Обяснение на стандартите за пептидни референти
Пептидни референтни стандартни проби: защо аналитичното сравнение е важно
При анализа на качеството на изследователски пептиди често се използват техники като:
- HPLC;
- LC-MS;
- анализ на пептидното съдържание;
- анализ на аминокиселини;
- UV спектрофотометрия.
Тези инструменти генерират измервателни данни, но сигналът на детектора или хроматографският пик не притежава автоматично точно определено значение.
За надеждно идентифициране или количествено определяне на неизвестна проба тя може да бъде сравнена с материал, чиито релевантни характеристики вече са внимателно установени.
Такъв материал се нарича референтна стандартна проба.
Добре характеризирана пептидна референтна стандартна проба може да се използва за:
- идентификация;
- сравнение на времената на задържане;
- количествено определяне;
- калибриране;
- оценка на HPLC методи;
- изследване на примеси;
- анализ на продуктите от разграждането;
- подпомагане на метрологичната проследимост.
Качеството на аналитичния резултат не зависи само от лабораторния инструмент. Важни са също идентичността, чистотата, съдържанието на пептид, съхранението и документацията на използваната референтна стандартна проба.
Освен това референтната стандартна проба не е автоматично същото като произволна проба с висок HPLC процент. За количествена употреба трябва да е ясно какво количество действителен пептид присъства и кои непрептидни компоненти допринасят за общата маса.
В този блог разглеждаме какво представляват пептидните референтни стандартни проби, по какво се различават първичните и вторичните стандарти и защо аналитичното сравнение е важно за надеждния анализ на пептиди.
Какво представлява пептидната референтна стандартна проба?
Пептидна референтна стандартна проба е внимателно характеризирано вещество, което се използва като основа за сравнение по време на лабораторен анализ.
В зависимост от целта на изследването могат да бъдат определени характеристики като:
- аминокиселинна последователност;
- молекулна маса;
- идентичност;
- чистота по ВПХТ;
- пептидно съдържание;
- съдържание на вода;
- съдържание на противойони;
- наличие на релевантни примеси;
- стабилност при съхранение.
След това стандартът може да се използва за аналитично сравнение с неизвестна проба.
Необходимата характеристика зависи от приложението.
Стандартът за идентификация не винаги трябва да отговаря на точно същите изисквания като стандартът за количествен анализ.
Защо е необходимо аналитично сравнение?
Лабораторният инструмент измерва физичен или химичен сигнал.
Примерите включват:
- UV абсорбция;
- флуоресценция;
- площ на хроматографския пик;
- съотношение маса/заряд;
- интензитет на йоните.
Един сигнал не е автоматично равен на точно количество пептид.
За тази цел е необходима надеждна зависимост между:
- известно количество;
- измерен сигнал;
- неизвестна проба.
Референтна стандартна проба може да помогне за установяването на тази зависимост.
Прост пример
Да предположим, че лаборатория иска да определи количеството на пептид чрез количествена HPLC.
Лабораторията приготвя различни разтвори на характеризирана референтна стандартна проба:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Всеки разтвор се анализира.
Измерените площи на пиковете се нанасят спрямо известните концентрации.
Така се получава калибрационна крива.
След това се измерва неизвестната проба.
Концентрацията може да се изчисли чрез сравняване на сигнала на пробата с калибрационната крива.
Надеждността на това изчисление зависи, наред с другото, от:
- качество на референтния стандарт;
- правилно изчисляване на концентрацията;
- точно претегляне;
- точно пипетиране;
- линейност на метода;
- стабилност на разтворите.
Какво представлява първичният референтен стандарт?
Първичният референтен стандарт е материал, чиито значими свойства са подробно установени.
Стандартът може да бъде охарактеризиран с помощта на множество независими аналитични техники.
Възможните анализи включват:
- HPLC;
- LC-MS;
- анализ на аминокиселини;
- определяне на съдържанието на вода;
- анализ на противойона;
- ЯМР;
- елементен анализ;
- масов баланс.
Целта е с висока надеждност да се установи:
- какъв материал е наличен;
- колко е чист;
- колко от желания компонент е налично;
- кои корекционни коефициенти са необходими.
След това първичен стандарт може да се използва за квалифициране на други стандарти.
Какво представлява вторичният референтен стандарт?
Вторичният референтен стандарт се нарича също:
- работен стандарт;
- работен стандарт;
- вътрешен референтен стандарт.
Този стандарт се квалифицира чрез сравнение с първичен или официално признат референтен стандарт.
Вторичен стандарт може да се използва за рутинни лабораторни анализи.
Възможните предимства са:
- по-голяма наличност;
- по-ниски разходи;
- съхраняване на първичния стандарт;
- по-ефективна рутинна употреба.
Вторичният стандарт обаче трябва периодично да се проверява и да се съхранява правилно.
Защо първичният стандарт не се използва винаги?
Първичните стандарти могат:
- да са с ограничена наличност;
- да са скъпи;
- да се доставят в малки количества;
- да са предназначени за специфични официални аналитични методи.
Чрез квалифициране на вторичен стандарт спрямо първичен стандарт могат да се извършват рутинни изследвания, без първичният стандарт да се използва постоянно.
Надеждността зависи от качеството на квалификацията.
Какво означава квалификация на работен стандарт?
Квалификацията означава, че свойствата на работния стандарт систематично се изследват и сравняват с подходящ референтен стандарт.
Програмата за квалификация може да включва:
- контрол на идентичността;
- чистота по ВПХТ;
- анализ на пептидното съдържание;
- съдържание на вода;
- съдържание на противойони;
- сравнение на хроматограми;
- сравнение на масспектри;
- оценка на стабилността.
Необходимите изпитвания зависят от предвидената употреба.
Идентичност спрямо количествено определяне
Референтният стандарт може да изпълнява различни аналитични функции.
Стандарт за идентичност
Стандартът за идентичност се използва, за да се провери дали неизвестната проба съответства на очаквания пептид.
Възможните сравнения са:
- Време на задържане при ВПХТ;
- молекулна маса;
- масспектрометричен профил;
- спектроскопски свойства.
Количествен стандарт
Количественият стандарт се използва за определяне на количеството пептид.
За това действителното пептидно съдържание трябва да бъде известно с достатъчна надеждност.
Само високата HPLC чистота обикновено не е достатъчна за тази цел.
Защо HPLC чистотата не е достатъчна?
Например даден пептид може да има HPLC чистота 99%.
Това не означава автоматично, че 99% от общата маса се състои от пептида.
Материалът може също да съдържа:
- вода;
- ацетат;
- хлорид;
- TFA;
- соли;
- други компоненти, измерени нехроматографски.
Следователно при количествен стандарт трябва да се прави разграничение между:
- хроматографска чистота;
- обща маса на материала;
- нетно пептидно съдържание.
Какво представлява определената стойност?
Референтният стандарт може да има определена стойност.
Тази стойност описва например:
- пептидно съдържание;
- чистота;
- концентрация;
- потентност;
- количество в опаковка.
Определената стойност трябва да се основава на подходящи аналитични данни.
Може да бъде посочен и корекционен фактор.
Какво представлява корекционният фактор?
Корекционен фактор се използва за преобразуване на претегленото количество материал в действителното количество пептид.
Да предположим:
- претеглен материал: 10,0 mg;
- определено пептидно съдържание: 85%;
- действително количество пептид: 8,5 mg.
Ако тази корекция не бъде приложена, изчислената концентрация може да бъде завишена.
Защо е важно нетното пептидно съдържание?
Нетното пептидно съдържание описва дела на действителния пептид в изследвания материал.
При изчислението могат да бъдат взети предвид фактори като:
- остатъчна влага;
- противойони;
- органични компоненти;
- неорганични компоненти.
За количествен анализ това често е по-релевантно от самата HPLC чистота.
Каква е ролята на анализа на аминокиселини?
Анализът на аминокиселини може да се използва за определяне на съдържанието на пептид.
Пептидната верига се хидролизира до отделни аминокиселини.
След това избраните аминокиселини се подлагат на количествено определяне.
Когато е известно колко от тези аминокиселини се съдържат във всяка пептидна верига, количеството пептид може да бъде изчислено.
Анализът на аминокиселини по този начин може да допринесе за определянето на стойността на референтен стандарт.
Каква е ролята на масспектрометрията?
Масспектрометрията може да помогне за потвърждаването на:
- молекулна маса;
- идентичност;
- определени модификации;
- продукти на разграждането.
LC-MS може да комбинира хроматографско разделяне с масдетекция.
Съответстващата молекулна маса подкрепя идентичността, но сама по себе си не доказва:
- точно количество пептид;
- пълна последователност;
- отсъствие на всички примеси.
Затова често се комбинират няколко техники.
Каква е ролята на MS/MS?
При тандемна масспектрометрия избран пептиден йон се фрагментира.
Фрагментите могат да предоставят информация за аминокиселинната последователност.
MS/MS може по този начин да осигури допълнителна подкрепа за:
- потвърждение на последователността;
- локализиране на модификациите;
- идентифициране на продуктите на разграждане.
Аналитичната способност зависи от:
- размер на пептида;
- фрагментация;
- разделителна способност на инструмента;
- обработка на данни.
Каква е ролята на HPLC?
HPLC може да се използва за:
- сравнение на времената на задържане;
- оценка на хроматографската чистота;
- изследване на допълнителните пикове;
- количествен анализ;
- изследване на стабилността.
При сравнението референтният материал и пробата трябва да бъдат анализирани по един и същ контролиран метод.
Важните параметри са:
- тип колона;
- мобилна фаза;
- Затова могат да бъдат определени условия за:
- дебит;
- дължина на вълната за детекция.
Какво представлява калибрационната крива?
Калибрационната крива описва връзката между известните концентрации и измерените сигнали на детектора.
Надеждната калибрационна крива трябва да бъде оценена по:
- линейност;
- измервателен диапазон;
- възпроизводимост;
- отклонения;
- пригодност за аналитичния метод.
Неизвестната концентрация се изчислява в рамките на валидирания измервателен диапазон.
Екстраполирането извън този диапазон може да доведе до допълнителна неопределеност.
Какво представлява линейността?
Линейността описва до каква степен измереният сигнал се променя пропорционално на концентрацията.
Когато концентрацията се удвои, в рамките на линеен диапазон се очаква съответна промяна на сигнала.
Връзката не е задължително линейна за всеки метод във всеки концентрационен диапазон.
Затова съответният измервателен диапазон се изследва експериментално.
Какво означава аналитична проследимост?
Аналитичната или метрологичната проследимост описва как даден резултат от измерване е свързан с признат референтен обект чрез документирана верига от сравнения.
Важните компоненти са:
- използвания стандарт;
- сертификат;
- номер на партидата;
- калибриране;
- аналитичен метод;
- измервателна неопределеност;
- документация.
Проследимостта подпомага сравнимостта на резултатите между:
- различни дни на измерване;
- лаборатории;
- инструменти;
- партиди.
Какво представлява метрологичната проследимост?
Метрологията е науката за измерванията.
Метрологичната проследимост изисква документирана и непрекъсната верига от сравнения към определен референтен обект. Всяка стъпка допринася за общата измервателна неопределеност.
При анализа на пептиди практическата проследимост може да зависи, наред с другото, от:
- референтен стандарт;
- определено съдържание на пептида;
- калибрирана везна;
- обемно-измервателна апаратура;
- аналитичен метод.
Какво представлява измервателната неопределеност?
Всяко аналитично измерване съдържа неопределеност.
Възможните източници са:
- неопределеност на референтния стандарт;
- претегляне;
- пипетиране;
- разреждане;
- вариации на инструмента;
- калибриране;
- интегриране на пиковете;
- подготовка на пробата.
Измервателната неопределеност не означава, че резултатът е ненадежден.
Той описва приблизителния интервал, в който действителната стойност разумно може да се намира.
Защо стандартите трябва да са специфични за партидата?
Референтните стандарти също се произвеждат на партиди.
Различните партиди могат да се различават по:
- пептидно съдържание;
- съдържание на вода;
- съдържание на противойони;
- профил на чистотата;
- стабилност.
Затова трябва ясно да е посочен номерът на партидата на използвания референтен стандарт.
Wat staat op een certificaat van een referentiestandaard?
Какво е посочено в сертификата на референтен стандарт?
- Сертификатът може да съдържа информация за:
- наименование;
- каталожен номер;
- номер на партидата;
- присвоена стойност;
- предвидена употреба;
- условия на съхранение;
- информация за валидност;
- аналитични методи;
корекционен фактор.
Не всеки сертификат съдържа едни и същи данни.
Стандартът трябва да се използва съгласно придружаващите го инструкции.
Защо са важни условията на съхранение?
Референтният стандарт може да се промени по време на съхранение.
- Възможните процеси включват:
- окисление;
- деамидиране;
- поглъщане на влага;
- агрегация;
разграждане.
- Затова могат да бъдат определени условия за:
- защита от светлина;
- защита от влага;
- употреба след отваряне;
- продължителност на съхранение.
Стандарт, който е съхраняван неправилно, може да доведе до неправилни сравнения.
Какво представлява срокът на годност?
Някои референтни стандарти имат определен срок на годност.
Други стандарти са свързани с:
- проверка на валидността;
- дата за повторна квалификация;
- актуален статус на партидата.
Лабораторията трябва да провери дали стандартът е подходящ и валиден към момента на употреба.
Какво е повторна квалификация?
Повторната квалификация представлява повторна оценка на референтен стандарт.
Възможните анализи включват:
- HPLC;
- LC-MS;
- анализ на пептидното съдържание;
- съдържание на вода;
- сравнение с първичен стандарт.
Повторна квалификация може да е необходима след:
- предварително определен срок на употреба;
- продължително съхранение;
- промяна във външния вид;
- отклоняващ се аналитичен резултат.
Защо са важни стандартите за примеси?
Като стандарт може да се използва не само желаният пептид.
Известни примеси или продукти на разграждане също могат да служат като референтен материал.
Примерите включват:
- продукти на окисление;
- деамидирани варианти;
- фрагменти;
- делеционни последователности;
- компоненти, свързани с агрегация.
Тези стандарти могат да помогнат за идентифициране и количествено определяне на вторични пикове.
Какво представляват стандартите за продукти на разграждане?
Стандартът за продукт на разграждане представлява известен вариант на разпадане.
Той може да се използва за изследване на:
- къде елуира продуктът на разграждане;
- каква молекулна маса е налице;
- колко чувствителен е аналитичният метод;
- количеството на наличния продукт на разграждане.
Не всеки продукт на разграждане се предлага като чист стандарт.
Референтни стандарти и валидиране на методи
Аналитичният метод трябва да е доказано подходящ за предвидената цел.
ICH Q2(R2) описва принципите за валидиране на аналитични процедури. Съответните характеристики могат да включват, наред с други, специфичност, точност, прецизност, линейност и измервателен диапазон.
Референтните стандарти могат да се използват при изследване на:
- точност;
- специфичност;
- линейност;
- количествен диапазон;
- характеристики на метода.
Какво е точност?
Точността описва доколко измереният резултат е близък до приета референтна стойност.
Добре характеризираният стандарт може да се използва за изследване на точността на аналитичен метод.
Какво е прецизност?
Прецизността описва доколко близки една до друга са повтарящите се резултати от измервания.
Методът може да дава много прецизни резултати, които въпреки това систематично се отклоняват.
Затова са важни както прецизността, така и точността.
Какво е специфичност?
Специфичността описва дали аналитичният метод може достатъчно добре да разграничи желания компонент от останалите компоненти.
Примерите включват:
- примеси;
- продукти на разграждането;
- компоненти на формулировката;
- противойони.
Подходящият референтен стандарт може да помогне при идентифицирането на основния пик.
Могат ли две лаборатории да получат различни резултати?
Да.
Разликите могат да възникнат поради:
- референтен стандарт;
- аналитичен метод;
- подготовка на пробата;
- оборудване;
- калибриране;
- обработка на данните;
- неопределеност на измерването.
Използването на добре характеризирани стандарти и валидирани методи може да подобри сравнимостта.
Търговският пептид автоматично ли е референтен стандарт?
Не.
Търговският пептид може да е подходящ като изследователски материал, но не е автоматично квалифициран референтен стандарт.
За използване като стандарт трябва да е ясно:
- идентичност;
- пептидно съдържание;
- чистота;
- съдържание на вода;
- съдържание на противойони;
- стабилност при съхранение;
- документация.
Изискванията зависят от аналитичната цел.
Официални фармакопейни референтни стандарти
Официални организации предоставят референтни стандарти за конкретни фармакопейни приложения.
Примерите включват:
- Референтни стандарти на USP;
- Референтни стандарти на Европейската фармакопея;
- Международни химични референтни вещества на СЗО.
Тези стандарти са предназначени за приложенията, описани в съответните официални методи или документация.
Не съществува официален фармакопеен стандарт за всеки изследователски пептид.
Научни ограничения
Референтният стандарт подобрява аналитичната сравнимост, но не решава всички предизвикателства при измерването.
Надеждността продължава да зависи от:
- аналитичен метод;
- подготовка на пробата;
- инструмент;
- калибриране;
- съхранение;
- обработка на данните;
- неопределеност на измерването.
Съответстващото HPLC време на задържане само по себе си не доказва пълната молекулна идентичност.
Съответстващата молекулна маса не доказва автоматично:
- правилна пълна последователност;
- точно количество пептид;
- отсъствие на всички примеси.
Затова се използват множество допълващи се аналитични техники.
Обобщение
Референтният стандарт за пептид е добре характеризирано вещество, използвано като аналитична основа за сравнение.
Референтните стандарти могат да се прилагат за:
- идентификация;
- HPLC сравнение;
- калибриране;
- анализ на пептидното съдържание;
- количествено определяне;
- валидиране на метода;
- анализ на примесите.
Първичният стандарт се характеризира подробно.
Вторичен или работен стандарт се квалифицира спрямо подходящ първичен референтен стандарт и може да се използва за рутинен анализ.
За количествени приложения само HPLC чистотата обикновено е недостатъчна. Трябва да се оценят също пептидното съдържание, водата, противойоните и други релевантни компоненти.
Надеждното аналитично сравнение изисква:
- подходящ референтен стандарт;
- коректно приписване на стойност;
- проследимост на партидите;
- контролирано съхранение;
- валидирана аналитична методика;
- оценка на неопределеността на измерването.
Официални източници и научни референции
-
ICH Q2(R2) — Валидиране на аналитични процедури
Международна насока за валидирането на аналитични процедури, включително специфичност, точност, прецизност, линейност и диапазон на измерване. -
USP — Официални референтни стандарти
USP описва референтните стандарти като подробно характеризирани материали, използвани наред с другото за изследване на идентичност, активност, чистота и качество. -
Референтни стандарти на Европейската фармакопея — EDQM
Каталогът на EDQM съдържа официално валидни референтни стандарти за приложенията, описани в Европейската фармакопея. -
WHO — Международни химични референтни вещества
WHO-ICRS се установяват чрез процедури, съобразени с насоките на WHO за химични референтни вещества. -
NIST — Метрологична проследимост
NIST описва метрологичната проследимост като документирана, непрекъсната верига от калибрирания до посочени референции. -
NIST — Стандартни референтни материали
NIST разработва и сертифицира референтни материали с добре характеризирани състав или свойства, за да подпомага надеждни и сравними измервания. -
FDA — Аналитични процедури и валидиране на методи за лекарства и биологични продукти
Насоките на FDA разглеждат употребата и квалифицирането на референтни стандарти при валидирането на аналитични методи.
Отказ от отговорност относно изследователската употреба
Изследователските пептиди на Peptidera се предлагат единствено за Research Use Only (RUO) и са предназначени за лабораторни изследвания и аналитични приложения.
Не е предназначено за консумация от хора или животни, диагностична употреба, терапевтично приложение или самостоятелно приложение.
Категория:
Познания за пептидите & контрол на качеството
Свързани продукти на Peptidera:
Изследователски пептиди с идентификация на партидите и налични независими аналитични данни за качеството
Свързани вътрешни блогове:
- PB-0230 — Чистота на пептидите и HPLC
- PB-0231 — Масспектрометрия на пептиди
- PB-0233 — Анализ на пептиди: чистота спрямо съдържание на пептид
- PB-0238 — Противойони при пептиди
- PB-0239 — Аминокиселинен анализ на пептиди
- PB-0241 — Проследимост на веригата на контрол при анализ на пептиди
Предложения за вътрешни връзки:
- Връзка към PB-0230 относно времето на задържане при HPLC и хроматографското сравнение
- Връзка към PB-0231 относно LC-MS, молекулната маса и MS/MS
- Връзка към PB-0233 относно количествените анализи на пептиди
- Връзка към PB-0238 относно противойоните и нетното съдържание на пептид
- Връзка към PB-0239 относно аминокиселинния анализ и приписването на стойност
- Връзка към PB-0241 относно проследимостта на стандартите и пробите
- Връзка към страницата на Peptidera с независими сертификати за анализ
- Връзка към колекцията от изследователски пептиди