Масспектрометрия при пептиди обяснена

Масспектрометрия при пептидите: как се изследва молекулната идентичност?

При контрола на качеството на изследователски пептиди често се комбинират няколко аналитични техники. HPLC може да предостави информация за хроматографската чистота, но високият основен пик не доказва автоматично наличието на правилния пептид.

За по-задълбочено изследване на молекулната идентичност често се използва масспектрометрия.

Масспектрометрията, обикновено съкращавана като MS, е аналитична техника, при която се измерва съотношението маса-заряд на йонизирани молекули. При анализа на пептиди измерената молекулна маса може да се сравни с теоретично очакваната маса на аминокиселинната последователност.

Когато тези стойности съвпадат, това подкрепя идентификацията на изследвания пептид. Въпреки това и масспектрометрията сама по себе си не дава пълна картина на качеството.

В този блог разглеждаме как работи масспектрометрията, защо пептидите могат да генерират множество масови сигнали и как резултатите от MS се интерпретират заедно с HPLC и други аналитични методи.

---

Какво представлява масспектрометрията?

Масспектрометрията е аналитична техника, при която молекулите се превръщат в заредени частици, т.е. йони.

След това тези йони се разделят и измерват въз основа на тяхното съотношение маса-заряд.

Това съотношение се представя като:

m/z

Тук:

• m за маса;
• z за електрически заряд.

Следователно масспектрометърът не винаги измерва пряко пълната молекулна маса. Уредът измерва съотношението между маса и заряд.

При по-големи молекули, включително много пептиди, могат да се образуват множество заряди. Поради това един и същ пептид може да се вижда на различни места в масовия спектър.

---

Защо се използва масспектрометрия при анализа на пептиди?

Пептидът се състои от специфична последователност от аминокиселини.

Всяка комбинация от аминокиселини има теоретично изчислима молекулна маса.

Масспектрометрията може да се използва, за да се изследва дали измерената маса съответства на тази теоретична стойност.

MS анализът може да допринесе за:

• потвърждаване на молекулната идентичност;
• сравнение с теоретичната молекулна маса;
• откриване на определени химични модификации;
• анализ на продуктите от разграждането;
• изследване на пептидни варианти;
• сравнение между производствени партиди.

Съответстващата маса подкрепя идентичността на пептида.

Резултатът обаче винаги трябва да се оценява в комбинация с метода на анализ и други данни за качеството.

---

Каква е теоретичната молекулна маса?

Теоретичната молекулна маса се изчислява въз основа на:

• аминокиселинната последователност;
• броят на аминокиселините;
• евентуални химични модификации;
• молекулната форма;
• специфични крайни групи.

Когато аминокиселините образуват пептидна верига, се създават пептидни връзки.

При образуването на всяка пептидна връзка се отделя молекула вода. Затова масата на цял пептид не е просто сборът от всички отделни аминокиселини.

Модификациите също могат да повлияят на масата.

Примери са:

• амидиране;
• ацетилиране;
• фосфорилиране;
• окисление;
• добавяне на мастни вериги;
• образуване на дисулфидни мостове.

Затова теоретичната маса трябва да се изчисли за точната молекулна структура.

---

Какво означава молекулно тегло?

Термините молекулна маса и молекулно тегло често се използват взаимозаменяемо.

В лабораторните отчети стойността обикновено се представя в:

• далтон, съкратено Da;
• килодалтон, съкратено kDa.

Един далтон приблизително съответства на масата на един водороден атом.

Следователно пептид с молекулна маса 3 000 Da има маса приблизително 3 kDa.

Молекулната маса на пептидите може да се различава значително в зависимост от:

• дължина на веригата;
• аминокиселинен състав;
• химични модификации.

---

Как работи масспектрометърът?

Масспектрометърът обикновено се състои от няколко компонента.

1. Въвеждане на пробата

Пептидът първо се подготвя и въвежда в инструмента.

Подготовката на пробата може да повлияе на:

• интензитет на сигнала;
• детектируемост;
• образуване на йони;
• фонови сигнали.

2. Йонизация

Молекулите се зареждат електрически.

Широко използвани техники за анализ на пептиди са:

• йонизация чрез електроспрей;
• матрично-асистирана лазерна десорбция/йонизация.

3. Масов анализ

Образувалите се йони се разделят въз основа на тяхното отношение маса/заряд.

4. Детекция

Детекторът регистрира йоните.

5. Обработка на данните

Измерените сигнали се преобразуват в масов спектър.

Този спектър съдържа пикове, съответстващи на откритите йони.

---

Какво представлява йонизацията чрез електроспрей?

Йонизация чрез електроспрей, съкратено ESI, е широко използвана йонизационна техника за пептиди.

По време на ESI течна проба се пропуска през фин отвор, докато се прилага електрическо напрежение.

Така се образуват електрически заредени капчици.

Когато разтворителят се изпари, остават заредени молекули.

Важна характеристика на ESI е, че по-големите молекули могат да получат множество електрически заряди.

Един пептид например може да се среща като:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Тук M означава молекулната маса на пептида.

Множеството заряди води до различни сигнали на m/z за една и съща молекула.

---

Защо един пептид има множество пикове?

Когато един пептид приема няколко протона, се образуват различни зарядови форми.

Да приемем, че един пептид има молекулна маса приблизително 3 000 Da.

Възможните сигнали са приблизително:

• един положителен заряд: m/z около 3.001;
• два положителни заряда: m/z около 1.501;
• три положителни заряда: m/z около 1.001.

Всички тези сигнали могат да принадлежат на един и същ пептид.

Софтуерът може да използва това разпределение на зарядите, за да изчисли първоначалната молекулна маса.

Този процес се нарича деконволюция.

---

Какво е деконволюиран масов спектър?

Едно необработено ESI измерване може да съдържа множество пикове на заряда.

Това може да усложни интерпретацията.

С помощта на софтуер за деконволюция различните зарядови форми се преобразуват в една приблизителна молекулна маса.

Така деконволюираният спектър може по-лесно да се сравни с:

• теоретичната маса;
• референтен стандарт;
• спецификации на продукта.

Качеството на изчислението зависи от:

• интензитет на сигнала;
• разделителна способност;
• фонов шум;
• настройки на софтуера;
• наличие на припокриващи се компоненти.

---

Какво е MALDI?

Матрично-асистирана лазерна десорбция/йонизация, съкратено MALDI, е друга техника за йонизация.

Пептидът се смесва с матричен материал и се нанася върху измервателна плака.

Лазер активира матрицата, в резултат на което се образуват пептидни йони.

MALDI често произвежда предимно еднократно заредени йони.

Така спектърът може да изглежда по-опростен от ESI спектър.

MALDI често се комбинира с масов анализатор от типа time-of-flight.

Тази комбинация се обозначава като:

MALDI-TOF

---

Какво е time-of-flight?

При масов анализатор от типа time-of-flight йоните се ускоряват от електрическо поле.

След това те преминават през измервателна тръба.

Йоните с по-ниско съотношение маса/заряд обикновено достигат детектора по-бързо от йоните с по-високо съотношение.

Времето на полета се използва за изчисляване на стойността m/z.

TOF системите могат да се използват за:

• идентифициране на пептиди;
• определяне на масата;
• сравнение на молекулни варианти.

Крайната точност зависи от калибрирането, настройките на инструмента и подготовката на пробата.

---

Какво е LC-MS?

Течна хроматография-масспектрометрия, съкратено LC-MS, комбинира течна хроматография с масспектрометрия.

Компонентите първо се разделят хроматографски.

След това отделните сигнали се анализират от масспектрометъра.

LC-MS може да комбинира информация за:

• време на задържане;
• хроматографски профил;
• молекулна маса;
• възможни примеси;
• продукти на разграждането.

Така LC-MS може да предостави повече информация от отделен HPLC или MS анализ.

---

Каква е разликата между HPLC и масспектрометрията?

HPLC и масспектрометрията отговарят на различни аналитични въпроси.

HPLC

HPLC може да предостави информация за:

• хроматографска чистота;
• относително количество на откритите компоненти;
• времена на задържане;
• промени в хроматографския профил.

Масспектрометрия

Масспектрометрията може да даде информация за:

• молекулна маса;
• възможна идентичност;
• химични модификации;
• определени продукти от разграждането.

Опростено сравнение:

Затова двете техники често се комбинират.

---

Може ли една и съща молекулна маса да се среща при различни пептиди?

Да.

Различни аминокиселинни последователности могат да имат еднаква или почти еднаква обща маса.

Понякога те се наричат изобарни структури.

Следователно съответстващата маса не винаги доказва, че пълната аминокиселинна последователност е правилна.

За по-пълна идентификация може да са необходими допълнителни техники, като:

• тандемна масспектрометрия;
• фрагментационен анализ;
• аминокиселинен анализ;
• анализ на последователността;
• сравнение с референтен стандарт.

Необходимият аналитичен метод зависи от желаната степен на сигурност.

---

Какво представлява тандемната масспектрометрия?

Тандемната масспектрометрия обикновено се изписва като:

MS/MS

По време на MS/MS избран пептиден йон се фрагментира допълнително.

Получените фрагменти след това се измерват повторно.

Моделът на фрагментация може да даде информация за:

• аминокиселинна последователност;
• местоположение на модификациите;
• идентичност на пептида;
• структура на продуктите от разграждането.

Така MS/MS може да предостави повече структурна информация от тази за непокътнатата молекулна маса.

---

Какво представляват пептидните фрагменти?

Когато пептидната верига се разкъса на определени места по време на MS/MS, се образуват фрагментни йони.

Често срещаните типове фрагменти са:

• b-йони;
• y-йони.

Масите на тези фрагменти могат да се използват за възстановяване на части от аминокиселинната последователност.

Интерпретацията може да бъде сложна.

Не всеки пептид се фрагментира по един и същи начин.

Факторите, които могат да окажат влияние, са:

• аминокиселинен състав;
• електричен заряд;
• размер на пептида;
• метод на фрагментация;
• химични модификации.

---

Може ли масспектрометрията да открива окисление?

Определени окислителни промени предизвикват измерима промяна в масата.

Например добавянето на един кислороден атом често води до увеличаване на масата с приблизително 16 Da.

По този начин масспектрометрията може да помогне за идентифицирането на определени окислителни продукти.

Откриването зависи от:

• концентрация;
• резолюция на инструмента;
• аналитичен метод;
• разделяне на компонентите.

Не всяка окислителна промяна може да бъде напълно локализирана само въз основа на един масов сигнал.

За това може да е необходим допълнителен фрагментационен анализ.

---

Може ли масспектрометрията да определи количеството пептид?

Не автоматично.

Интензитетът на масовия сигнал се влияе от:

• ефективност на йонизацията;
• молекулни свойства;
• разтворител;
• настройки на инструмента;
• наличие на други компоненти.

Следователно сигнал с два пъти по-голяма интензивност не означава автоматично, че присъства два пъти повече пептид.

За надеждно количествено определяне са необходими валидирани методи и подходящи стандарти.

Възможните техники са:

• количествен LC-MS;
• вътрешни стандарти;
• изотопно белязани референтни вещества;
• калибрирани HPLC анализи.

---

Може ли масспектрометрията да докаже стерилност?

Не.

Масспектрометрията за идентифициране на пептид не е тест за стерилност.

Резултатът не дава пряка информация за:

• бактерии;
• гъбички;
• микробиологичен растеж;
• стерилността на продукта.

Стерилността изисква специфични микробиологични методи за изпитване.

Ендотоксините също не се определят автоматично при стандартен пептиден MS анализ.

---

Може ли масспектрометрията да измерва ендотоксини?

Не чрез стандартен анализ на идентичността.

Ендотоксините са сложни бактериални компоненти.

За изследване на ендотоксини се използват специфични методи, като:

• тест с лизат от амебоцити на Limulus;
• рекомбинантни методи с фактор C.

Следователно коректният масов спектър на пептид не доказва, че материалът има ниско съдържание на ендотоксини.

Идентичността, чистотата, стерилността и ендотоксините са отделни качествени параметри.

---

Защо лабораторните резултати могат да се различават?

Различните лаборатории могат да отчетат леко различаващи се стойности на масата.

Възможните причини са:

• тип инструмент;
• калибриране;
• метод на йонизация;
• подготовка на пробата;
• солни аддукти;
• използван софтуер;
• разделителна способност;
• метод на интерпретация.

Малките разлики не означават автоматично, че резултатът е неправилен.

Измерената стойност трябва да се оценява в рамките на:

• точност на инструмента;
• очаквана молекулна форма;
• използван метод за анализ.

---

Какво представляват аддуктите?

По време на масспектрометрията пептидните йони могат да се свързват с други заредени частици.

Примери са:

• натрий;
• калий;
• амоний.

Това може да доведе до появата на допълнителни пикове.

Например натриевият аддукт има различна маса от обикновен протониран пептиден йон.

Аддуктите не означават автоматично, че присъства друг пептид.

Интерпретацията изисква познания за:

• подготовка на пробата;
• използвани буфери;
• очаквани йонни форми.

---

Каква информация трябва да съдържа един MS доклад?

Професионалният аналитичен доклад може да съдържа, наред с другото:

• име на пептида;
• номер на партида или серия;
• теоретична молекулна маса;
• измерена молекулна маса;
• метод на йонизация;
• тип масспектрометър;
• масов спектър;
• дата на анализа;
• име на лабораторията.

При по-подробен анализ могат да бъдат посочени и:

• измервателен диапазон;
• разделителна способност;
• точност на масата;
• данни за фрагментацията;
• използвания софтуер.

Необходимото отчитане зависи от целта на изследването.

---

Масспектрометрия и контрол на партидите

Всяка производствена партида може да бъде изследвана отделно.

Специфичният за партидата MS анализ подпомага:

• контрол на идентичността;
• сравнение между партиди;
• проследимост;
• изследване на отклонения.

Номерът на партидата в аналитичния доклад трябва да съвпада с идентификацията върху флакона.

Масспектрометричен резултат без ясна връзка с конкретна партида има по-ограничена стойност за проследимостта.

---

Научни ограничения

Масспектрометрията е мощна аналитична техника, но не представлява цялостна оценка на качеството.

Съответстващата молекулна маса не доказва автоматично:

• пълна аминокиселинна последователност;
• висока хроматографска чистота;
• правилно количество пептид;
• стерилност;
• ниско съдържание на ендотоксини;
• биологична активност;
• дългосрочна стабилност.

За по-широка оценка може да са необходими няколко метода:

• HPLC;
• LC-MS;
• MS/MS;
• количествен анализ;
• изследване на стабилността;
• анализ на влагата;
• допълнителни специфични за продукта тестове.

Резултатите трябва да се интерпретират съвместно.

---

Обобщение

Масспектрометрията се използва за изследване на молекулната маса на изследователските пептиди.

Техниката измерва съотношението маса-заряд на йонизирани молекули.

При анализа на пептиди измерената маса може да се сравни с теоретично очакваната маса.

Съответствието подкрепя молекулярната идентификация.

Важни аналитични техники са:

• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;
• MS/MS.

Масспектрометрията обаче не предоставя автоматично информация за:

• точно количество;
• хроматографска чистота;
• стерилност;
• ендотоксини;
• биологична активност.

Затова MS често се комбинира с HPLC и допълнителни анализи на качеството.

---

Отказ от отговорност за изследователска употреба

Изследователските пептиди на Peptidera се предлагат изключително за Research Use Only (RUO) и са предназначени за лабораторни изследвания и аналитични приложения.

Не е предназначено за консумация от хора или животни, диагностична употреба, терапевтично приложение или самостоятелно приложение.

---

Категория:
Знания за пептидите & контрол на качеството

Свързани продукти на Peptidera:
Лиофилизирани изследователски пептиди с идентификация на партидата и налични аналитични данни за качеството

Свързани вътрешни блогове:

• PB-0227 — Лиофилизирани пептиди и лиофилизация
• PB-0228 — Флакони с пептиди и целостта на опаковката
• PB-0229 — Номера на партиди и проследимост
• PB-0230 — Чистота на пептидите и HPLC
• Какво е сертификат за анализ?

Предложения за вътрешни връзки:

• Връзка към PB-0230 за разликата между HPLC и MS
• Връзка към PB-0229 за специфичния за партидата анализ
• Връзка към страницата с COA за резултатите от масспектрометричното изследване
• Връзка към колекцията от изследователски пептиди
• Връзка към страницата за независим лабораторен анализ