Peptidrenhet: hva betyr 99 % HPLC?
Peptidrenhet forklart: Hva sier en HPLC-prosent egentlig?
For forskningspeptider oppgis det ofte en renhetsprosent. Verdier som 98 %, 99 % eller 99,5 % renhet brukes regelmessig til å beskrive kvaliteten på et peptid.
En høy prosentandel virker enkel å tolke: Jo høyere tallet er, desto bedre er produktet. I praksis er peptidrenhet mer komplekst.
Et HPLC-resultat gir informasjon om den relative sammensetningen av en analysert prøve. Prosentandelen beviser imidlertid ikke automatisk:
- at det riktige peptidet er til stede;
- at aminosyresekvensen er helt korrekt;
- at den oppgitte mengden peptid i vialet stemmer;
- at materialet er sterilt;
- at det er fritt for endotoksiner;
- at alle mulige forurensninger er målt.
For å vurdere peptidkvalitet grundig må flere analytiske data vurderes samlet.
I denne bloggen ser vi på hvordan peptidrenhet måles, hva en HPLC-prosent betyr, og hvorfor renhet bare utgjør én del av en fullstendig kvalitetskontroll.
Hva betyr peptidrenhet?
Peptidrenhet beskriver hvilken andel av de detekterte peptidrelaterte komponentene som tilsvarer hovedkomponenten i den analyserte prøven.
Når et analysecertifikat for eksempel oppgir en HPLC-renhet på 99% oppgir, betyr dette vanligvis at omtrent 99 % av det integrerte kromatografiske signalet er tilordnet hovedtoppen.
Dette betyr ikke automatisk at 99 % av den totale vekten i vialet består av det ønskede peptidet.
Et vial kan inneholde andre komponenter i tillegg til peptidet, for eksempel:
- vann;
- motioner;
- salter;
- hjelpestoffer;
- restprodukter fra produksjonen;
- ikke-detekterbare komponenter.
HPLC-prosenten og den faktiske peptidmengden er derfor ulike kvalitetsparametere.
Hva er HPLC?
HPLC står for High-Performance Liquid Chromatography.
Det er en analytisk teknikk som brukes til å skille ulike kjemiske komponenter i en prøve fra hverandre.
Under en HPLC-analyse føres en oppløst prøve gjennom en kolonne. Denne kolonnen inneholder en stasjonær fase.
Væsken som strømmer gjennom kolonnen, kalles den mobile fasen.
De ulike molekylene reagerer ikke alle på samme måte med disse fasene. Derfor beveger noen komponenter seg raskere gjennom kolonnen enn andre.
Resultatet vises i et kromatogram.
Et kromatogram består vanligvis av:
- en horisontal tidsakse;
- en vertikal signalakse;
- én eller flere topper.
Hver topp representerer en detektert komponent eller gruppe av komponenter.
Hva er en retensjonstid?
Tiden en komponent trenger for å bevege seg gjennom HPLC-kolonnen og nå detektoren, kalles retensjonstiden.
Retensjonstiden kan påvirkes av:
- type HPLC-kolonne;
- sammensetning av mobilfasen;
- temperatuur;
- strømningshastighet;
- egenskaper ved peptidet;
- brukt analysemetode.
En tilsvarende retensjonstid kan bidra ved sammenligning med en referansestandard.
En retensjonstid alene er imidlertid vanligvis ikke tilstrekkelig til å bekrefte identiteten til et peptid endelig.
Ulike molekyler kan under bestemte forhold ha lignende retensjonstider.
Derfor kombineres HPLC ofte med massespektrometri.
Hvordan beregnes renhetsprosenten?
Ved mange HPLC-analyser beregnes arealet under hver kromatografiske topp.
Dette kalles peak-area integration.
Et forenklet eksempel:
- hovedtopp: 99 %;
- sidetopp A: 0,5 %;
- sidetopp B: 0,3 %;
- øvrige detekterte topper: 0,2 %.
Den rapporterte kromatografiske renheten er da omtrent 99 %.
Denne beregningen avhenger av:
- deteksjonsmetode;
- integrasjonsinnstillinger;
- valgt bølgelengde;
- analysemetode;
- deteksjonsgrense;
- prøvekonsentrasjon.
En renhetsprosent må derfor alltid tolkes i sammenheng med metoden som er brukt.
Hva betyr en hovedtopp?
Den største toppen i et kromatogram kalles ofte hovedtoppen.
For et godt karakterisert peptid forventes det at denne toppen samsvarer med det ønskede peptidet.
Dette må imidlertid bekreftes analytisk.
En stor topp beviser ikke alene at den korrekte molekylstrukturen er til stede.
For å underbygge identiteten kan supplerende teknikker brukes, for eksempel:
- For en bredere kvalitetsvurdering må HPLC-resultater kombineres med andre data, for eksempel:
- aminosyreanalyser;
- sekvensanalyse;
- kjernemagnetisk resonans;
- sammenligning med en referansestandard.
HPLC beskriver hovedsakelig prøvens kromatografiske sammensetning.
Hvilke urenheter kan oppstå under peptidsyntese?
Mange syntetiske peptider produseres ved hjelp av solid-phase peptide synthesis, vanligvis forkortet til SPPS.
Under denne prosessen kobles aminosyrer trinnvis til en voksende peptidkjede.
Ved hvert trinn kan det oppstå mindre prosessavvik.
Mulige peptidrelaterte urenheter er:
Forkortede peptidkjeder
Når en aminosyre ikke kobles korrekt, kan det oppstå en ufullstendig peptidkjede.
Dette kalles også et trunkeringsprodukt.
Deleksjonssekvenser
I en delesjonssekvens mangler én eller flere aminosyrer i den tiltenkte kjeden.
Molekylmassen avviker derfor fra massen til det ønskede peptidet.
Kjemisk modifiserte varianter
Under produksjon, rensing eller lagring kan det oppstå kjemiske endringer.
Eksempler er:
- oxidation;
- deamidering;
- hydrolys;
- isomerisering.
Rester av beskyttelsesgrupper
Under peptidsyntesen brukes midlertidige beskyttelsesgrupper for å forhindre uønskede reaksjoner.
Disse må fjernes senere.
Ufullstendig fjerning kan bidra til dannelse av sidekomponenter.
Aggregater
Peptidmolekyler kan under bestemte forhold danne større strukturer.
Ikke alle HPLC-metoder detekterer eller karakteriserer aggregering på samme måte.
Er 99 % HPLC-renhet det samme som 99 % peptidinnhold?
Nei.
Dette er et viktig skille.
HPLC-renhet beskriver vanligvis det relative forholdet mellom detekterte kromatografiske komponenter.
Peptidinnhold beskriver hvor mye faktisk peptid som finnes i forhold til det totale materialet.
Et frysetørket hetteglass kan for eksempel inneholde:
- det ønskede peptidet;
- vann;
- motioner;
- salter;
- hjelpestoffer.
Disse komponentene måles ikke nødvendigvis på samme måte under en standard HPLC-analyse.
Derfor kan en prøve ha høy kromatografisk renhet, samtidig som det totale peptidinnholdet er lavere enn HPLC-prosentandelen.
For kvantitativ bestemmelse kreves ytterligere analysemetoder.
Hva er peptidanalyse?
En analyse brukes til å bestemme mengden eller konsentrasjonen av en bestemt komponent.
Avhengig av formålet med undersøkelsen kan ulike metoder brukes.
Eksempler er:
- kvantitativ HPLC med referansestandard;
- aminosyreanalyser;
- nitrogenanalyse;
- spektroskopiske teknikker;
- massebalanseberegninger.
En analyse besvarer et annet spørsmål enn en standard renhetsanalyse.
Renhetsanalyse spør:
Hvilken andel av de detekterte peptidkomponentene tilhører hovedtoppen?
En kvantitativ analyse krever:
Hvor mye av det ønskede peptidet er faktisk til stede?
Begge opplysningene kan være relevante for en fullstendig kvalitetskarakterisering.
Hvorfor er massespektrometri viktig?
Massespektrometri, ofte forkortet til MS, måler masse-til-ladning-forholdet til ioniserte molekyler.
Ved peptidanalyse kan man undersøke om den målte molekylmassen samsvarer med den teoretisk forventede massen.
Massespektrometri kan bidra til:
- bekreftelse av identitet;
- deteksjon av bestemte modifikasjoner;
- analyse av nedbrytningsprodukter;
- peptidvariantssammenligning.
Når den målte massen samsvarer med den forventede massen, støtter dette identifikasjonen.
Likevel gir massespektrometri ikke automatisk fullstendig informasjon om:
- renhetsprosent;
- eksakt mengde;
- aminosyresekvens;
- endotoksiner;
- biologisk aktivitet.
Derfor utfyller HPLC og massespektrometri hverandre.
Hva er LC-MS?
LC-MS kombinerer væskekromatografi med massespektrometri.
Først separeres komponentene kromatografisk. Deretter undersøkes de enkelte signalene videre med massespektrometri.
Denne kombinasjonen kan gi informasjon om:
- retensjonstid;
- molekylmasse;
- mulige urenheter;
- nedbrytningsprodukter;
- kjemiske modifikasjoner.
LC-MS kan dermed gi mer analytisk informasjon enn én enkelt teknikk.
Resultatkvaliteten avhenger fortsatt av:
- prøvepreparering;
- instrumentinnstillinger;
- metodevalidering;
- referansematerialer;
- fagkyndig tolkning.
Hvorfor kan ulike laboratorier måle forskjellige resultater?
Det samme peptidet kan gi noe avvikende resultater ved ulike laboratorier.
Mulige årsaker er:
- ulike HPLC-kolonner;
- andre mobile faser;
- avvikende gradienter;
- andre deteksjonsbølgelengder;
- forskjeller i prøvepreparering;
- andre integrasjonsinnstillinger;
- instrumentvariasjon.
En forskjell betyr ikke automatisk at én analyse er feil.
For å sammenligne resultater på en god måte må også analysemetoden vurderes.
En prosentandel uten informasjon om metoden gir bare begrenset kontekst.
Hva er metodevalidering?
En analysemetode må kunne dokumenteres å være egnet til det tiltenkte formålet.
Dette kalles metodevalidering.
Mulige valideringsparametere er:
- spesifisitet;
- nøyaktighet;
- presisjon;
- linearitet;
- måleområde;
- deteksjonsgrense;
- kvantifiseringsgrense;
- robusthet.
En metode for identitetsanalyse er ikke nødvendigvis egnet for nøyaktig kvantifisering.
Derfor må det på forhånd være klart hvilket analytisk spørsmål som undersøkes.
Hva er deteksjonsgrensen?
Alle analysemetoder har en grense under hvilken en komponent ikke kan påvises pålitelig.
Dette kalles deteksjonsgrensen.
En komponent som ikke er synlig i et kromatogram, er derfor ikke automatisk helt fraværende.
Konsentrasjonen kan være lavere enn deteksjonsgrensen.
I tillegg kan visse stoffer:
- ikke reagere med den detektoren som brukes;
- falle utenfor måleområdet;
- gå tapt under prøveprepareringen;
- ikke separeres tilstrekkelig.
Utsagnet «ikke påvist» betyr derfor ikke alltid det samme som «ikke til stede».
Kan ett kromatogram manipuleras?
Ett kromatogram måste innehålla tillräcklig information för att kunna bedömas professionellt.
Viktiga uppgifter är:
- produktnamn;
- batchnummer;
- analysdatum;
- använd metod;
- detektorinställningar;
- retentionstider;
- toppintegration;
- laboratoriedata.
Endast en bild med en stor topp och en procentsats ger begränsad möjlighet till kontroll.
Även integrationsinställningar kan påverka vilka signaler som tas med i beräkningen.
Transparent rapportering är därför viktig.
Vilken information ska finnas i ett tillförlitligt analyscertifikat?
Ett analyscertifikat kan bland annat innehålla:
- peptidens namn;
- aminosyrasekvens;
- batch- eller lotnummer;
- produktionsdatum;
- testdatum;
- HPLC-resultat;
- kromatogram;
- masspektrometriskt resultat;
- teoretisk molekylmassa;
- uppmätt molekylmassa;
- använda analysmetoder;
- laboratoriets namn.
Alla analyscertifikat innehåller inte alla delar.
Vilken information som behövs beror på produkten och forskningssyftet.
Ett utförligt analyscertifikat kan ge större transparens, men tillförlitligheten beror också på analysens kvalitet.
Är hög renhet alltid nödvändig?
Den önskade renheten beror på forskningssyftet.
Vid vissa analytiska tillämpningar kan mycket små mängder sidokomponenter påverka:
- mätresultat;
- receptorstudier;
- cellstudier;
- reproducerbarhet.
En högre renhetsnivå kan då vara önskvärd.
Ändå innebär en högre procentandel inte automatiskt att alla andra kvalitetsegenskaper är bättre.
En peptid med 99,5 % HPLC-renhet kan till exempel fortfarande:
- innehålla en avvikande mängd;
- vara felaktigt lagrade;
- vara otillräckligt identifierade;
- innehålla förhöjd restfuktighet;
- ha en skadad förpackning.
Kvalitet måste därför bedömas ur flera dimensioner.
Renhet och batchskillnader
Varje produktionsbatch har sin egen produktions- och analysprocess.
Därför kan renhetsresultaten variera mellan batcher.
En analys av en batch får inte automatiskt användas som bevis för alla framtida batcher.
Batchspecifik analys stöder:
- spårbarhet;
- jämförelse;
- kvalitetskontroll;
- utredning av avvikelser.
Batchnumret på vialen måste därför överensstämma med numret på analyscertifikatet.
Renhet och stabilitet
Hög initial renhet garanterar inte att den bevaras under långvarig lagring.
Möjliga nedbrytningsprocesser är:
- oxidation;
- hydrolys;
- deamidering;
- aggregering.
Hastigheten påverkas av:
- temperatuur;
- temperatur;
- fuktighet;
- lys;
- nøyaktig peptidmengde;
- oksygen;
emballasje.
Stabilitetsundersøkelser kan brukes til å følge endringer i den kromatografiske profilen over tid.
Vitenskapelige begrensninger
Ingen enkelt analysemetode gir alene et fullstendig bilde av peptidkvaliteten.
HPLC kan gi viktig informasjon om kromatografisk renhet, men har begrensninger.
- En HPLC-prosent beviser ikke automatisk:
- identitet;
- nøyaktig peptidmengde;
- aminosyresekvens;
- sterilitet;
- endotoksininnhold;
- biologisk aktivitet;
langsiktig stabilitet.
Derfor kombineres flere analysemetoder.
- En fullstendig kvalitetsvurdering kan omfatte:
- For en bredere kvalitetsvurdering må HPLC-resultater kombineres med andre data, for eksempel:
- HPLC;
- kvantitativ analyse;
- fuktighetsanalyse;
- stabilitetsundersøkelse;
ytterligere produktspesifikke tester.
Sammendrag
Peptidrenhet er en viktig kvalitetsparameter, men en HPLC-prosent må tolkes korrekt.
En verdi på 99 % betyr vanligvis at omtrent 99 % av det integrerte kromatografiske signalet er tilordnet hovedtoppen.
- Det betyr ikke automatisk at:
- 99 % av vialets vekt består av peptid;
- identiteten er fullstendig bekreftet;
- den oppgitte mengden er korrekt;
- materialet er sterilt;
alle mulige forurensninger er utelukket.
- For en bredere kvalitetsvurdering må HPLC-resultater kombineres med andre data, for eksempel:
- massespektrometri;
- kvantitativ analyse;
- lagringsdata;
- stabilitetsundersøkelse.
Peptidkvalitet består derfor av mer enn én prosentverdi.
Forskningsdisclaimer
Peptideras forskningspeptider tilbys utelukkende for Research Use Only (RUO) og er beregnet på laboratorieforskning og analytiske bruksområder.
Ikke beregnet for konsum av mennesker eller dyr, diagnostisk bruk, terapeutisk bruk eller egenadministrering.
Kategori:
Peptidkunnskap & kvalitetskontroll
Relaterte Peptidera-produkter:
Frysetørkede forskningspeptider med batchidentifikasjon og tilgjengelige analytiske kvalitetsdata
Relaterte interne blogger:
- PB-0227 — Frysetørkede peptider og lyofilisering
- PB-0228 — Peptidvialer og emballasjeintegritet
- PB-0229 — Batchnumre og sporbarhet
- Hva er et analysertifikat?
- Hvordan testes forskningspeptider analytisk?
Forslag til interne lenker:
- Lenke til PB-0229 om batchspesifikk analyse
- Lenke til COA-siden om analysesertifikater
- Lenke til PB-0227 om stabilitet og nedbrytning
- Lenke til samlingen av forskningspeptider
- Lenke til siden om uavhengige laboratorietester
Filnavn for bilde:PB-0230-peptidezuiverheid-hplc-analyse.jpg