Massepektrometri forklart for peptider
Massespektrometri av peptider: hvordan undersøkes den molekylære identiteten?
Ved kvalitetskontroll av forskningspeptider kombineres ofte flere analytiske teknikker. HPLC kan gi informasjon om kromatografisk renhet, men en høy hovedtopp beviser ikke automatisk at riktig peptid er til stede.
For å undersøke den molekylære identiteten nærmere brukes ofte massespektrometri.
Massespektrometri, vanligvis forkortet til MS, er en analyseteknikk som måler masse-ladningsforholdet til ioniserte molekyler. Ved peptidanalyse kan den målte molekylmassen sammenlignes med den teoretisk forventede massen til aminosyresekvensen.
Når disse verdiene samsvarer, støtter det identifiseringen av peptidet som undersøkes. Likevel gir heller ikke massespektrometri alene et fullstendig bilde av kvaliteten.
I dette blogginnlegget gjennomgår vi hvordan massespektrometri fungerer, hvorfor peptider kan produsere flere massesignaler, og hvordan MS-resultater tolkes sammen med HPLC og andre analysemetoder.
Hva er massespektrometri?
Massespektrometri er en analyseteknikk der molekyler omdannes til ladde partikler, såkalte ioner.
Disse ionene separeres og måles deretter basert på deres masse-ladningsforhold.
Dette forholdet angis som:
m/z
Her står:
- m for masse;
- z for elektrisk ladning.
Et massespektrometer måler derfor ikke alltid den fullstendige molekylmassen direkte. Instrumentet måler forholdet mellom masse og ladning.
Ved større molekyler, inkludert mange peptider, kan det oppstå flere ladninger. Derfor kan det samme peptidet være synlig på flere steder i massespekteret.
Hvorfor brukes massespektrometri i peptidanalyse?
Et peptid består av en spesifikk rekkefølge av aminosyrer.
Hver aminosyrekombinasjon har en teoretisk beregnbar molekylmasse.
Massespektrometri kan brukes til å undersøke om den målte massen samsvarer med denne teoretiske verdien.
MS-analyse kan bidra til:
- bekreftelse av molekylær identitet;
- sammenligning med den teoretiske molekylmassen;
- påvisning av bestemte kjemiske modifikasjoner;
- analyse av nedbrytningsprodukter;
- undersøkelse av peptidvarianter;
- sammenligning mellom produksjonsbatcher.
En samsvarende masse støtter identiteten til et peptid.
Resultatet må imidlertid alltid vurderes i kombinasjon med analysemetoden og andre kvalitetsdata.
Hva er den teoretiske molekylmassen?
Den teoretiske molekylmassen beregnes basert på:
- aminosyresekvensen;
- antallet aminosyrer;
- eventuelle kjemiske modifikasjoner;
- molekylformen;
- spesifikke endegrupper.
Når aminosyrer danner en peptidkjede sammen, oppstår peptidbindinger.
Under dannelsen av hver peptidbinding spaltes et vannmolekyl av. Derfor er massen til et fullstendig peptid ikke ganske enkelt summen av alle de frie aminosyrene.
Også modifikasjoner kan påvirke massen.
Eksempler er:
- amidering;
- acetylering;
- fosforylering;
- oksidasjon;
- tilsetting av fettsyrekjeder;
- dannelse av disulfidbroer.
Den teoretiske massen må derfor beregnes for den nøyaktige molekylstrukturen.
Hva betyr molekylvekt?
Begrepene molekylmasse og molekylvekt brukes ofte om hverandre.
I laboratorierapporter angis verdien vanligvis i:
- dalton, forkortet Da;
- kilodalton, forkortet kDa.
Én dalton tilsvarer omtrent massen til ett hydrogenatom.
Et peptid med en molekylmasse på 3 000 Da har dermed en masse på omtrent 3 kDa.
Peptidenes molekylmasse kan variere betydelig, avhengig av:
- kjedelengde;
- aminosyresammensetning;
- kjemiske modifikasjoner.
Hvordan fungerer et massespektrometer?
Et massespektrometer består vanligvis av flere deler.
1. Prøveintroduksjon
Peptidet klargjøres først og føres inn i instrumentet.
Prøveprepareringen kan påvirke:
- signalstyrke
- detekterbarhet;
- dannelse av ioner;
- bakgrunnssignaler.
2. Ionisering
Molekylene lades elektrisk.
Vanlige teknikker for peptidanalyse er:
- electrospray ionization;
- matrix-assisted laser desorption/ionization.
3. Masseanalyse
De dannede ionene separeres basert på masse-ladningsforholdet.
4. Deteksjon
Detektoren registrerer ionene.
5. Databehandling
De målte signalene omdannes til et massespektrum.
Dette spekteret inneholder topper som tilsvarer detekterte ioner.
Hva er electrospray ionization?
Electrospray ionization, forkortet ESI, er en mye brukt ioniseringsteknikk for peptider.
Under ESI føres en væskeprøve gjennom en liten åpning mens det påføres en elektrisk spenning.
Dette danner elektrisk ladede dråper.
Når løsemiddelet fordamper, blir ladede molekyler igjen.
Et viktig kjennetegn ved ESI er at større molekyler kan få flere elektriske ladninger.
Et peptid kan for eksempel forekomme som:
- [M+H]⁺;
- [M+2H]²⁺;
- [M+3H]³⁺.
Her står M for peptidets molekylmasse.
Flere ladninger gir ulike m/z-signaler for samme molekyl.
Hvorfor har ett peptid flere topper?
Når et peptid tar opp flere protoner, oppstår ulike ladningsformer.
Anta at et peptid har en molekylmasse på omtrent 3 000 Da.
Mulige signaler er da omtrent:
- én positiv ladning: m/z rundt 3.001
- to positive ladninger: m/z rundt 1.501
- tre positive ladninger: m/z rundt 1.001
Disse signalene kan alle tilhøre det samme peptidet.
Programvaren kan bruke denne ladningsfordelingen til å beregne den opprinnelige molekylmassen.
Denne prosessen kalles dekonvolusjon.
Hva er et dekonvoluert massespektrum?
En rå ESI-måling kan inneholde flere ladningstopper.
Det kan gjøre tolkningen kompleks.
Med dekonvolusjonsprogramvare omregnes de ulike ladningsformene til én estimert molekylmasse.
Det dekonvoluerte spekteret kan derfor enklere sammenlignes med:
- den teoretiske massen
- en referansestandard
- produktspesifikasjoner
Kvaliteten på beregningen avhenger av:
- signalstyrke
- oppløsning;
- bakgrunnsstøy
- programvareinnstillinger
- tilstedeværelse av overlappende komponenter
Hva er MALDI?
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, forkortet MALDI, er en annen ioniseringsteknikk.
Peptidet blandes med et matriksmateriale og påføres en måleplate.
En laser aktiverer matrisen, slik at peptidioner dannes.
MALDI produserer ofte hovedsakelig enkeltladede ioner.
Dette kan gjøre spekteret enklere enn et ESI-spekter.
MALDI kombineres ofte med en time-of-flight-masseanalysator.
Denne kombinasjonen betegnes som:
MALDI-TOF
Hva er time-of-flight?
I en time-of-flight-masseanalysator akselereres ioner av et elektrisk felt.
Deretter beveger de seg gjennom et målerør.
Ioner med et lavere masse-til-ladningsforhold når vanligvis detektoren raskere enn ioner med et høyere forhold.
Flyvetiden brukes til å beregne m/z-verdien.
TOF-systemer kan brukes til:
- peptididentifikasjon
- massebestemmelse
- sammenligning av molekylære varianter
Den endelige nøyaktigheten avhenger av kalibrering, instrumentinnstillinger og prøvepreparering.
Hva er LC-MS?
Væskekromatografi-massespektrometri, forkortet LC-MS, kombinerer væskekromatografi med massespektrometri.
Komponentene separeres først kromatografisk.
Deretter analyseres de enkelte signalene av massespektrometeret.
LC-MS kan kombinere informasjon om:
- retensjonstid
- kromatografisk profil
- molekylmasse;
- mulige urenheter
- nedbrytningsprodukter
Dette gjør at LC-MS kan gi mer innsikt enn en separat HPLC- eller MS-analyse.
Hva er forskjellen mellom HPLC og massespektrometri?
HPLC og massespektrometri besvarer ulike analytiske spørsmål.
HPLC
HPLC kan gi informasjon om:
- kromatografisk renhet;
- relativ mengde av detekterte komponenter
- retensjonstider
- endringer i det kromatografiske profil
Massespektrometri
Massespektrometri kan gi informasjon om:
- molekylmasse;
- mulig identitet;
- kjemiske modifikasjoner;
- bestemte nedbrytningsprodukter.
En forenklet sammenligning:
| Analytisk spørsmål | HPLC | Massespektrometri |
|---|---|---|
| Hvor mange kromatografiske komponenter er synlige? | Ja | Begrenset |
| Hva er den relative hovedtoppen? | Ja | Ikke primært |
| Samsvarer massen med det forventede peptidet? | Nei | Ja |
| Kan identiteten underbygges? | Begrenset | Ja |
| Fastsettes den nøyaktige mengden i hetteglasset? | Ikke automatisk | Ikke automatisk |
| Undersøkes sterilitet? | Nei | Nei |
Derfor kombineres ofte begge teknikkene.
Kan samme molekylmasse forekomme hos ulike peptider?
Ja.
Ulike aminosyresekvenser kan ha samme eller nesten samme totale masse.
Dette kalles noen ganger isobare strukturer.
En tilsvarende masse beviser derfor ikke alltid at hele aminosyresekvensen er korrekt.
For en mer omfattende identifisering kan det være nødvendig med supplerende teknikker, for eksempel:
- tandem-massespektrometri;
- fragmenteringsanalyse;
- aminosyreanalyse;
- sekvensanalyse;
- sammenligning med en referansestandard.
Den nødvendige analysemetoden avhenger av ønsket sikkerhet.
Hva er tandem-massespektrometri?
Tandem-massespektrometri skrives vanligvis som:
MS/MS
Under MS/MS fragmenteres et utvalgt peptidion ytterligere.
De dannede fragmentene måles deretter på nytt.
Fragmenteringsmønsteret kan gi informasjon om:
- aminosyresekvens;
- lokalisering av modifikasjoner;
- peptididentitet;
- strukturen til nedbrytningsprodukter.
MS/MS kan dermed gi mer strukturell informasjon enn bare den intakte molekylmassen.
Hva er peptidfragmenter?
Når en peptidkjede brytes på bestemte steder under MS/MS, dannes fragmentioner.
Vanlige fragmenttyper er:
- b-ioner;
- y-ioner.
Massene til disse fragmentene kan brukes til å rekonstruere deler av aminosyresekvensen.
Tolkningen kan være kompleks.
Ikke alle peptider fragmenteres på samme måte.
Faktorer som kan ha innvirkning, er:
- aminosyresammensetning;
- elektrisk ladning;
- peptidstørrelse;
- fragmenteringsmetode;
- kjemiske modifikasjoner.
Kan massespektrometri påvise oksidasjon?
Bestemte oksidative endringer forårsaker en målbar masseendring.
Tilsetning av ett oksygenatom fører for eksempel ofte til en masseøkning på omtrent 16 Da.
Dette gjør at massespektrometri kan bidra til å identifisere bestemte oksidasjonsprodukter.
Deteksjonen avhenger av:
- konsentrasjon;
- instrumentoppløsning;
- analysemetode;
- separasjon av komponenter.
Ikke alle oksidative endringer kan lokaliseres fullstendig utelukkende på grunnlag av ett massesignal.
Det kan kreve en supplerende fragmenteringsanalyse.
Kan massespektrometri bestemme mengden peptid?
Ikke automatisk.
Intensiteten til et massesignal påvirkes av:
- ioniseringseffektivitet;
- molekylære egenskaper;
- løsemiddel;
- instrumentinnstillinger;
- tilstedeværelse av andre komponenter.
Et dobbelt så sterkt signal betyr derfor ikke automatisk at det er dobbelt så mye peptid til stede.
For pålitelig kvantifisering kreves validerte metoder og egnede standarder.
Mulige teknikker er:
- kvantitativ LC-MS;
- interne standarder;
- isotopisk merkede referanser;
- kalibrerte HPLC-analyser.
Kan massespektrometri påvise sterilitet?
Nei.
Massespektrometri for peptididentitet er ikke en sterilitetstest.
Resultatet gir ingen direkte informasjon om:
- bakterier;
- sopp;
- mikrobiell vekst;
- produktets sterilitet.
Sterilitet krever spesifikke mikrobiologiske testmetoder.
Endotoksiner bestemmes heller ikke automatisk under en standard peptid-MS-analyse.
Kan massespektrometri måle endotoksiner?
Ikke gjennom en standard identitetsanalyse.
Endotoksiner er komplekse bakteriekomponenter.
Til endotoksinundersøkelser brukes spesifikke metoder, for eksempel:
- Limulus Amebocyte Lysate-test;
- rekombinante faktor C-metoder.
Et korrekt massespektrum av et peptid beviser derfor ikke at materialet har et lavt endotoksinnivå.
Identitet, renhet, sterilitet og endotoksiner er separate kvalitetsparametere.
Hvorfor kan laboratorieresultater variere?
Ulike laboratorier kan rapportere litt avvikende masseverdier.
Mulige årsaker er:
- instrumenttype;
- kalibrering;
- ioniseringsmetode;
- prøvepreparering;
- saltaddukter;
- brukt programvare;
- oppløsning;
- tolkningsmetode.
Små forskjeller betyr ikke automatisk at et resultat er feil.
Den målte verdien må vurderes innenfor:
- instrumentnøyaktighet;
- forventet molekylform;
- brukt analysemetode.
Hva er addukter?
Under massespektrometri kan peptidioner binde seg til andre ladede partikler.
Eksempler er:
- natrium;
- kalium;
- ammonium.
Dette kan føre til ytterligere topper.
Et natriumaddukt har for eksempel en annen masse enn et enkelt protonert peptidion.
Addukter betyr ikke automatisk at et annet peptid er til stede.
Tolkningen krever kunnskap om:
- prøvepreparering;
- brukte buffere;
- forventede ion former.
Hvilken informasjon hører hjemme i en MS-rapport?
En profesjonell analyserapport kan blant annet inneholde:
- peptidets navn;
- batch- eller lotnummer;
- teoretisk molekylmasse;
- målt molekylmasse;
- ioniseringsmetode;
- type massespektrometer;
- massespektrum;
- analysedato;
- laboratoriets navn.
Ved mer omfattende analyser kan også følgende oppgis:
- måleområde;
- oppløsning;
- massenøyaktighet;
- fragmenteringsdata;
- brukt programvare.
Den nødvendige rapporteringen avhenger av forskningsformålet.
Massespektrometri og batchkontroll
Hver produksjonsbatch kan undersøkes separat.
Batchspesifikk MS-analyse støtter:
- identitetskontroll;
- sammenligning mellom batcher;
- sporbarhet;
- undersøkelse av avvik.
Batchnummeret på analyserapporten må samsvare med identifikasjonen på ampullen.
Et massespektrometrisk resultat uten tydelig kobling til en batch har begrenset verdi for sporbarheten.
Vitenskapelige begrensninger
Massespektrometri er en kraftig analyseteknikk, men ikke en fullstendig kvalitetsvurdering.
Et samsvarende molekylmassebevis beviser ikke automatisk:
- fullstendig aminosyresekvens;
- høy kromatografisk renhet;
- riktig mengde peptid;
- sterilitet;
- lavt endotoksininnhold;
- biologisk aktivitet;
- langsiktig stabilitet.
For en bredere vurdering kan flere metoder være nødvendige:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- kvantitativ analyse;
- stabilitetsundersøkelse;
- fuktighetsanalyse;
- supplerende produktspecifikke tester.
Resultatene må tolkes samlet.
Sammendrag
Massespektrometri brukes til å undersøke molekylmassen til forskningspeptider.
Teknikken måler masse-til-ladningsforholdet til ioniserte molekyler.
Ved peptidanalyse kan den målte massen sammenlignes med den teoretisk forventede massen.
Et samsvar støtter den molekylære identifikasjonen.
Viktige analyseteknikker er:
- ESI-MS;
- MALDI-TOF;
- LC-MS;
- MS/MS.
Massespektrometri gir imidlertid ikke automatisk informasjon om:
- nøyaktig mengde;
- kromatografisk renhet;
- sterilitet;
- endotoksiner;
- biologisk aktivitet.
Derfor kombineres MS ofte med HPLC og supplerende kvalitetsanalyser.
Forskningsansvarsfraskrivelse
Peptideras forskningspeptider tilbys utelukkende for Research Use Only (RUO) og er beregnet på laboratorieforskning og analytiske anvendelser.
Ikke beregnet for konsum av mennesker eller dyr, diagnostisk bruk, terapeutisk bruk eller egenadministrering.
Kategori:
Peptidkunnskap & kvalitetskontroll
Relaterte Peptidera-produkter:
Frysetørkede forskningspeptider med batchidentifikasjon og tilgjengelige analytiske kvalitetsdata
Relaterte interne blogger:
- PB-0227 — Frysetørkede peptider og lyofilisering
- PB-0228 — Peptidampuller og emballasjeintegritet
- PB-0229 — Batchnumre og sporbarhet
- PB-0230 — Peptidrenhet og HPLC
- Hva er et Analysis Certificate?
Forslag til interne lenker:
- Lenke til PB-0230 om forskjellen mellom HPLC og MS
- Lenke til PB-0229 om batchspesifikk analyse
- Lenke til COA-siden med massespektrometriske testresultater
- Lenke til samlingen av forskningspeptider
- Lenke til siden om uavhengig laboratorieanalyse