Обяснение на анализа на аминокиселини при пептиди

Аминокиселинен анализ на пептиди: обяснение на състава и количественото определяне

Пептидите се състоят от вериги от аминокиселини. Последователността на тези аминокиселини определя голяма част от химичните и структурните свойства на пептида.

При изследване на качеството често се използват техники като HPLC и масспектрометрия за оценка на чистотата и молекулната маса. Допълнителен аналитичен метод е аминокиселинният анализ, често съкращаван като AAA.

Аминокиселинният анализ може да се използва за изследване на:

кои аминокиселини се съдържат в дадена проба;
как измерените аминокиселинни съотношения съответстват на очаквания състав;
колко пептид е наличен;
дали аминокиселинният състав съответства на теоретичния пептид;
как може да се изчисли нетното пептидно съдържание.

Методът се различава от HPLC и масспектрометрията. При класическия аминокиселинен анализ пептидната верига първо се разгражда до отделни аминокиселини. След това тези аминокиселини се разделят, откриват и количествено определят.

Аминокиселинният анализ може да предостави ценна информация, но има и ограничения. По време на разграждането някои аминокиселини могат частично да се променят или загубят. Затова резултатите винаги трябва да се интерпретират в контекста на използвания метод.

Какво представлява аминокиселинният анализ?

Аминокиселинният анализ е лабораторна техника, чрез която се изследва аминокиселинният състав на проба.

При класическия анализ обикновено се извършват следните стъпки:

подготовка на пробата;
хидролиза на пептидната верига;
освобождаване на отделни аминокиселини;
разделяне на аминокиселините;
откриване и количествено определяне;
сравнение с очаквания състав.

Резултатът може да бъде представен като:

количество на всяка аминокиселина;
молно съотношение;
масова концентрация;
аминокиселинен профил;
изчислено пептидно съдържание.

Какво представлява хидролизата?

Хидролизата е химичен процес, при който връзките се разцепват с помощта на вода.

При аминокиселинния анализ пептидните връзки се разграждат, така че се освобождават отделни аминокиселини.

Широко използван метод е киселинната хидролиза.

При това пробата се излага на:

силна киселина;
повишена температура;
контролирани условия.

След хидролизата първоначалната пептидна верига вече не съществува като непокътната молекула.

Освободените аминокиселини могат след това да бъдат изследвани поотделно.

Защо пептидната верига се разгражда?

Един непокътнат пептид може да съдържа десетки различни аминокиселинни остатъци.

Чрез разрушаване на веригата може да се измери общото количество на всяка аминокиселина.

Да предположим, че един теоретичен пептид съдържа:

четири аланинови остатъка;
два глицинови остатъка;
три левцинови остатъка;
един тирозинов остатък.

След хидролиза може да се изследва дали измерените съотношения приблизително съответстват на теоретичния състав.

Това подпомага оценката на аминокиселинния състав.

Каква е разликата между аминокиселинния състав и аминокиселинната последователност?

Анализът на аминокиселини измерва предимно кои аминокиселини присъстват и в какво количество.

Методът не определя автоматично точната последователност.

Два различни пептида могат да имат един и същ аминокиселинен състав, но различна последователност.

Например:

Ala-Gly-Leu;
Leu-Gly-Ala.

И двете съдържат:

една аланинова аминокиселина;
един глицин;
една левцинова аминокиселина.

Въпреки това последователността е различна.

За изследване на последователността са необходими други техники, като:

тандемна масспектрометрия;
фрагментен анализ;
специфични методи за секвениране.

Може ли анализът на аминокиселини да потвърди идентичността?

Анализът на аминокиселини може да подкрепи очаквания състав.

Когато измереният аминокиселинен профил значително се отклонява от теоретичния състав, това може да даде основание за допълнително изследване.

Съответстващият профил обаче сам по себе си не доказва, че точната аминокиселинна последователност е правилна.

За по-широка оценка на идентичността могат да се комбинират:

молекулна маса;
LC-MS;
MS/MS;
анализ на аминокиселини;
хроматографски данни.

Как се разделят аминокиселините?

След хидролиза пробата съдържа смес от свободни аминокиселини.

Те трябва да бъдат аналитично разделени една от друга.

Възможните техники са:

йонобменна хроматография;
HPLC;
UPLC;
капилярна електрофореза.

Избраната техника зависи от:

желаната чувствителност;
лабораторният метод;
типът на пробата;
необходимата точност.

Какво представлява дериватизирането?

Много аминокиселини имат ограничена детектируемост без допълнителна обработка.

Затова те могат да бъдат химически свързани с детектируема група.

Това се нарича дериватизиране.

Дериватизирането може да се извърши:

преди хроматографско разделяне;
след хроматографско разделяне.

Образуваните деривати могат да бъдат измерени по-добре например чрез:

UV детектиране;
флуоресцентно детектиране;
масспектрометрия.

Предколонно дериватизиране

При предколонно дериватизиране аминокиселините се бележат преди хроматографското разделяне.

След това образуваните деривати се разделят чрез колона.

Възможните предимства са:

висока чувствителност;
подходящо флуоресцентно детектиране;
анализ на множество аминокиселини.

Реакцията трябва да протича възпроизводимо.

Непълната дериватизация може да повлияе на количественото определяне.

Дериватизация след колоната

При дериватизация след колоната аминокиселините първо се разделят.

След колоната те реагират с детекционен реагент.

Известен пример е анализът с нинхидрин.

След това образувалите се реакционни продукти могат да бъдат измерени оптически.

Как се определя количеството аминокиселина?

За количествено определяне се използват референтни стандарти.

Стандартните разтвори съдържат известни количества аминокиселини.

Те се измерват, за да се установи зависимост между:

концентрация;
сигнал на детектора.

След това се измерва неизвестната проба.

С помощта на калибровъчните данни може да се изчисли количеството на всяка аминокиселина.

Какво представлява вътрешният стандарт?

Вътрешният стандарт е известно вещество, което се добавя към пробите и калибровъчните разтвори.

Той може да помогне за коригиране на вариациите по време на:

подготовка на пробата;
инжектиране;
дериватизация;
анализ.

Вътрешният стандарт трябва да се различава добре аналитично от изследваните аминокиселини.

Как аминокиселинният анализ може да определи съдържанието на пептид?

Когато аминокиселинният състав на пептида е известен, избрани аминокиселини могат да се използват за изчисляване на количеството пептид.

Да приемем, че всяка пептидна верига съдържа точно четири аланинови остатъка.

Когато се измери общото количество аланин, от него може да се оцени колко пептидни вериги са присъствали.

Изчислението отчита:

брой остатъци в пептид;
молекулна маса;
измереното количество аминокиселина;
аналитичен метод.

Това може да се използва за количествен анализ на пептиди.

Защо не винаги се използват всички аминокиселини?

Не всяка аминокиселина е еднакво подходяща за количествено определяне.

Някои аминокиселини могат по време на хидролиза:

да се разградят частично;
да се променят химически;
да се освободят непълно;
да бъдат измерени надеждно.

Затова често се избират стабилни аминокиселини.

Изборът зависи от пептидната последователност и аналитичния метод.

Кои аминокиселини могат да се променят по време на хидролиза?

Киселинната хидролиза може да има различни ефекти.

Триптофан

Триптофанът може до голяма степен да се разгради по време на стандартна киселинна хидролиза.

Затова са необходими адаптирани методи, когато триптофанът трябва да бъде измерен специфично.

Аспарагин

Аспарагинът може да се превърне в аспартат по време на хидролиза.

Поради това при класически анализ аспарагинът и аспартатът не винаги се отчитат поотделно.

Глутамин

Глутаминът може да се превърне в глутамат.

Това позволява глутаминът и глутаматът да бъдат представени заедно.

Серин

Серинът може частично да се загуби по време на продължителна хидролиза.

Треонин

Треонинът също може частично да се разгради.

Цистеин

Цистеинът може да претърпи окислителни промени.

За надежден анализ може да е необходимо предварително окисление или адаптиран метод.

Защо времето на хидролиза е важно?

Пептидните връзки трябва да бъдат разградени достатъчно.

Твърде кратката хидролиза може да доведе до:

непълно разграждане;
твърде ниски измерени стойности на аминокиселините.

Твърде дългата хидролиза може да доведе до:

по-нататъшно разграждане на чувствителни аминокиселини;
загуби при измерването.

Затова времето и температурата на хидролизата се контролират.

Понякога се използват няколко времена на хидролиза, за да се изследват загубите или непълното разграждане.

Какво е моларно съотношение?

Моларното съотношение описва относителния брой на аминокиселините.

Да приемем, че един пептид теоретично съдържа:

два аланина;
един глицин;
три левцина.

Теоретичното моларно съотношение е:

2 : 1 : 3

След анализа измерените стойности могат да бъдат нормализирани.

Когато съотношението е близко до теоретичната стойност, това подкрепя очаквания аминокиселинен състав.

Малки отклонения могат да възникнат поради:

неопределеност на измерването;
загуба при хидролиза;
дериватизация;
интегриране на хроматографските пикове.

Какво означава нормализация?

При нормализация измерените стойности на аминокиселините се преобразуват в относителни съотношения.

Подходяща аминокиселина може да се използва като референтна.

Това позволява измереният профил да бъде сравнен с теоретичния състав.

Нормализацията е полезна за изследване на състава, но не дава автоматично абсолютното количество пептид.

Анализ на аминокиселините спрямо HPLC чистота

HPLC чистотата и анализът на аминокиселините измерват различни свойства.

HPLC чистотата обикновено изследва:

основен хроматографски пик;
относително количество на вторичните пикове.

Анализът на аминокиселините изследва:

аминокиселинен състав;
количество на избрани аминокиселини;
възможно количествено определяне на пептида.

Високата HPLC чистота не доказва автоматично, че аминокиселинният състав е правилен.

Подходящият аминокиселинен състав не доказва автоматично, че няма примеси, свързани с пептиди.

Техниките се допълват взаимно.

Анализ на аминокиселините спрямо масспектрометрия

Масспектрометрията изследва съотношението маса-заряд на молекулите.

Измерването на непокътнатата маса може да потвърди, че молекулната маса съответства на теоретичната стойност.

Анализът на аминокиселините изследва количеството и съотношението на аминокиселините след разграждане.

Двете техники имат различни силни страни.

Една комбинация може да предостави повече информация за:

идентичност;
състав;
пептидно съдържание.

Анализ на аминокиселини спрямо пептиден анализ

Анализът на аминокиселини сам по себе си може да се използва като метод за анализ.

Пептидният анализ описва целта:

определяне на количеството пептид.

Анализът на аминокиселини е една от техниките, чрез които тази цел може да бъде постигната.

Други възможни методи за анализ са:

количествен HPLC анализ;
UV-спектрофотометрия;
количествено определяне чрез LC-MS;
масов баланс.

Какво е влиянието на противойоните?

Противойони като:

ацетат;
хлорид;
TFA;

допринасят за общата маса на лиофилизирания материал.

При анализа на аминокиселини се изследват предимно аминокиселинните компоненти на пептида.

Така методът може да помогне да се направи разграничение между:

обща маса на материала;
действително количество пептид.

За пълен масов баланс може да са необходими допълнителни анализи.

Какво е влиянието на остатъчната влага?

Остатъчната влага допринася за общото тегло, но не и за аминокиселинния състав.

Когато се изчислява нетното пептидно съдържание, анализът на влагата може да предостави допълнителна информация.

Подробният масов баланс може да включва:

пептидно съдържание;
съдържание на вода;
съдържание на противойони;
други компоненти.

Може ли анализът на аминокиселини да покаже замърсители?

Някои отклоняващи се сигнали на аминокиселини могат да насочват към неочаквани компоненти.

Методът обаче не е разработен за откриване на всички възможни замърсители.

За откриването на други компоненти може да са необходими:

органични примеси;
остатъчни разтворители;
метали;
микробиологично замърсяване;
ендотоксини.

Какво може да съдържа един сертификат за анализ?

Сертификатът за анализ може да съдържа информация като:

изпитване: анализ на аминокиселини;
аналитичен метод;
измерени съотношения на аминокиселините;
теоретични съотношения;
изчислено пептидно съдържание;
дата на изпитването;
номер на партидата.

Не всеки сертификат за анализ съдържа анализ на аминокиселини.

Когато са извършени само HPLC и MS, от тях не може да се изведе пълно количествено определяне на аминокиселините.

Защо свързването с партидата е важно?

Анализът на аминокиселини трябва да е свързан с изследваната партида.

Важните данни са:

номер на лота;
наименование на продукта;
дата на анализа;
лаборатория;
аналитичен метод.

Аналитичен доклад без ясно свързване с партидата има по-ниска стойност по отношение на проследимостта.

Какво означава неопределеност на измерването?

Всеки количествен анализ включва неопределеност на измерването.

При анализа на аминокиселини източници на вариации могат да бъдат:

подготовка на пробата;
хидролиза;
загуба на аминокиселини;
дериватизация;
калибриране;
хроматографско разделяне;
интегриране на пикове.

Затова резултатите не трябва да се считат за абсолютно безгрешни.

Защо валидирането на метода е важно?

Методът трябва да е подходящ за предвидената цел.

При количествения анализ на аминокиселини релевантни характеристики за валидиране могат да бъдат:

точност;
прецизност;
линейност;
специфичност;
диапазон на измерване;
устойчивост;
възпроизводимост.

Метод, подходящ за качествен аминокиселинен профил, не е автоматично достатъчен за точно количествено определяне на пептида.

Научни ограничения

Анализът на аминокиселини има важни ограничения.

Методът не определя самостоятелно:

точна аминокиселинна последователност;
молекулна маса;
чистота по HPLC;
триизмерна структура;
биологична активност;
стерилност;
съдържание на ендотоксини.

Освен това някои аминокиселини могат да се променят по време на хидролизата.

За цялостна оценка на качеството трябва да се комбинират няколко аналитични техники.

Обобщение

Анализът на аминокиселини изследва състава и количеството на аминокиселините в даден пептид.

При класическия анализ пептидната верига първо се разгражда чрез хидролиза.

След това аминокиселините се:

разделени;
открити;
количествено определени;
сравнено с теоретичния състав.

Анализът на аминокиселини може да се използва за:

контрол на аминокиселинния състав;
оценка на моларните съотношения;
количествено определяне на пептидното съдържание;
подкрепа на идентичността.

Методът има ограничения, тъй като някои аминокиселини могат да се променят по време на хидролизата.

Затова анализът на аминокиселини за предпочитане се комбинира с:

HPLC;
LC-MS;
MS/MS;
пептиден анализ;
анализ на остатъчната влага;
анализ на противойоните.

Отказ от отговорност за изследователска употреба

Изследователските пептиди на Peptidera се предлагат изключително за Research Use Only (RUO) и са предназначени за лабораторни изследвания и аналитични приложения.

Не е предназначено за консумация от хора или животни, диагностична употреба, терапевтично приложение или самостоятелно приложение.

Познания за пептидите и контрол на качеството

Свързани продукти на Peptidera:
Лиофилизирани изследователски пептиди с идентификация на партидата и налични аналитични данни за качеството

Свързани вътрешни блогове:

PB-0230 — Чистота на пептидите и HPLC
PB-0231 — Масспектрометрия при пептидите
PB-0233 — Пептиден анализ: чистота спрямо пептидно съдържание
PB-0234 — Остатъчна влага в лиофилизирани пептиди
PB-0238 — Противойони при пептидите

Предложения за вътрешни връзки:

Връзка към PB-0233 относно анализа на аминокиселини като пептиден анализ
Връзка към PB-0230 относно разликата спрямо чистотата по HPLC
Връзка към PB-0231 относно молекулната маса и анализа на последователността
Връзка към PB-0234 относно остатъчната влага и нетното пептидно съдържание
Връзка към PB-0238 относно противойоните и масовия баланс
Връзка към страницата на Peptidera със сертификати за анализ
Връзка към колекцията от изследователски пептиди

Държава/регион

Език