Йони при пептиди: ацетат, хлорид и TFA
При синтетичните изследователски пептиди често се говори за чистота, молекулна маса и съдържание на пептид. По-малко видими, но аналитично важни, са противойоните.
По време на синтеза и пречистването пептидите могат да присъстват под формата на соли. При това положително или отрицателно заредените групи в пептида са свързани с йон с противоположен заряд. Тези йони се наричат противойони.
Често срещаните противойони при пептидите са:
- ацетат;
- хлорид;
- трифлуороацетат, съкратено TFA.
Противойоните могат да повлияят на:
- обща маса;
- нетно съдържание на пептид;
- разтворимост;
- pH на разтворите;
- аналитична интерпретация;
- сравнение на партиди.
HPLC чистота от 99% обикновено не казва нищо пряко за количеството противойони. Затова противойоните трябва да се разбират отделно и, когато е уместно, да се анализират отделно.
Какво е противойон?
Противойонът е йон, който компенсира електрическия заряд на молекула.
Пептидите често съдържат заредени групи, например:
- аминогрупи;
- карбоксилни групи;
- страничните вериги на заредените аминокиселини.
Когато пептидът има нетен положителен заряд, може да присъства отрицателен противойон.
Когато пептидът има нетен отрицателен заряд, може да присъства положителен противойон.
При много пептидни соли става дума предимно за отрицателни противойони, свързани с положително заредени групи.
Защо пептидите имат противойони?
Противойоните често възникват вследствие на използваните методи за производство и пречистване.
При производството на пептиди могат да се използват киселини, буфери и йонни реагенти.
Примерите включват:
- трифлуороцетна киселина по време на RP-HPLC;
- оцетна киселина за ацетатна форма;
- солна киселина за хлоридна форма.
След пречистване и лиофилизация тези йони могат частично да останат в крайния материал.
Това не означава автоматично, че продуктът е с лошо качество. Означава, че пептидът присъства в определена солна форма.
Ацетатът като противойон
Ацетатът е йонът на оцетната киселина.
Пептидите в ацетатна форма често се използват, когато е желателно по-ниско съдържание на TFA.
Ацетатът може да е от значение за:
- солна форма;
- pH свойства;
- аналитичен масов баланс;
- съдържанието на пептид.
Ацетатът допринася за общата суха маса, но не е пептидна верига.
Затова нетното съдържание на пептид може да е по-ниско от общото тегло на флакона.
Хлоридът като противойон
Хлоридът е отрицателният йон на солната киселина.
Някои пептиди се доставят като хидрохлоридна сол.
Хлоридът може да повлияе на:
- йонна сила;
- разтворимост;
- pH;
- общата маса.
Хлоридът също се включва в общата маса, но не и в нетната пептидна верига.
TFA като противойон
TFA означава трифлуороацетат.
TFA се използва широко в пептидната химия и RP-HPLC, тъй като може да осигури добри хроматографски свойства.
Той може да помогне за:
- форма на пика;
- разделяне;
- йонно сдвояване;
- пречистване.
TFA обаче може да остане в крайния материал и като противойон.
Затова при някои приложения се избира йонен обмен към ацетат или хлорид.
Защо TFA е аналитично важен?
TFA може да допринася относително значително за общата маса.
Когато пептидът има няколко положително заредени места, могат да присъстват няколко TFA-йона.
Това може да повлияе на:
- нетно съдържание на пептид;
- масов баланс;
- изчисления на концентрацията;
- интерпретация на съдържанието на виалата.
Следователно пептидът може да има много висока чистота по HPLC и въпреки това да съдържа значителен дял противойони.
Противойони и чистота по HPLC
Чистотата по HPLC обикновено описва относителния хроматографски основен пик.
Противойоните не винаги се виждат по един и същ начин при стандартен HPLC метод за пептиди.
Затова:
99% чистота по HPLC
не означава автоматично:
99% нетно съдържание на пептид
Противойоните трябва да се отчитат отделно при количествената оценка.
Противойони и анализ на съдържанието на пептида
При анализа на съдържанието на пептида се определя действителното количество пептид.
При това противойоните могат да бъдат важни, тъй като допринасят за общото тегло.
Коректният анализ на съдържанието може да разграничи:
- брутно тегло на лиофилизирания материал;
- нетно количество пептид;
- съдържание на вода;
- съдържание на противойони;
- други компоненти.
Затова анализът на съдържанието, анализът на влагата и анализът на противойоните се допълват.
Как се анализират противойоните?
Възможните методи са:
- йонна хроматография;
- капилярна електрофореза;
- NMR;
- елементен анализ;
- подход на масовия баланс;
- специфичен анализ на TFA.
Избраният метод зависи от противойона и желаната точност.
Какво представлява йонната хроматография?
Йонната хроматография е аналитичен метод за разделяне и измерване на йони.
Този метод може да се използва, наред с другото, за:
- хлорид;
- ацетат;
- трифлуороацетат;
- други малки йони.
Резултатът може да помогне при изчисляването на солевата форма и нетното съдържание на пептид.
Противойони и разтворимост
Солевата форма на пептида може да повлияе на разтворимостта.
Пептидът в ацетатна форма може да се държи различно от същия пептид във форма на TFA или хлорид.
Разтворимостта се влияе и от:
- аминокиселинна последователност;
- pH;
- концентрация;
- температура;
- разтворител;
- йонна сила.
Затова разтворимостта винаги трябва да се оценява специфично за продукта.
Противойони и pH
Когато пептидът се разтвори, противойоните могат да допринесат за pH на разтвора.
Ацетатът, хлоридът и TFA имат различни химични свойства.
pH може да е от значение за:
- стабилност;
- деамидация;
- агрегация;
- разтворимост;
- методи за анализ.
Контра-йони и разлики между партидите
Съдържанието на контра-йони може да се различава между партидите.
Възможните причини са:
- метод на пречистване;
- използвана подвижна фаза;
- йонообмен;
- стъпки на промиване;
- процес на лиофилизация.
Затова специфичният за партидата анализ е важен, когато контра-йоните са от значение за целта на изследването.
Посочен ли е контра-йонът в COA?
Понякога, но не винаги.
В COA може да бъде посочено:
- форма на пептида;
- ацетат;
- хлорид;
- TFA;
- процент на контра-йоните;
- анализ;
- нетно съдържание на пептид.
Ако COA показва само HPLC и MS, съдържанието на контра-йони обикновено не е напълно оценено.
Защо това е важно за изчисленията?
Когато изследователите изчисляват колко пептид присъства, разликата между брутната и нетната маса може да бъде важна.
Например:
- 10 mg общо лиофилизиран материал;
- 85% нетно съдържание на пептид;
- действително количество пептид: 8,5 mg.
Без корекция количеството пептид може да бъде надценено.
Научни ограничения
Анализът на контра-йоните зависи от използвания метод.
Не всеки отчет посочва напълно солевата форма.
Възможно е да присъстват и множество йонни компоненти.
Затова заключенията трябва да се основават на действителни анализи, а не само на името на продукта или процента по HPLC.
Обобщение
Контра-йоните са йони, които компенсират електрическия заряд на пептидите.
Често срещани примери са:
- ацетат;
- хлорид;
- TFA.
Те могат да повлияят на:
- обща маса;
- нетно съдържание на пептид;
- разтворимост;
- pH;
- стабилност;
- аналитична интерпретация.
Високата HPLC чистота не означава автоматично високо нетно съдържание на пептид.
За пълна оценка на качеството контра-йоните трябва да се разглеждат заедно с HPLC, масспектрометрията, анализа, остатъчната влага и данните за партидата.
Отказ от отговорност за изследователска употреба
Изследователските пептиди на Peptidera се предлагат изключително за Research Use Only (RUO) и са предназначени за лабораторни изследвания и аналитични приложения.
Не е предназначено за консумация от хора или животни, диагностична употреба, терапевтично приложение или самостоятелно приложение.
Категория:
Познания за пептидите и контрол на качеството
Свързани вътрешни блогове:
- PB-0233 — Анализ на пептида
- PB-0234 — Остатъчна влага
- PB-0230 — Чистота на пептида и HPLC
- PB-0232 — Сертификат за анализ
- PB-0237 — Деамидация на пептиди
Име на файла с изображението:PB-0238-tegenionen-peptiden-acetaat-chloride-tfa.jpg
Алтернативен текст:
Научна визуализация на пептидни солеви форми с ацетатни, хлоридни и TFA-контра-йони в модерна аналитична лаборатория.