Aminosyreanalyse av peptider forklart
Aminosyreanalyse av peptider: sammensetning og kvantifisering forklart
Peptider består av kjeder av aminosyrer. Rekkefølgen på disse aminosyrene bestemmer en stor del av de kjemiske og strukturelle egenskapene til et peptid.
Ved kvalitetskontroll brukes ofte teknikker som HPLC og massespektrometri for å vurdere renhet og molekylmasse. En supplerende analysemetode er aminosyreanalyse, ofte forkortet til AAA.
Aminosyreanalyse kan brukes til å undersøke:
- hvilke aminosyrer som finnes i en prøve;
- hvordan de målte aminosyreforholdene samsvarer med forventet sammensetning;
- hvor mye peptid som finnes;
- om aminosyresammensetningen passer med det teoretiske peptidet;
- hvordan netto peptidinnhold kan beregnes.
Metoden fungerer annerledes enn HPLC og massespektrometri. Ved klassisk aminosyreanalyse brytes peptidkjeden først ned til enkeltstående aminosyrer. Deretter separeres, påvises og kvantifiseres disse aminosyrene.
Aminosyreanalyse kan gi verdifull informasjon, men har også begrensninger. Under nedbrytningen kan enkelte aminosyrer delvis endres eller gå tapt. Resultatene må derfor alltid tolkes i sammenheng med metoden som er brukt.
Hva er aminosyreanalyse?
Aminosyreanalyse er en laboratorieteknikk som brukes til å undersøke aminosyresammensetningen i en prøve.
Ved en klassisk analyse utføres vanligvis følgende trinn:
- prøveforberedelse;
- hydrolyse av peptidkjeden;
- frigjøring av enkeltstående aminosyrer;
- separasjon av aminosyrene;
- påvisning og kvantifisering;
- sammenligning med forventet sammensetning.
Resultatet kan vises som:
- mengde per aminosyre;
- molforhold;
- massekonsentrasjon;
- aminosyreprofil;
- beregnet peptidinnhold.
Hva er hydrolyse?
Hydrolyse er en kjemisk prosess der bindinger spaltes ved hjelp av vann.
Ved aminosyreanalyse brytes peptidbindingene ned, slik at enkeltstående aminosyrer frigjøres.
En vanlig metode er sur hydrolyse.
Prøven utsettes da for følgende i en kontrollert periode:
- sterk syre;
- økt temperatur;
- kontrollerte forhold.
Etter hydrolyse eksisterer den opprinnelige peptidkjeden ikke lenger som et intakt molekyl.
De frigjorte aminosyrene kan deretter undersøkes separat.
Hvorfor brytes peptidkjeden ned?
Et intakt peptid kan inneholde dusinvis av forskjellige aminosyrerester.
Ved å bryte ned kjeden kan den totale mengden av hver aminosyre måles.
Anta at et teoretisk peptid inneholder:
- fire alaninrester;
- to glysinrester;
- tre leucinrester;
- én tyrosinrest.
Etter hydrolyse kan det undersøkes om de målte forholdene omtrent samsvarer med denne teoretiske sammensetningen.
Dette støtter vurderingen av aminosyresammensetningen.
Hva er forskjellen mellom aminosyresammensetning og aminosyrerekkefølge?
Aminosyreanalyse måler hovedsakelig hvilke aminosyrer som er til stede, og i hvilken mengde.
Metoden bestemmer ikke automatisk den nøyaktige rekkefølgen.
To forskjellige peptider kan ha samme aminosyresammensetning, men en annen rekkefølge.
For eksempel:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Begge inneholder:
- én alanin;
- én glycinrest;
- én leucin.
Likevel er sekvensen forskjellig.
For sekvensundersøkelser trengs andre teknikker, for eksempel:
- tandem-massespektrometri;
- fragmentanalyse;
- spesifikke sekvenseringsmetoder.
Kan aminosyreanalyse bekrefte identiteten?
Aminosyreanalyse kan støtte den forventede sammensetningen.
Når den målte aminosyreprofilen avviker betydelig fra den teoretiske sammensetningen, kan dette gi grunnlag for ytterligere undersøkelser.
En samsvarende profil beviser imidlertid ikke i seg selv at den nøyaktige aminosyresekvensen er korrekt.
For en bredere identitetsvurdering kan følgende kombineres:
- molekylmasse;
- LC-MS;
- MS/MS;
- aminosyreanalyse;
- kromatografiske data.
Hvordan separeres aminosyrer?
Etter hydrolyse inneholder prøven en blanding av frie aminosyrer.
Disse må separeres analytisk fra hverandre.
Mulige teknikker er:
- ionebytterkromatografi;
- HPLC;
- UPLC;
- kapillærelektroforese.
Den valgte teknikken avhenger av:
- ønsket følsomhet;
- laboratoriemetode;
- prøvetype;
- nødvendig nøyaktighet.
Hva er derivatisering?
Mange aminosyrer har begrenset detekterbarhet uten ytterligere behandling.
Derfor kan de kjemisk kobles til en detekterbar gruppe.
Dette kalles derivatisering.
Derivatisering kan finne sted:
- før kromatografisk separasjon;
- etter kromatografisk separasjon.
De dannede derivatene kan for eksempel måles bedre med:
- UV-deteksjon;
- fluorescensdeteksjon;
- massespektrometri.
Prekolonnederivatisering
Ved prekolonnederivatisering merkes aminosyrene før den kromatografiske separasjonen.
Deretter separeres de dannede derivatene ved hjelp av en kolonne.
Mulige fordeler er:
- høy følsomhet;
- egnet fluorescensdeteksjon;
- analyse van meerdere aminozuren.
Reaksjonen må forløpe reproduserbart.
Ufullstendig derivatisering kan påvirke kvantifiseringen.
Postkolonnederivatisering
Ved postkolonnederivatisering separeres aminosyrene først.
Etter kolonnen reagerer de med et deteksjonsreagens.
Et kjent eksempel er analyse med ninhydrin.
De dannede reaksjonsproduktene kan deretter måles optisk.
Hvordan bestemmes mengden aminosyre?
Til kvantifisering brukes referansestandarder.
Standardløsninger inneholder kjente mengder aminosyrer.
Disse måles for å fastslå en sammenheng mellom:
- konsentrasjon;
- detektorsignal.
Deretter måles den ukjente prøven.
Ved hjelp av kalibreringsdataene kan mengden av hver aminosyre beregnes.
Hva er en intern standard?
En intern standard er et kjent stoff som tilsettes prøver og kalibreringsløsninger.
Denne kan bidra til å korrigere for variasjon under:
- prøvepreparering;
- injeksjon;
- derivatisering;
- analyse.
Den interne standarden må kunne skilles tydelig analytisk fra aminosyrene som undersøkes.
Hvordan kan aminosyreanalyse bestemme peptidinnhold?
Når aminosyresammensetningen til et peptid er kjent, kan utvalgte aminosyrer brukes til å beregne mengden peptid.
Anta at hver peptidkjede inneholder nøyaktig fire alaninrester.
Når den totale mengden alanin måles, kan man anslå hvor mange peptidkjeder som var til stede.
Beregningen tar hensyn til:
- antall rester per peptid;
- molekylmasse;
- målt mengde aminosyre;
- analysemetode.
Dette kan brukes til en kvantitativ peptidanalyse.
Hvorfor brukes ikke alltid alle aminosyrer?
Ikke alle aminosyrer egner seg like godt til kvantifisering.
Noen aminosyrer kan under hydrolyse:
- brytes delvis ned;
- endres kjemisk;
- frigjøres ufullstendig;
- måles pålitelig.
Derfor velges ofte stabile aminosyrer.
Valget avhenger av peptidsekvensen og analysemetoden.
Hvilke aminosyrer kan endres under hydrolyse?
Sur hydrolyse kan ha flere ulike effekter.
Tryptofan
Tryptofan kan i stor grad brytes ned under standard sur hydrolyse.
Derfor er tilpassede metoder nødvendige når tryptofan skal måles spesifikt.
Asparagin
Asparagin kan omdannes til aspartat under hydrolyse.
Derfor rapporteres asparagin og aspartat ikke alltid separat ved klassisk analyse.
Glutamin
Glutamin kan omdannes til glutamat.
Dette gjør at glutamin og glutamat kan vises samlet.
Serine
Serin kan delvis gå tapt under langvarig hydrolyse.
Treonin
Også treonin kan degraderes delvis.
Cystein
Cystein kan gjennomgå oksidative endringer.
For pålitelig analyse kan forhåndsoksidasjon eller en tilpasset metode være nødvendig.
Hvorfor er hydrolysetid viktig?
Peptidbindingene må brytes tilstrekkelig ned.
For kort hydrolyse kan føre til:
- ufullstendig nedbrytning;
- for lave målte aminosyreverdier.
For lang hydrolyse kan føre til:
- ytterligere nedbrytning av følsomme aminosyrer;
- måletap.
Derfor kontrolleres hydrolysetid og temperatur.
Noen ganger brukes flere hydrolysetider for å undersøke tap eller ufullstendig nedbrytning.
Hva er et molforhold?
Et molforhold beskriver de relative mengdene av aminosyrer.
Anta at et peptid teoretisk inneholder:
- to alaninrester;
- én glycinrest;
- tre leucinrester.
Det teoretiske molforholdet er:
2 : 1 : 3
Etter analysen kan målte verdier normaliseres.
Når forholdet ligger nær den teoretiske verdien, støtter dette den forventede aminosyresammensetningen.
Små avvik kan oppstå på grunn av:
- måleusikkerhet;
- hydrolysetap;
- derivatisering;
- integrering av kromatografiske topper.
Hva betyr normalisering?
Ved normalisering omregnes målte aminosyreverdier til relative forhold.
En egnet aminosyre kan brukes som referanse.
Dermed kan den målte profilen sammenlignes med den teoretiske sammensetningen.
Normalisering er nyttig for sammensetningsanalyse, men gir ikke automatisk den absolutte peptidmengden.
Aminosyreanalyser versus HPLC-renhet
HPLC-renhet og aminosyresammensetning måler ulike egenskaper.
HPLC-renhet undersøker vanligvis:
- kromatografisk hovedtopp;
- relativ mengde av bip topper.
Aminosyreanalyser undersøker:
- aminosyresammensetning;
- mengden av utvalgte aminosyrer;
- mulig peptidkvantifisering.
Høy HPLC-renhet beviser ikke automatisk at aminosyresammensetningen er korrekt.
En passende aminosyresammensetning beviser ikke automatisk at det ikke finnes peptidrelaterte urenheter.
Teknikkene utfyller hverandre.
Aminosyreanalyser versus massespektrometri
Massespektrometri undersøker masse-ladningsforholdet til molekyler.
En intakt massebestemmelse kan støtte at molekylmassen samsvarer med den teoretiske verdien.
Aminosyreanalyser undersøker mengden og forholdet mellom aminosyrer etter nedbrytning.
Begge teknikkene har ulike styrker.
En kombinasjon kan gi mer informasjon om:
- identitet;
- sammensetning;
- peptidinnhold.
Aminosyreanalyse kontra peptidassay
Aminosyreanalyse kan selv brukes som assaymetode.
En peptidassay beskriver målet:
bestemme mengden peptid.
Aminosyreanalyse er én av teknikkene som kan brukes til å oppnå dette målet.
Andre mulige assaymetoder er:
- kvantitativ HPLC;
- UV-spektrofotometri;
- LC-MS-kvantifisering;
- massebalanse.
Hvilken innvirkning har motioner?
Motioner som:
- acetat;
- klorid;
- TFA;
bidrar til den totale massen av frysetørket materiale.
Ved aminosyreanalyse undersøkes først og fremst peptidets aminosyrekomponenter.
Dermed kan metoden bidra til å skille mellom:
- total materialmasse;
- faktisk peptidmengde.
For en fullstendig massebalanse kan det være nødvendig med ytterligere analyser.
Hvilken innvirkning har restfuktighet?
Restfuktighet bidrar til totalvekten, men ikke til aminosyresammensetningen.
Når netto peptidinnhold beregnes, kan fuktighetsanalyse gi tilleggsinformasjon.
En fullstendig massebalanse kan bestå av:
- peptidinnhold;
- vanninnhold;
- motioneinnhold;
- øvrige komponenter.
Kan aminosyreanalyse påvise kontaminering?
Enkelte avvikende aminosyresignaler kan tyde på uventede komponenter.
Metoden er imidlertid ikke utformet for å påvise all mulig kontaminering.
Andre teknikker kan være nødvendige for:
- organiske urenheter;
- restløsemidler;
- metaller;
- mikrobiologisk kontaminering;
- endotoksiner.
Hva kan stå i et analysecertifikat?
Et analysecertifikat kan inneholde informasjon som:
- test: aminosyreanalyse;
- analysemetode;
- målte aminosyreforhold;
- teoretiske forhold;
- beregnet peptidinnhold;
- testdato;
- partinummer.
Ikke alle analysecertifikater inneholder aminosyreanalyse.
Når bare HPLC og MS er utført, kan det ikke utledes en fullstendig kvantifisering av aminosyrer.
Hvorfor er kobling til parti viktig?
En aminosyreanalyse må være knyttet til partiet som er undersøkt.
Viktige opplysninger er:
- lotnummer;
- produktnavn;
- analysedato;
- laboratorium;
- analysemetode.
En analyserapport uten tydelig kobling til et parti har mindre verdi for sporbarheten.
Hva betyr måleusikkerhet?
All kvantitativ analyse inneholder måleusikkerhet.
Ved aminosyreanalyse kan variasjonskilder være:
- prøvepreparering;
- hydrolyse;
- tap av aminosyrer;
- derivatisering;
- kalibrering;
- kromatografisk separasjon;
- toppintegrasjon.
Derfor må resultater ikke betraktes som absolutt feilfrie.
Hvorfor er metodevalidering viktig?
En metode må være egnet for det tiltenkte formålet.
Ved kvantitativ aminosyreanalyse kan relevante valideringsparametere være:
- nøyaktighet;
- presisjon;
- linearitet;
- spesifisitet;
- måleområde;
- robusthet;
- reproduserbarhet.
En metode som er egnet for en kvalitativ aminosyreprofil, er ikke automatisk tilstrekkelig for nøyaktig kvantifisering av peptider.
Vitenskapelige begrensninger
Aminosyreanalyse har viktige begrensninger.
Metoden fastslår ikke selvstendig:
- nøyaktig aminosyresekvens;
- molekylmasse;
- HPLC-renhet;
- tredimensjonal struktur;
- biologisk aktivitet;
- sterilitet;
- endotoksininnhold.
I tillegg kan enkelte aminosyrer endres under hydrolyse.
For en bred kvalitetsvurdering må flere analyseteknikker kombineres.
Sammendrag
Aminosyreanalyse undersøker sammensetningen og mengden av aminosyrer i et peptid.
Ved klassisk analyse brytes peptidkjeden først ned gjennom hydrolyse.
Deretter blir aminosyrene:
- separert;
- detektert;
- kvantifisert;
- sammenlignet med den teoretiske sammensetningen.
Aminosyreanalyse kan brukes til:
- kontroll av aminosyresammensetning;
- vurdering av molforhold;
- kvantifisering av peptidinnhold;
- støtte for identitet.
Metoden har begrensninger fordi enkelte aminosyrer kan endres under hydrolyse.
Derfor kombineres aminosyreanalyse helst med:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- peptidanalyse;
- analyse av restfuktighet;
- motionanalyse.
Forskningsfraskrivelse
Peptideras forskningspeptider tilbys utelukkende for Research Use Only (RUO) og er beregnet på laboratorieforskning og analytiske bruksområder.
Ikke beregnet for konsum av mennesker eller dyr, diagnostisk bruk, terapeutisk bruk eller selvinjeksjon.
Peptidkunnskap og kvalitetskontroll
Relaterte Peptidera-produkter:
Frysetørkede forskningspeptider med batchidentifikasjon og tilgjengelige analytiske kvalitetsdata
Relaterte interne blogger:
- PB-0230 — Peptidrenhet og HPLC
- PB-0231 — Massespektrometri av peptider
- PB-0233 — Peptidanalyse: renhet versus peptidinnhold
- PB-0234 — Restfuktighet i frysetørkede peptider
- PB-0238 — Motioner i peptider
Forslag til interne lenker:
- Lenke til PB-0233 om aminosyreanalyse som peptidanalyse
- Lenke til PB-0230 om forskjellen fra HPLC-renhet
- Lenke til PB-0231 om molekylmasse og sekvensanalyse
- Lenke til PB-0234 om restfuktighet og netto peptidinnhold
- Lenke til PB-0238 om motioner og massebalanse
- Lenke til Peptideras side med analysesertifikater
- Lenke til samlingen av forskningspeptider