Остатъчна влага в лиофилизирани пептиди: влияние върху стабилността и качеството

Лиофилизираните изследователски пептиди често се доставят като суха, пореста структура в затворен стъклен флакон. Чрез отстраняване на водата по време на процеса на лиофилизация се ограничава молекулното движение и определени химични процеси на разграждане.

Въпреки това, лиофилизирането не означава автоматично пълна липса на вода.

След лиофилизация в продукта може да остане малко количество вода. Това се нарича остатъчна влага, резидуална влага или residual moisture.

Количеството остатъчна влага може да влияе на:

химическа стабилност;
физическа стабилност;
молекулярна подвижност;
агрегация;
окисление;
структурата на лиофилизираната матрица;
стабилност по време на съхранение.

Много високото съдържание на влага може да ускори определени процеси на разграждане. Въпреки това, изключително ниското съдържание на влага не е автоматично оптимално за всяка пептидна формулация. Някои молекулни структури могат да се възползват от ограничено количество свързана вода.

Желаната стойност на остатъчната влага зависи от конкретния пептид, формулацията, опаковката и условията на съхранение.

В този блог обсъждаме как се образува остатъчната влага, как се измерва и защо анализът на влагата може да бъде важна част от изследването на стабилността при лиофилизирани изследователски пептиди.

Какво е остатъчна влага?

Остатъчната влага е количеството вода, което остава в лиофилизиран продукт след процеса на сушене.

Тази вода може да се намира:

между молекулите;
на повърхността на лиофилизираната структура;
в микроскопични пори;
свързана с пептидни групи;
свързана с помощни вещества;
в равновесие с газовата фаза във флакона.

Остатъчната влага обикновено се изразява като процент от общата маса.

Хипотетичен резултат може да бъде например:

Остатъчна влага: 1,8%

Това означава, че според използвания метод на измерване около 1,8% от изследваната маса се приписва на вода.

Значението на тази стойност зависи от:

спецификация на продукта;
използван метод на анализ;
свойства на пептида;
формулировка;
цел за съхранение.

Защо пептидите се лиофилизират?

Пептидите в воден разтвор могат да бъдат чувствителни към различни химични и физични промени.

Възможни процеси са:

хидролиза;
окисление;
деамидиране;
агрегация;
структурни промени.

Чрез замразяване на разтвор и след това отстраняване на голяма част от водата при понижено налягане се получава суха матрица.

Този процес се нарича:

лиофилизация;
лиофилизиране;
лиофилизация.

Целта не е само отстраняването на вода.

Добре разработеният процес на лиофилизация трябва също да допринася за:

запазване на молекулната цялост;
образуване на стабилна бисквита;
възпроизводимо качество на продукта;
подходяща разтворимост за аналитично изследване.

Как се образува остатъчната влага?

По време на лиофилизацията водата се отстранява на няколко етапа.

Основните фази на процеса са:

замразяване;
първично сушене;
вторично сушене.

Всяка фаза влияе на крайното количество остатъчна влага.

Фаза 1: замразяване

По време на фазата на замразяване пептидният разтвор се охлажда.

Голяма част от водата образува ледени кристали.

Другите компоненти се концентрират в незамръзналите части на разтвора.

Начинът, по който продуктът замръзва, може да повлияе на:

размер на ледени кристали;
структура на порите;
време за сушене;
разпределение на компонентите;
крайната структура на продукта.

По-големите ледени кристали могат да оставят по-големи пори след сублимация.

Това може да повлияе на транспорта на водна пара по време на първичното сушене.

Фаза 2: първично сушене

По време на първичната фаза на сушене налягането се понижава.

Замръзналата вода след това се отстранява чрез сублимация.

Сублимация означава, че ледът преминава директно от твърдо състояние в водна пара.

Температурата на продукта трябва да се контролира внимателно по време на тази фаза.

Когато температурата стане твърде висока, структурата може да се срути.

Понякога това се обозначава като:

срутване на бисквитата

Срутена структура може да повлияе на:

външен вид;
порьозност;
поведение при сушене;
разтворимост;
стабилност.

След първичната фаза на сушене голяма част от свободния лед е отстранена.

Въпреки това може да има още свързана вода.

Фаза 3: вторично сушене

По време на вторичната фаза на сушене се отстранява по-силно свързаната вода.

Това обикновено се постига чрез контролирано повишаване на температурата на продукта, докато ниското налягане се запазва.

Целта е да се намали остатъчната влага до предварително определена стойност.

Оптималната крайна стойност варира в зависимост от продукта.

Твърде кратко вторично сушене може да доведе до:

повишена остатъчна влага;
повишена молекулна подвижност;
намалена стабилност.

Прекалено интензивна фаза на сушене може също да има неблагоприятни ефекти при някои формулации.

Затова процесът се разработва специфично за продукта.

Дали лиофилизиран пептид е напълно сух?

Обикновено не.

Терминът лиофилизиран означава, че голяма част от водата е отстранена.

Това не означава автоматично, че продуктът съдържа 0% вода.

Водните молекули могат да останат силно свързани с:

полярни аминокиселинни групи;
пептидни връзки;
солите;
формулационни компоненти.

Пълното отстраняване може да бъде технически трудно и не винаги желателно.

Затова обикновено се работи с приемлив диапазон на остатъчната влага.

Защо прекомерната остатъчна влага може да бъде проблем?

Водата може да увеличи молекулната подвижност.

Когато молекулите се движат по-лесно, определени химични реакции могат да протичат по-бързо.

Повишеното съдържание на остатъчна влага може при определени условия да допринесе за:

хидролиза;
деамидиране;
окислителни промени;
агрегация;
структурна нестабилност.

Влиянието зависи от:

последователност на пептида;
температура;
кислород;
светлина;
pH микрооколна среда;
време на съхранение.

Остатъчната влага е един от факторите за стабилност и трябва да се оценява заедно с други условия.

Какво е молекулна подвижност?

В суха лиофилизирана матрица молекулите са относително ограничени в движението си.

Водата може да действа като молекулен пластификатор.

Това може да увеличи молекулните движения.

По-високата подвижност може да увеличи вероятността реактивните групи да се срещнат.

Това може да повлияе на определени реакции на деградация.

Връзката между съдържанието на вода и стабилността обаче не винаги е линейна.

Повече вода не означава при всички условия точно пропорционално повече разпад.

Може ли прекалено ниското съдържание на влага да бъде вредно?

Да, това е възможно.

Много ниското съдържание на влага не е автоматично оптимално за всеки пептид.

Ограничено количество свързана вода може да допринесе за:

запазване на определени молекулни взаимодействия;
стабилизиране на структурата;
намаляване на механичното напрежение.

Прекомерното сушене при някои формулировки може да предизвика промени в:

молекулна структура;
продуктова матрица;
разтворимост.

Желаната стойност на остатъчната влага трябва да се определи експериментално.

Какво е лиофилизиран блат?

След лиофилизация обикновено остава пореста твърда структура.

Това често се нарича лиофилизиран блат.

Добре оформеният блат може да има характеристики като:

еднородна структура;
достатъчна порьозност;
ограничено свиване;
няма видимо срутване.

Външният вид обаче не дава пълна информация за качеството.

Визуално чистият блат все още може да има отклонено съдържание на влага.

Обратно, отклонена форма не означава автоматично, че молекулното качество е недостатъчно.

Аналитичната оценка остава необходима.

Може ли да се установи остатъчната влага по външния вид?

Не.

Остатъчната влага не може да се определи надеждно само чрез визуален преглед на флакона.

Възможни външни промени са:

свиване;
срутване;
лепкавост;
промяна на цвета;
промяна на структурата.

Тези явления могат да имат различни причини.

За количествено определяне е необходим подходящ аналитичен метод.

Как се измерва остатъчната влага?

Могат да се използват различни техники.

Често използвани методи са:

титруване по Карл Фишер;
термогравиметричен анализ;
загуба при сушене;
спектроскопски методи.

Всеки метод измерва влагата по различен начин.

Поради това резултатите не винаги са директно взаимозаменяеми.

Какво е титруване на Карл Фишер?

Титруването на Карл Фишер е широко използван метод за определяне на вода.

Методът използва химична реакция, която е специфично чувствителна към вода.

Използва се количеството изразходван реагент за изчисляване на съдържанието на вода.

Анализът на Карл Фишер може да е подходящ за ниски концентрации на влага.

Съществуват различни варианти:

волуметрично титруване на Карл Фишер;
кулометрично титруване на Карл Фишер.

Подходящият метод зависи от количеството вода и типа проба.

Кулометричен анализ на Карл Фишер

Кулометричното титруване на Карл Фишер често се използва при малки количества вода.

По време на анализа необходимият реагент се образува електрохимично.

Количеството електрически заряд се използва за изчисляване на съдържанието на вода.

Възможните предимства са:

чувствителност;
подходящост за ниски стойности на влага;
малки количества проба.

Надеждността зависи от:

подготовка на пробата;
пълно извличане на вода;
оборудване;
калибриране;
корекция на фона.

Какво е загуба при сушене?

При загуба при сушене, съкратено LOD, пробата се претегля преди и след контролирано сушене.

Изчислява се загубата на маса.

Този метод не измерва винаги само вода.

Други летливи компоненти също могат да изчезнат по време на процеса на сушене.

Поради това загубата при сушене не е автоматично равна на специфично определяне на водата.

Какво е термогравиметричен анализ?

Термогравиметричният анализ се съкращава като TGA.

По време на TGA масата на проба се измерва, докато температурата се променя контролирано.

Загубата на маса може да даде информация за:

влага;
летливи компоненти;
термични промени.

Интерпретацията изисква познания за:

температурен профил;
състав на продукта;
възможни процеси на разлагане.

Защо методът на измерване може да има значение?

Не всеки метод открива вода по един и същи начин.

Някои техники измерват:

специфична вода;
обща загуба на маса;
свободна вода;
свързана вода.

Поради това различните методи могат да дадат различни стойности.

Резултатът за остатъчна влага винаги трябва да се оценява заедно с:

метод;
условия на измерване;
спецификация на продукта.

Каква роля играе гумената тапа?

При лиофилизация флаконът трябва да бъде добре затворен.

Гумената тапа образува важна бариера срещу влагата от околната среда.

Защитата зависи от:

материал на тапата;
затваряне;
поставяне;
съвместимост;
време на съхранение.

Недобре затворен флакон може да абсорбира влага.

Затова целостта на опаковката е важна за стабилността.

Каква роля играе алуминиевият капак?

Алуминиевият капак държи гумената тапа механично на място.

Правилното запечатване подпомага:

цялост на затваряне;
защита срещу движение на тапата;
консистентно затваряне.

Повреден или разхлабен алуминиев капак може да наложи допълнителна проверка.

Външният вид обаче не доказва, че затварянето е напълно херметично.

Може ли влагата да проникне през опаковъчните материали?

Опаковъчните материали образуват бариери, но никоя система не е абсолютно непроницаема при всички условия.

Възможни фактори са:

вид материал;
време на съхранение;
температура;
влажност на въздуха;
качество на затварянето.

Продължителното излагане на висока влажност на въздуха може да увеличи вероятността от абсорбция на влага, когато бариерата на опаковката е недостатъчна.

Какво е цялост на затваряне на контейнера?

Цялостта на затваряне на контейнера описва степента, в която флаконът, тапата и алуминиевият капак образуват защитно затваряне.

Често се съкращава като:

CCI

Изследването на целостта на опаковката може да се фокусира върху:

изтичане;
газообмен;
проникване на влага;
механични повреди.

Добро затваряне подпомага запазването на вътрешната среда.

Какво влияние има температурата на съхранение?

Температурата може да влияе на:

молекулно движение;
химични реакции;
миграция на влага;
физическа стабилност.

По-високите температури могат да ускорят определени процеси на разграждане.

Остатъчната влага и температурата могат да влияят една на друга.

Продукт с повишено остатъчно съдържание на влага може при по-висока температура да се променя по-бързо, отколкото при контролирани по-хладни условия.

Реалната стабилност трябва да бъде изследвана експериментално.

Защо влажността на въздуха е важна?

Когато флаконът се отвори или не е добре затворен, околната влага може да повлияе.

Степента на абсорбция на влага зависи от:

относителна влажност на въздуха;
продължителност на излагане;
хигроскопичност;
структура на продукта.

Някои лиофилизирани материали привличат влага по-лесно от други.

Това се нарича хигроскопичност.

Какво означава хигроскопичен?

Хигроскопичен материал има склонност да привлича вода от околната среда.

Възможните последици са:

по-високо съдържание на влага;
промяна в структурата на бисквитката;
лепкавост;
по-голяма молекулна подвижност.

Степента на хигроскопичност зависи от състава на продукта.

Може ли транспортът да има влияние?

Транспортът може да изложи продукта на:

колебания в температурата;
трептения;
промени в налягането;
променлива влажност на въздуха.

Когато флаконът е добре затворен, директното поемане на влага е ограничено.

Въпреки това продължителни или екстремни условия могат да повлияят на стабилността на продукта.

Затова подходящата опаковка и условия на транспорт са важни.

Остатъчна влага и окисляване

Водата може косвено да влияе на окислителните процеси.

Окисляването се влияе допълнително от:

кислород;
светлина;
метални йони;
температура;
аминокиселинен състав.

Ниското съдържание на влага не предотвратява напълно окисляването.

Затова могат да са необходими допълнителни мерки, като:

контролирана опаковка;
защита от светлина;
подходяща температура на съхранение.

Остатъчна влага и деамидиранe

Деамидирането е химична промяна, която може да засегне определени аминокиселинни остатъци.

Особено аспарагинът и глутаминът могат да бъдат чувствителни.

Скоростта на реакцията се влияе от:

вода;
температура;
pH;
аминокиселинна последователност;
молекулна среда.

Повишената молекулна подвижност може при определени условия да насърчи деамидирането.

Остатъчна влага и агрегация

Агрегацията означава, че молекулите образуват заедно по-големи структури.

Остатъчната влага може да влияе на подвижността и взаимодействието между молекулите.

Връзката е сложна.

Как твърде високото, така и неподходящо ниското съдържание на влага могат да влияят на физическата стабилност при определени формулировки.

Затова агрегацията се изследва отделно.

Как се определя подходяща спецификация за остатъчна влага?

Спецификацията на продукта се основава предпочитано на експериментални данни.

Изследователите могат да сравняват партиди с различни стойности на влага.

Например се измерват:

чистота по HPLC;
продукти на разпад;
агрегация;
разтворимост;
физическа структура;
стабилност по време на съхранение.

Въз основа на тези данни може да се определи приемлив диапазон.

Какво може да бъде посочено в COA?

Сертификатът за анализ може да съдържа данни като:

тест: остатъчна влага;
метод: Карл Фишер;
спецификация: установен диапазон;
измерен резултат;
оценка: съответства или не съответства.

Не всеки COA съдържа анализ на влагата.

Когато са извършени само HPLC и масспектрометрия, от това не може да се направи извод за остатъчната влага.

Остатъчната влага същото ли е като чистотата на пептидите?

Не.

Остатъчната влага и HPLC чистотата са различни параметри за качество.

HPLC чистотата обикновено описва относителния хроматографски състав.

Остатъчната влага описва количеството вода в материала.

Един продукт може:

имат висока HPLC чистота;
и относително високо съдържание на влага.

И двата резултата могат да бъдат едновременно верни.

Дали остатъчната влага е същото като съдържанието на пептиди?

Не.

Остатъчната влага може да влияе на изчисленото съдържание на пептиди.

Когато водата допринася за общата маса, нетното съдържание на пептиди може да е по-ниско.

Поради това анализът на влага може да бъде част от масовия баланс.

Научни ограничения

Еднократно измерване на остатъчната влага не дава пълна картина за стабилността на продукта.

Реалната стабилност зависи също от:

аминокиселинна последователност;
химически модификации;
формулировка;
кислород;
светлина;
температура;
опаковка;
време на съхранение.

Ниска стойност на влагата не доказва автоматично:

висока чистота на пептидите;
коректна идентичност;
правилно количество пептиди;
стерилност;
биологична активност.

За по-широка оценка на качеството са необходими допълнителни анализи.

Обобщение

Лиофилизираните изследователски пептиди обикновено не са напълно безводни.

След лиофилизация може да остане малко количество остатъчна влага.

Остатъчната влага може да влияе на:

молекулярна подвижност;
химическа стабилност;
агрегация;
окисление;
деамидиране;
физическа структура на продукта.

Често използвани методи за анализ са:

титруване по Карл Фишер;
загуба при сушене;
термогравиметричен анализ.

Оптималното количество остатъчна влага варира в зависимост от пептида и формулировката.

Възможно най-ниската стойност не е автоматично оптимална за всеки продукт.

Остатъчната влага трябва да се оценява заедно с:

чистота по HPLC;
пептиден анализ;
молекулярна идентичност;
цялост на опаковката;
данни за стабилност.

Отказ от отговорност за изследвания

Изследователските пептиди на Peptidera се предлагат единствено за само за изследователска употреба (RUO) и са предназначени за лабораторни изследвания и аналитични приложения.

Не е предназначено за човешка или животинска консумация, диагностична употреба, терапевтична цел или самостоятелно приложение.

Категория:
Знания за пептидите и контрол на качеството

Свързани продукти на Peptidera:
Лиофилизирани изследователски пептиди с идентификация на партида и налични аналитични данни за качество

Свързани вътрешни блогове:

PB-0227 — Лиофилизирани пептиди и лиофилизация
PB-0228 — Пептидни флакони и цялост на опаковката
PB-0230 — Чистота на пептидите и HPLC
PB-0232 — Сертификат за анализ на пептиди
PB-0233 — Пептиден анализ: чистота спрямо съдържание на пептиди

Предложения за вътрешни връзки:

Връзка към PB-0227 за процеса на лиофилизация
Връзка към PB-0228 за цялостта на флаконите, тапите и опаковката
Връзка към PB-0233 за остатъчна влага и нетно съдържание на пептиди
Връзка към PB-0232 за анализ на влага в COA
Връзка към страницата на Peptidera с анализаторни сертификати
Връзка към колекцията от лиофилизирани изследователски пептиди

Държава/регион

Език