Чистота на пептида: какво означава 99% HPLC?
Обяснение на чистотата на пептида: какво всъщност показва процентът по HPLC?
При изследователските пептиди често се посочва процент на чистота. Стойности като 98%, 99% или 99,5% чистота редовно се използват за описание на качеството на даден пептид.
Високият процент изглежда лесен за тълкуване: колкото по-високо е числото, толкова по-добър е продуктът. На практика чистотата на пептида е по-сложна.
Резултатът от HPLC предоставя информация за относителния състав на анализираната проба. Процентът обаче не доказва автоматично:
- че е налице правилният пептид;
- че аминокиселинната последователност е напълно правилна;
- че посоченото количество пептид във флакона е правилно;
- че материалът е стерилен;
- че не съдържа ендотоксини;
- че са измерени всички възможни примеси.
За да се оцени внимателно качеството на пептида, няколко аналитични показателя трябва да бъдат разгледани съвместно.
В този блог разглеждаме как се измерва чистотата на пептида, какво означава даден процент по HPLC и защо чистотата е само един от елементите на цялостния контрол на качеството.
Какво означава чистота на пептида?
Чистотата на пептида описва каква част от откритите компоненти, свързани с пептида, съответства на основния компонент в анализираната проба.
Когато например сертификатът за анализ посочва HPLC чистота от 99% когато е посочено, това обикновено означава, че приблизително 99% от интегрирания хроматографски сигнал е отнесен към основния пик.
Това не означава автоматично, че 99% от общото тегло във флакона се състои от желания пептид.
Флаконът може да съдържа освен пептида и други компоненти, като:
- вода;
- противойони;
- соли;
- помощни вещества;
- остатъчни продукти от производството;
- недетектируеми компоненти.
Следователно процентът по HPLC и действителното количество пептид са различни качествени показатели.
Какво представлява HPLC?
HPLC означава високоефективна течна хроматография.
Това е аналитична техника, чрез която различни химични компоненти в дадена проба могат да бъдат разделени един от друг.
При HPLC анализ разтворена проба се пропуска през колона. Тази колона съдържа неподвижна фаза.
Течността, която протича през колоната, се нарича подвижна фаза.
Различните молекули не взаимодействат по един и същ начин с тези фази. Поради това някои компоненти се движат през колоната по-бързо от други.
Резултатът се представя в хроматограма.
Хроматограмата обикновено се състои от:
- хоризонтална времева ос;
- вертикална ос на сигнала;
- един или повече пикове.
Всеки пик представлява детектиран компонент или група компоненти.
Какво е време на задържане?
Времето, необходимо на даден компонент да премине през HPLC колоната и да достигне детектора, се нарича време на задържане.
Времето на задържане може да бъде повлияно от:
- тип HPLC колона;
- състав на подвижната фаза;
- температура;
- скорост на потока;
- свойствата на пептида;
- използвания аналитичен метод.
Съответстващото време на задържане може да помогне при сравнение с референтен стандарт.
Само времето на задържане обаче обикновено е недостатъчно за окончателно потвърждаване на идентичността на пептида.
При определени условия различни молекули могат да имат сходни времена на задържане.
Затова HPLC често се комбинира с масспектрометрия.
Как се изчислява процентът на чистота?
При много HPLC анализи се изчислява площта под всеки хроматографски пик.
Това се нарича интегриране на площта на пика.
Опростен пример:
- основен пик: 99%;
- вторичен пик A: 0,5%;
- вторичен пик B: 0,3%;
- останалите детектирани пикове: 0,2%.
Тогава отчетената хроматографска чистота е приблизително 99%.
Това изчисление зависи от:
- метод на детекция;
- настройки за интегриране;
- избрана дължина на вълната;
- аналитичен метод;
- граница на откриване;
- концентрация на пробата.
Затова процентът на чистота винаги трябва да се интерпретира в контекста на използвания метод.
Какво означава основен пик?
Най-големият пик в хроматограмата често се нарича основен пик.
При добре охарактеризиран пептид се очаква този пик да съответства на желания пептид.
Това обаче трябва да бъде потвърдено аналитично.
Големият пик сам по себе си не доказва наличието на правилната молекулна структура.
За потвърждаване на идентичността могат да се използват допълнителни техники, като:
- масспектрометрия;
- анализ на аминокиселини;
- секвенционен анализ;
- ядрено-магнитен резонанс;
- сравнение с референтен стандарт.
HPLC описва главно хроматографския състав на пробата.
Какви примеси могат да възникнат по време на пептидния синтез?
Много синтетични пептиди се произвеждат чрез твърдофазов пептиден синтез, обикновено съкратено като SPPS.
По време на този процес аминокиселините се свързват поетапно към растяща пептидна верига.
При всяка стъпка могат да възникнат малки отклонения в процеса.
Възможните пептидни примеси са:
Съкратени пептидни вериги
Когато аминокиселина не се свърже правилно, може да се образува непълна пептидна верига.
Този продукт се нарича също продукт на транскрипция.
Делеционни последователности
При делеционна последователност една или повече аминокиселини липсват от предвидената верига.
Поради това молекулната маса се различава от тази на желания пептид.
Химично модифицирани варианти
По време на производството, пречистването или съхранението могат да настъпят химични промени.
Примери са:
- окисление;
- деамидация;
- хидролиза;
- изомеризация.
Остатъци от защитни групи
По време на пептидния синтез се използват временни защитни групи, за да се предотвратят нежелани реакции.
Те трябва да бъдат отстранени на по-късен етап.
Непълното отстраняване може да допринесе за образуването на странични компоненти.
Агрегати
Пептидните молекули могат при определени условия да образуват по-големи структури.
Не всеки HPLC метод открива или характеризира агрегацията по един и същ начин.
Еднакви ли са 99% HPLC чистота и 99% съдържание на пептид?
Не.
Това е важно разграничение.
HPLC чистотата обикновено описва относителното съотношение на откритите хроматографски компоненти.
Съдържанието на пептид описва какво количество действителен пептид присъства спрямо общото количество материал.
Например една лиофилизирана флаконка може да съдържа:
- желаният пептид;
- вода;
- противойони;
- соли;
- помощни вещества.
Тези компоненти не се измерват непременно по един и същ начин при стандартен HPLC анализ.
Затова дадена проба може да има висока хроматографска чистота, докато общото съдържание на пептиди е по-ниско от процента по HPLC.
За количественото определяне са необходими допълнителни аналитични методи.
Какво представлява количественият анализ на пептиди?
Анализът се използва за определяне на количеството или концентрацията на специфичен компонент.
В зависимост от целта на изследването могат да се използват различни методи.
Примери са:
- количествена HPLC с референтен стандарт;
- анализ на аминокиселини;
- анализ на азота;
- спектроскопски техники;
- изчисления на масовия баланс.
Количественият анализ отговаря на различен въпрос от стандартния анализ на чистотата.
Анализът на чистотата изисква:
Каква част от откритите пептидни компоненти принадлежи към основния пик?
Количественият анализ изисква:
Какво количество от желания пептид действително присъства?
И двата вида данни могат да бъдат от значение за пълната характеристика на качеството.
Защо масспектрометрията е важна?
Масспектрометрията, често съкращавана като MS, измерва съотношението маса/заряд на йонизираните молекули.
При анализ на пептиди може да се изследва дали измерената молекулна маса съответства на теоретично очакваната маса.
Масспектрометрията може да допринесе за:
- потвърждаване на идентичността;
- откриване на определени модификации;
- анализ на продуктите от разграждането;
- сравнение на пептидни варианти.
Когато измерената маса съответства на очакваната маса, това подкрепя идентификацията.
Въпреки това масспектрометрията не предоставя автоматично пълна информация за:
- процент на чистота;
- точно количество;
- стерилност;
- ендотоксини;
- биологична активност.
Затова HPLC и масспектрометрията се допълват.
Какво представлява LC-MS?
LC-MS комбинира течна хроматография с масспектрометрия.
Първо компонентите се разделят хроматографски. След това отделните сигнали се изследват допълнително чрез масспектрометрия.
Тази комбинация може да предостави информация за:
- време на задържане;
- молекулна маса;
- възможни примеси;
- продукти на разграждане;
- химични модификации.
Поради това LC-MS може да предостави повече аналитична информация от една отделна техника.
Качеството на резултатите продължава да зависи от:
- подготовка на пробата;
- настройки на инструмента;
- валидиране на метода;
- референтни материали;
- експертна интерпретация.
Защо различни лаборатории могат да измерят различни резултати?
Един и същ пептид може да даде леко различаващи се резултати в различни лаборатории.
Възможните причини са:
- различни HPLC колони;
- други подвижни фази;
- различни градиенти;
- други дължини на вълната за детекция;
- разлики в подготовката на пробата;
- други настройки за интегриране;
- вариации на инструмента.
Разликата не означава автоматично, че единият анализ е неправилен.
За да се сравняват правилно резултатите, трябва да се разгледа и аналитичният метод.
Процент без информация за метода предоставя само ограничен контекст.
Какво представлява валидирането на метода?
Аналитичният метод трябва доказуемо да е подходящ за предназначената цел.
Това се нарича валидиране на метода.
Възможните характеристики за валидиране са:
- специфичност;
- точност;
- прецизност;
- линейност;
- измервателен диапазон;
- граница на откриване;
- граница на количествено определяне;
- устойчивост.
Методът за идентификационен анализ не е автоматично подходящ за точно количествено определяне.
Затова предварително трябва да е ясно кой аналитичен въпрос се изследва.
Какво представлява границата на откриване?
Всеки аналитичен метод има граница, под която даден компонент не може да бъде надеждно открит.
Това се нарича граница на откриване.
Затова компонент, който не се вижда на хроматограма, не отсъства автоматично напълно.
Концентрацията може да е по-ниска от границата на откриване.
Освен това определени вещества могат:
- не реагират на използвания детектор;
- излизат извън измервателния диапазон;
- се загубят по време на подготовката на пробата;
- не се разделят достатъчно.
Затова твърдението „не е открито“ не винаги означава същото като „не присъства“.
Може ли хроматограмата да бъде манипулирана?
Хроматограмата трябва да съдържа достатъчно информация, за да може да бъде оценена професионално.
Важните данни са:
- име на продукта;
- номер на партидата;
- дата на анализа;
- използван метод;
- настройки на детектора;
- времена на задържане;
- интегриране на пиковете;
- лабораторни данни.
Само изображение с един голям пик и процент предоставя ограничена възможност за проверка.
Освен това настройките за интегриране могат да повлияят на това кои сигнали се включват в изчислението.
Затова прозрачната отчетност е важна.
Каква информация трябва да съдържа надеждният COA?
Сертификатът за анализ може да съдържа, наред с другото:
- име на пептида;
- аминокиселинна последователност;
- номер на партидата или лота;
- дата на производство;
- дата на изпитването;
- HPLC резултат;
- хроматограма;
- резултат от масспектрометричния анализ;
- теоретична молекулна маса;
- измерена молекулна маса;
- използвани аналитични методи;
- име на лабораторията.
Не всеки COA съдържа всички елементи.
Необходимата информация зависи от продукта и целта на изследването.
Подробният COA може да осигури повече прозрачност, но надеждността му зависи и от качеството на анализа.
Винаги ли е необходима висока чистота?
Желаната чистота зависи от целта на изследването.
При някои аналитични приложения много малки количества странични компоненти могат да повлияят на:
- резултатите от измерванията;
- изследвания на рецептори;
- клетъчни изследвания;
- възпроизводимостта.
В такъв случай по-високо ниво на чистота може да е желателно.
Въпреки това по-високият процент не означава автоматично, че всички други характеристики на качеството са по-добри.
Например пептид с 99,5% HPLC чистота все пак може:
- да съдържат различно количество;
- да са съхранявани неправилно;
- да не са достатъчно идентифицирани;
- да съдържат повишено остатъчно съдържание на влага;
- да имат повредена опаковка.
Затова качеството трябва да се оценява многомерно.
Чистота и разлики между партидите
Всяка производствена партида има собствен производствен и аналитичен процес.
Затова резултатите за чистота могат да се различават между партидите.
Анализът на една партида не трябва автоматично да се използва като доказателство за всички бъдещи партиди.
Анализът на конкретната партида подпомага:
- проследимост;
- сравнение;
- контрол на качеството;
- изследване на отклоненията.
Поради това номерът на партидата върху флакона трябва да съответства на номера в сертификата за анализ.
Чистота и стабилност
Високата първоначална чистота не гарантира, че тя ще се запази при продължително съхранение.
Възможните процеси на деградация са:
- окисление;
- хидролиза;
- деамидация;
- агрегация.
Скоростта се влияе от:
- температура;
- влага;
- светлина;
- кислород;
- аминокиселинна последователност;
- опаковката.
Изследването на стабилността може да се използва за проследяване на промените в хроматографския профил с течение на времето.
Научни ограничения
Нито един аналитичен метод сам по себе си не дава пълна представа за качеството на пептида.
HPLC може да предостави важна информация за хроматографската чистота, но има ограничения.
Процентът от HPLC не доказва автоматично:
- идентичност;
- точно количество пептид;
- аминокиселинна последователност;
- стерилност;
- съдържание на ендотоксини;
- биологична активност;
- дългосрочна стабилност.
Затова се комбинират няколко аналитични метода.
Пълната оценка на качеството може да включва:
- HPLC;
- масспектрометрия;
- количествен анализ;
- анализ на влагата;
- изследване на стабилността;
- допълнителни специфични за продукта тестове.
Обобщение
Чистотата на пептида е важен параметър за качеството, но процентът от HPLC трябва да се интерпретира правилно.
Стойност от 99% обикновено означава, че приблизително 99% от интегрирания хроматографски сигнал е отнесен към основния пик.
Това не означава автоматично, че:
- 99% от теглото на флакона се състои от пептид;
- идентичността е напълно потвърдена;
- посоченото количество е правилно;
- материалът е стерилен;
- всички възможни примеси са изключени.
За по-широка оценка на качеството резултатите от HPLC трябва да се комбинират с други данни, като:
- масспектрометрия;
- информация за партидата;
- количествен анализ;
- данни за съхранението;
- изследване на стабилността.
Следователно качеството на пептида се определя от повече от един процент.
Отказ от отговорност относно изследователските пептиди
Изследователските пептиди на Peptidera се предлагат изключително за Research Use Only (RUO) и са предназначени за лабораторни изследвания и аналитични приложения.
Не е предназначено за консумация от хора или животни, диагностична употреба, терапевтично приложение или самостоятелно приложение.
Категория:
Познания за пептидите и контрол на качеството
Свързани продукти на Peptidera:
Лиофилизирани изследователски пептиди с идентификация на партидата и налични аналитични данни за качеството
Свързани вътрешни блогове:
- PB-0227 — Лиофилизирани пептиди и лиофилизация
- PB-0228 — Флакони с пептиди и целостта на опаковката
- PB-0229 — Номера на партиди и проследимост
- Какво представлява сертификатът за анализ?
- Как се тестват аналитично изследователските пептиди?
Предложения за вътрешни връзки:
- Връзка към PB-0229 относно анализите за конкретни партиди
- Връзка към страницата с COA относно сертификатите за анализ
- Връзка към PB-0227 относно стабилността и разграждането
- Връзка към колекцията от изследователски пептиди
- Връзка към страницата за независими лабораторни тестове
Име на файла с изображението:PB-0230-peptidezuiverheid-hplc-analyse.jpg