
• z elektriskajam lādiņam.

Tātad masas spektrometrs ne vienmēr tieši izmēra pilnu molekulāro masu. Instruments mēra masas un lādiņa attiecību.

Lielākām molekulām, tostarp daudziem peptīdiem, var rasties vairāki lādiņi. Tādēļ viens un tas pats peptīds masas spektrā var būt redzams dažādās vietās.

---

Kāpēc peptīdu analīzē izmanto masu spektrometriju?

Peptīds sastāv no noteiktas aminoskābju secības.

Katrai aminoskābju kombinācijai ir teorētiski aprēķināma molekulārā masa.

Masu spektrometriju var izmantot, lai pārbaudītu, vai izmērītā masa atbilst šai teorētiskajai vērtībai.

MS analīze var palīdzēt:

• molekulārās identitātes apstiprināšana;
• salīdzināšana ar teorētisko molekulāro masu;
• noteiktu ķīmisko modifikāciju noteikšana;
• sadalīšanās produktu analīze;
• peptīdu variantu izpēte;
• ražošanas partiju salīdzināšana.

Atbilstoša masa apstiprina peptīda identitāti.

Tomēr rezultāts vienmēr jāvērtē kopā ar analīzes metodi un citiem kvalitātes datiem.

---

Kāda ir teorētiskā molekulārā masa?

Teorētisko molekulāro masu aprēķina, pamatojoties uz:

• aminoskābju secība;
• aminoskābju skaits;
• iespējamās ķīmiskās modifikācijas;
• molekulārā forma;
• specifiskas gala grupas.

Kad aminoskābes veido peptīdu ķēdi, rodas peptīdsaites.

Katras peptīdsaites veidošanās laikā tiek atšķelta viena ūdens molekula. Tāpēc pilna peptīda masa nav vienkārši visu atsevišķo aminoskābju masu summa.

Arī modifikācijas var ietekmēt masu.

Piemēri:

• amidēšana;
• acetilēšana;
• fosforilēšana;
• oksidēšana;
• taukskābju ķēžu pievienošana;
• disulfīda saišu veidošanās.

Tāpēc teorētiskā masa jāaprēķina precīzai molekulārajai struktūrai.

---

Ko nozīmē molekulārais svars?

Termini molekulmasa un molekulārais svars bieži tiek lietoti kā sinonīmi.

Laboratorijas pārskatos vērtību parasti norāda:

• daltons, saīsināti Da;
• kilodaltons, saīsināti kDa.

Viens daltons aptuveni atbilst viena ūdeņraža atoma masai.

Tātad peptīda, kura molekulmasa ir 3 000 Da, masa ir aptuveni 3 kDa.

Peptīdu molekulmasa var ievērojami atšķirties atkarībā no:

• ķēdes garums;
• aminoskābju sastāvs;
• ķīmiskās modifikācijas.

---

Kā darbojas masas spektrometrs?

Masas spektrometrs parasti sastāv no vairākām daļām.

1. Parauga ievadīšana

Vispirms peptīdu sagatavo un ievada instrumentā.

Parauga sagatavošana var ietekmēt:

• signāla intensitāte;
• detektējamība;
• jonu veidošanās;
• fona signāli.

2. Jonizācija

Molekulas tiek elektriski uzlādētas.

Bieži izmantotās peptīdu analīzes metodes ir:

• electrospray ionization;
• matrix-assisted laser desorption/ionization.

3. Masas analīze

Izveidotie joni tiek atdalīti pēc to masas un lādiņa attiecības.

4. Detekcija

Detektors reģistrē jonus.

5. Datu apstrāde

Izmērītie signāli tiek pārveidoti masas spektrā.

Šis spektrs satur pīķus, kas atbilst noteiktajiem joniem.

---

Kas ir electrospray ionization?

Electrospray ionization, saīsināti ESI, ir plaši izmantota peptīdu jonizācijas metode.

ESI laikā šķidrs paraugs tiek virzīts caur smalku atveri, vienlaikus pievadot elektrisko spriegumu.

Tādējādi rodas elektriski lādēti pilieni.

Kad šķīdinātājs iztvaiko, pāri paliek lādētas molekulas.

Svarīga ESI īpašība ir tā, ka lielākas molekulas var iegūt vairākus elektriskos lādiņus.

Piemēram, peptīds var būt:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Šeit M apzīmē peptīda molekulmasu.

Vairāku lādiņu dēļ vienai un tai pašai molekulai rodas dažādi m/z signāli.

---

Kāpēc vienam peptīdam ir vairāki pīķi?

Kad peptīds uzņem vairākus protonus, rodas dažādas lādiņa formas.

Pieņemsim, ka peptīda molekulmasa ir aptuveni 3 000 Da.

Iespējamie signāli tad ir aptuveni šādi:

• viens pozitīvs lādiņš: m/z aptuveni 3.001;
• divi pozitīvi lādiņi: m/z aptuveni 1.501;
• trīs pozitīvi lādiņi: m/z aptuveni 1.001.

Visi šie signāli var piederēt vienam un tam pašam peptīdam.

Programmatūra var izmantot šo lādiņu sadalījumu, lai aprēķinātu sākotnējo molekulmasu.

Šo procesu sauc par dekonvolūciju.

---

Kas ir dekonvolūcijas masas spektrs?

Neapstrādāts ESI mērījums var saturēt vairākus lādiņa pīķus.

Tas var sarežģīt interpretāciju.

Izmantojot dekonvolūcijas programmatūru, dažādās lādiņa formas tiek pārrēķinātas uz vienu aptuvenu molekulmasu.

Tādējādi dekonvolūcijas spektru var vieglāk salīdzināt ar:

• teorētisko masu;
• references standartu;
• produkta specifikācijām.

Aprēķina kvalitāte ir atkarīga no:

• signāla intensitāte;
• izšķirtspēja;
• fona troksnis;
• programmatūras iestatījumi;
• komponentu pārklāšanās.

---

Kas ir MALDI?

Ar matricu asistēta lāzera desorbcija/jonizācija, saīsināti MALDI, ir cita jonizācijas metode.

Peptīdu sajauc ar matricas materiālu un uzklāj uz mērplates.

Lāzers aktivizē matricu, izraisot peptīdu jonu veidošanos.

MALDI bieži rada galvenokārt vienkārt uzlādētus jonus.

Tādēļ spektrs var šķist vienkāršāks nekā ESI spektrs.

MALDI bieži tiek kombinēta ar lidojuma laika masas analizatoru.

Šo kombināciju dēvē par:

MALDI-TOF

---

Kas ir lidojuma laiks?

Lidojuma laika masas analizatorā jonus paātrina elektriskais lauks.

Pēc tam tie pārvietojas caur mērīšanas cauruli.

Joni ar mazāku masas un lādiņa attiecību parasti sasniedz detektoru ātrāk nekā joni ar lielāku attiecību.

Lidojuma laiku izmanto, lai aprēķinātu m/z vērtību.

TOF sistēmas var izmantot:

• peptīdu identificēšana;
• masas noteikšana;
• molekulāro variantu salīdzināšana.

Galīgā precizitāte ir atkarīga no kalibrēšanas, instrumenta iestatījumiem un parauga sagatavošanas.

---

Kas ir LC-MS?

Šķidruma hromatogrāfija–masas spektrometrija, saīsināti LC-MS, apvieno šķidruma hromatogrāfiju ar masspektrometriju.

Komponenti vispirms tiek hromatogrāfiski atdalīti.

Pēc tam atsevišķos signālus analizē masspektrometrs.

LC-MS var apvienot informāciju par:

• retences laiks;
• hromatogrāfiskais profils;
• molekulmasa;
• iespējamie piemaisījumi;
• sadalīšanās produkti.

Tādējādi LC-MS var sniegt plašāku ieskatu nekā atsevišķa HPLC vai MS analīze.

---

Kāda ir atšķirība starp HPLC un masspektrometriju?

HPLC un masspektrometrija atbild uz atšķirīgiem analītiskiem jautājumiem.

HPLC

HPLC var sniegt informāciju par:

• hromatogrāfiskā tīrība;
• konstatēto komponentu relatīvais daudzums;
• retences laiki;
• izmaiņas hromatogrāfiskajā profilā.

Masaspektrometrija

Masaspektrometrija var sniegt informāciju par:

• molekulmasa;
• iespējamā identitāte;
• ķīmiskās modifikācijas;
• noteikti sadalīšanās produkti.

Vienkāršots salīdzinājums:

Tāpēc abas metodes bieži kombinē.

---

Vai dažādiem peptīdiem var būt vienāda molekulmasa?

Jā.

Dažādām aminoskābju secībām var būt vienāda vai gandrīz vienāda kopējā masa.

Tās dažkārt sauc par izobārām struktūrām.

Tāpēc atbilstoša masa ne vienmēr pierāda, ka visa aminoskābju secība ir pareiza.

Pilnīgākai identificēšanai var būt nepieciešamas papildu metodes, piemēram:

• tandēma masaspektrometrija;
• fragmentācijas analīze;
• aminoskābju analīze;
• secības analīze;
• salīdzinājums ar references standartu.

Nepieciešamā analīzes metode ir atkarīga no vēlamās pārliecības pakāpes.

---

Kas ir tandēma masaspektrometrija?

Tandēma masaspektrometriju parasti apzīmē kā:

MS/MS

MS/MS laikā izvēlētais peptīda jons tiek tālāk fragmentēts.

Izveidotie fragmenti pēc tam tiek mērīti atkārtoti.

Fragmentācijas modelis var sniegt informāciju par:

• aminoskābju secība;
• modifikāciju atrašanās vieta;
• peptīda identitāte;
• sadalīšanās produktu struktūra.

Tādējādi MS/MS var sniegt vairāk strukturālās informācijas nekā tikai neskartas molekulas masa.

---

Kas ir peptīdu fragmenti?

Kad MS/MS laikā peptīdu ķēde pārtrūkst noteiktās vietās, veidojas fragmentjoni.

Bieži izmantotie fragmentu tipi ir:

• b joni;
• y joni.

Šo fragmentu masas var izmantot, lai rekonstruētu aminoskābju secības daļas.

Interpretācija var būt sarežģīta.

Ne katrs peptīds fragmentējas vienādi.

Faktori, kas var ietekmēt, ir:

• aminoskābju sastāvs;
• elektriskais lādiņš;
• peptīda lielums;
• fragmentācijas metode;
• ķīmiskās modifikācijas.

---

Vai masaspektrometrija var noteikt oksidāciju?

Noteiktas oksidatīvās izmaiņas izraisa izmērāmas masas izmaiņas.

Piemēram, viena skābekļa atoma pievienošana bieži rada masas pieaugumu par aptuveni 16 Da.

Tādējādi masaspektrometrija var palīdzēt identificēt noteiktus oksidācijas produktus.

Noteikšana ir atkarīga no:

• koncentrācija;
• instrumenta izšķirtspēja;
• analīzes metode;
• komponentu atdalīšana.

Ne visas oksidatīvās izmaiņas var pilnībā lokalizēt, pamatojoties tikai uz vienu masas signālu.

Tam var būt nepieciešama papildu fragmentācijas analīze.

---

Vai masaspektrometrija var noteikt peptīda daudzumu?

Ne vienmēr.

Masas signāla intensitāti ietekmē:

• jonizācijas efektivitāte;
• molekulārās īpašības;
• šķīdinātājs;
• instrumenta iestatījumi;
• citu komponentu klātbūtni.

Tāpēc divreiz spēcīgāks signāls automātiski nenozīmē, ka peptīda ir divreiz vairāk.

Uzticamai kvantificēšanai nepieciešamas validētas metodes un piemēroti standarti.

Iespējamās metodes:

• kvantitatīvā LC-MS;
• iekšējie standarti;
• izotopiski marķēti references standarti;
• kalibrēti HPLC testi.

---

Vai masas spektrometrija var pierādīt sterilitāti?

Nē.

Masas spektrometrija peptīda identitātes noteikšanai nav sterilitātes tests.

Rezultāts nesniedz tiešu informāciju par:

• baktērijas;
• sēnītes;
• mikrobioloģiskā augšana;
• produkta sterilitāte.

Sterilitātei nepieciešamas specifiskas mikrobioloģiskās testēšanas metodes.

Arī endotoksīni netiek automātiski noteikti standarta peptīdu MS analīzes laikā.

---

Vai masas spektrometrija var noteikt endotoksīnus?

Nevis ar standarta identitātes analīzi.

Endotoksīni ir sarežģītas baktēriju sastāvdaļas.

Endotoksīnu izpētei izmanto specifiskas metodes, piemēram:

• Limulus amebocītu lizāta tests;
• rekombinantā faktora C metodes.

Tāpēc pareizs peptīda masas spektrs nepierāda, ka materiālam ir zems endotoksīnu līmenis.

Identitāte, tīrība, sterilitāte un endotoksīni ir atsevišķi kvalitātes parametri.

---

Kāpēc laboratoriju rezultāti var atšķirties?

Dažādas laboratorijas var uzrādīt nedaudz atšķirīgas masas vērtības.

Iespējamie cēloņi:

• instrumenta tips;
• kalibrēšana;
• jonizācijas metodi;
• parauga sagatavošana;
• sāļu addukti;
• izmantotā programmatūra;
• izšķirtspēja;
• interpretācijas metode.

Nelielas atšķirības automātiski nenozīmē, ka rezultāts ir nepareizs.

Izmērītā vērtība jāizvērtē, ņemot vērā:

• instrumenta precizitāte;
• paredzamā molekulārā forma;
• izmantotā analīzes metode.

---

Kas ir addukti?

Masas spektrometrijas laikā peptīdu joni var saistīties ar citām lādētām daļiņām.

Piemēri:

• nātrijs;
• kālijs;
• amonijs.

Tādēļ var rasties papildu pīķi.

Piemēram, nātrija adduktam ir cita masa nekā vienkārši protonētam peptīda jonam.

Addukti automātiski nenozīmē cita peptīda klātbūtni.

Interpretācijai nepieciešamas zināšanas par:

• parauga sagatavošana;
• izmantotie buferšķīdumi;
• paredzamās jonu formas.

---

Kādai informācijai jābūt MS pārskatā?

Profesionālā analīzes pārskatā cita starpā var būt:

• peptīda nosaukumu;
• partijas vai sērijas numuru;
• teorētisko molekulmasu;
• izmērīto molekulmasu;
• jonizācijas metodi;
• masas spektrometra tipu;
• masas spektru;
• analīzes datumu;
• laboratorijas nosaukumu.

Detalizētākā analīzē var norādīt arī:

• mērījumu diapazons;
• izšķirtspēja;
• masas precizitāte;
• fragmentācijas dati;
• izmantotā programmatūra.

Nepieciešamā dokumentācija ir atkarīga no pētījuma mērķa.

---

Masas spektrometrija un partiju kontrole

Katru ražošanas partiju var pārbaudīt atsevišķi.

Partijai specifiska MS analīze palīdz nodrošināt:

• identitātes pārbaude;
• partiju salīdzinājums;
• izsekojamība;
• noviržu izpēte.

Analīzes pārskatā norādītajam partijas numuram jāatbilst identifikācijai uz flakona.

Masas spektrometriska rezultāta bez skaidras sasaistes ar partiju vērtība izsekojamības ziņā ir ierobežotāka.

---

Zinātniskie ierobežojumi

Masas spektrometrija ir jaudīga analītiskā metode, bet ne pilnīgs kvalitātes novērtējums.

Atbilstoša molekulmasa automātiski nepierāda:

• pilnīga aminoskābju secība;
• augsta hromatogrāfiskā tīrība;
• pareizs peptīda daudzums;
• sterilitate;
• zems endotoksīnu līmenis;
• bioloģiskā aktivitāte;
• ilgtermiņa stabilitāte.

Lai veiktu plašāku novērtējumu, var būt nepieciešamas vairākas metodes:

• HPLC;
• LC-MS;
• MS/MS;
• kvantitatīva analīze;
• stabilitātes pētījumi;
• mitruma analīze;
• papildu konkrētajam produktam paredzētas pārbaudes.

Rezultāti jāinterpretē kopumā.

---

Kopsavilkums

Masas spektrometriju izmanto, lai pētītu pētniecisko peptīdu molekulmasu.

Šī metode mēra jonizētu molekulu masas un lādiņa attiecību.

Peptīdu analīzē izmērīto masu var salīdzināt ar teorētiski paredzēto masu.

Atbilstība apstiprina molekulāro identifikāciju.

Svarīgākās analītiskās metodes ir:

• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;
• MS/MS.

Tomēr masas spektrometrija automātiski nesniedz informāciju par:

• precīzs daudzums;
• hromatogrāfiskā tīrība;
• sterilitate;
• endotoksīni;
• bioloģiskā aktivitāte.

Tāpēc MS bieži apvieno ar HPLC un papildu kvalitātes analīzēm.

---

Paziņojums par izmantošanu pētniecībā

Peptidera pētnieciskie peptīdi tiek piedāvāti tikai Research Use Only (RUO) vajadzībām un ir paredzēti laboratoriskiem pētījumiem un analītiskiem lietojumiem.

Nav paredzēts lietošanai cilvēkiem vai dzīvniekiem, diagnostikai, terapeitiskai lietošanai vai pašievadīšanai.

---

Kategorija:
Zināšanas par peptīdiem un kvalitātes kontrole

Saistītie Peptidera produkti:
Liofilizēti pētnieciskie peptīdi ar partijas identifikāciju un pieejamiem analītiskās kvalitātes datiem

Saistītie iekšējie emuāra raksti:

• PB-0227 — Liofilizēti peptīdi un liofilizācija
• PB-0228 — Peptīdu flakoni un iepakojuma integritāte
• PB-0229 — Partijas numuri un izsekojamība
• PB-0230 — Peptīdu tīrība un HPLC
• Kas ir analīzes sertifikāts?

Iekšējo saišu ieteikumi:

• Saite uz PB-0230 par atšķirību starp HPLC un MS
• Saite uz PB-0229 par partijai specifisku analīzi
• Saite uz COA lapu ar masas spektrometriskās testēšanas rezultātiem
• Saite uz pētniecisko peptīdu kolekciju
• Saite uz neatkarīgas laboratorijas analīzi