Analýza aminokyselin u peptidů vysvětlena

Analýza aminokyselin u peptidů: vysvětlení složení a kvantifikace

Peptidy se skládají z řetězců aminokyselin. Pořadí těchto aminokyselin určuje velkou část chemických a strukturních vlastností peptidu.

Při kontrole kvality se k posouzení čistoty a molekulové hmotnosti často používají techniky, jako jsou HPLC a hmotnostní spektrometrie. Doplňkovou analytickou metodou je analýza aminokyselin, často zkráceně AAA.

Analýzu aminokyselin lze použít ke zkoumání:

které aminokyseliny jsou ve vzorku přítomny;
jak naměřené poměry aminokyselin odpovídají očekávanému složení;
kolik peptidu je přítomno;
zda složení aminokyselin odpovídá teoretickému peptidu;
jak lze vypočítat čistý obsah peptidu.

Tato metoda funguje jinak než HPLC a hmotnostní spektrometrie. Při klasické analýze aminokyselin se peptidový řetězec nejprve rozloží na jednotlivé aminokyseliny. Ty se poté separují, detekují a kvantifikují.

Analýza aminokyselin může poskytnout cenné informace, ale má také určitá omezení. Během rozkladu se některé aminokyseliny mohou částečně změnit nebo ztratit. Výsledky proto musí být vždy interpretovány v kontextu použité metody.

Co je analýza aminokyselin?

Analýza aminokyselin je laboratorní technika, pomocí níž se zkoumá složení aminokyselin ve vzorku.

Při klasické analýze se obvykle provádějí následující kroky:

příprava vzorku;
hydrolýza peptidového řetězce;
uvolnění jednotlivých aminokyselin;
separace aminokyselin;
detekce a kvantifikace;
porovnání s očekávaným složením.

Výsledek lze vyjádřit jako:

množství jednotlivých aminokyselin;
molární poměr;
hmotnostní koncentrace;
aminokyselinový profil;
vypočtený obsah peptidu.

Co je hydrolýza?

Hydrolýza je chemický proces, při kterém se vazby štěpí pomocí vody.

Při analýze aminokyselin se peptidové vazby rozkládají, takže se uvolňují jednotlivé aminokyseliny.

Často používanou metodou je kyselá hydrolýza.

Vzorek je přitom po kontrolovanou dobu vystaven:

silná kyselina;
zvýšená teplota;
kontrolované podmínky.

Po hydrolýze již původní peptidový řetězec neexistuje jako intaktní molekula.

Uvolněné aminokyseliny lze následně zkoumat jednotlivě.

Proč se peptidový řetězec rozkládá?

Intaktní peptid může obsahovat desítky různých aminokyselinových zbytků.

Rozštěpením řetězce lze změřit celkové množství každé aminokyseliny.

Představme si, že teoretický peptid obsahuje:

čtyři alaninové zbytky;
dva glycinové zbytky;
tři leucinové zbytky;
jeden tyrosinový zbytek.

Po hydrolýze lze zkoumat, zda naměřené poměry přibližně odpovídají tomuto teoretickému složení.

To podporuje posouzení aminokyselinového složení.

Jaký je rozdíl mezi aminokyselinovým složením a pořadím aminokyselin?

Analýza aminokyselin měří především .

Metoda automaticky neurčuje přesné pořadí.

Dva různé peptidy mohou mít stejné aminokyselinové složení, ale jiné pořadí.

Například:

Ala-Gly-Leu;
Leu-Gly-Ala.

Obě obsahují:

jednu alaninovou jednotku;
jeden glycin;
jednu leucinovou jednotku.

Přesto se sekvence liší.

Pro zkoumání sekvence jsou zapotřebí jiné techniky, například:

tandemovou hmotnostní spektrometrii;
fragmentová analýza;
specifické sekvenační metody.

Může analýza aminokyselin potvrdit identitu?

Analýza aminokyselin může podpořit očekávané složení.

Pokud se naměřený profil aminokyselin výrazně liší od teoretického složení, může to být důvodem k dalšímu zkoumání.

Odpovídající profil však sám o sobě nedokazuje, že je správné přesné pořadí aminokyselin.

Pro širší posouzení identity lze kombinovat:

molekulová hmotnost;
LC-MS;
MS/MS;
analýzu aminokyselin;
chromatografické údaje.

Jak se aminokyseliny oddělují?

Po hydrolýze obsahuje vzorek směs volných aminokyselin.

Ty musí být analyticky odděleny.

Možné techniky jsou:

iontovýměnnou chromatografii;
HPLC;
UPLC;
kapilární elektroforézu.

Zvolená technika závisí na:

požadovanou citlivost;
laboratorní metodu;
typ vzorku;
požadovanou přesnost.

Co je derivatizace?

Mnoho aminokyselin má bez dodatečného zpracování omezenou detekovatelnost.

Proto je lze chemicky spojit s detekovatelnou skupinou.

Tento proces se nazývá derivatizace.

Derivatizace může probíhat:

před chromatografickou separací;
po chromatografické separaci.

Vzniklé deriváty lze lépe měřit například pomocí:

UV detekci;
fluorescenční detekci;
hmotnostní spektrometrii.

Předkolonová derivatizace

Při předkolonové derivatizaci se aminokyseliny označí před chromatografickou separací.

Poté se vzniklé deriváty oddělují pomocí kolony.

Možné výhody jsou:

vysokou citlivost;
vhodnou fluorescenční detekci;
analýzu několika aminokyselin.

Reakce musí probíhat reprodukovatelně.

Neúplná derivatizace může ovlivnit kvantifikaci.

Postkolonová derivatizace

Při postkolonové derivatizaci se aminokyseliny nejprve oddělují.

Po průchodu kolonou reagují s detekčním činidlem.

Známým příkladem je analýza s ninhydrinem.

Vzniklé reakční produkty lze následně měřit opticky.

Jak se určuje množství aminokyseliny?

Pro kvantifikaci se používají referenční standardy.

Standardní roztoky obsahují známá množství aminokyselin.

Ty se měří za účelem stanovení vztahu mezi:

koncentrace;
signál detektoru.

Poté se změří neznámý vzorek.

Pomocí kalibračních údajů lze vypočítat množství každé aminokyseliny.

Co je interní standard?

Interní standard je známá látka, která se přidává do vzorků a kalibračních roztoků.

Může pomoci korigovat odchylky během:

příprava vzorku;
injekce;
derivatizace;
analýza.

Interní standard musí být analyticky dobře odlišitelný od zkoumaných aminokyselin.

Jak může analýza aminokyselin stanovit obsah peptidu?

Když je známo aminokyselinové složení peptidu, lze k výpočtu množství peptidu použít vybrané aminokyseliny.

Předpokládejme, že každý peptidový řetězec obsahuje přesně čtyři alaninová rezidua.

Když se změří celkové množství alaninu, lze z něj odhadnout, kolik peptidových řetězců bylo přítomno.

Výpočet zohledňuje:

počet reziduí v peptidu;
molekulová hmotnost;
naměřené množství aminokyseliny;
analytická metoda.

To lze použít pro kvantitativní analýzu peptidu.

Proč se nepoužívají vždy všechny aminokyseliny?

Ne každá aminokyselina je stejně vhodná pro kvantifikaci.

Některé aminokyseliny se mohou během hydrolýzy:

částečně se rozložit;
chemicky se změnit;
neúplně se uvolnit;
obtížně spolehlivě měřit.

Proto se často vybírají stabilní aminokyseliny.

Volba závisí na pořadí peptidu a analytické metodě.

Které aminokyseliny se mohou během hydrolýzy měnit?

Kyselá hydrolýza může mít různé účinky.

Tryptofan

Tryptofan se během standardní kyselé hydrolýzy může z velké části rozložit.

Proto jsou zapotřebí upravené metody, pokud je třeba specificky měřit tryptofan.

Asparagin

Asparagin se může během hydrolýzy převést na aspartát.

Proto se asparagin a aspartát při klasické analýze ne vždy uvádějí samostatně.

Glutamin

Glutamin lze převést na glutamát.

Díky tomu lze glutamin a glutamát zobrazit společně.

Serin

Serin se může během dlouhodobé hydrolýzy částečně ztratit.

Threonin

Také threonin může částečně degradovat.

Cystein

Cystein může podléhat oxidačním změnám.

Pro spolehlivou analýzu může být nutná předchozí oxidace nebo upravená metoda.

Proč je doba hydrolýzy důležitá?

Peptidové vazby musí být dostatečně rozštěpeny.

Příliš krátká hydrolýza může vést k:

neúplný rozklad;
příliš nízkým naměřeným hodnotám aminokyselin.

Příliš dlouhá hydrolýza může vést k:

další rozklad citlivých aminokyselin;
ztráty při měření.

Proto se doba a teplota hydrolýzy kontrolují.

Někdy se používá několik dob hydrolýzy ke zkoumání ztrát nebo neúplného rozkladu.

Co je molární poměr?

Molární poměr popisuje relativní počty aminokyselin.

Předpokládejme, že peptid teoreticky obsahuje:

dva alaniny;
jeden glycin;
tři leuciny.

Teoretický molární poměr je:

2 : 1 : 3

Po analýze lze naměřené hodnoty normalizovat.

Když se poměr blíží teoretické hodnotě, podporuje to očekávané složení aminokyselin.

Malé odchylky mohou vzniknout v důsledku:

nejistota měření;
ztráty při hydrolýze;
derivatizace;
integrace chromatografických píků.

Co znamená normalizace?

Při normalizaci se naměřené hodnoty aminokyselin přepočítávají na relativní poměry.

Vhodnou aminokyselinu lze použít jako referenci.

Díky tomu lze naměřený profil porovnat s teoretickým složením.

Normalizace je užitečná pro zkoumání složení, ale automaticky neposkytuje absolutní množství peptidu.

Analýza aminokyselin versus čistota podle HPLC

Čistota podle HPLC a analýza aminokyselin měří různé vlastnosti.

Čistota podle HPLC obvykle zkoumá:

hlavní chromatografický pík;
relativní množství vedlejších píků.

Analýza aminokyselin zkoumá:

složení aminokyselin;
množství vybraných aminokyselin;
možná kvantifikace peptidů.

Vysoká čistota podle HPLC automaticky nedokazuje správnost složení aminokyselin.

Odpovídající složení aminokyselin automaticky nedokazuje nepřítomnost nečistot souvisejících s peptidy.

Tyto techniky se vzájemně doplňují.

Analýza aminokyselin versus hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie zkoumá poměr hmotnosti k náboji molekul.

Měření intaktní molekulové hmotnosti může podpořit závěr, že molekulová hmotnost odpovídá teoretické hodnotě.

Analýza aminokyselin zkoumá množství a poměr aminokyselin po rozkladu.

Obě techniky mají různé silné stránky.

Kombinace může poskytnout více informací o:

identita;
složení;
obsah peptidu.

Analýza aminokyselin versus stanovení peptidu

Analýzu aminokyselin lze použít jako metodu stanovení.

Stanovení peptidu popisuje tento cíl:

stanovit množství peptidu.

Analýza aminokyselin je jednou z technik, kterými lze tohoto cíle dosáhnout.

Dalšími možnými metodami stanovení jsou:

kvantitativní HPLC;
UV spektrofotometrie;
kvantifikace pomocí LC-MS;
hmotnostní bilance.

Jaký vliv mají protiionty?

Protiionty, jako jsou:

acetát;
chlorid;
TFA;

přispívají k celkové hmotnosti lyofilizovaného materiálu.

Při analýze aminokyselin se zkoumají především aminokyselinové složky peptidu.

Metoda tak může pomoci rozlišit mezi:

celková hmotnost materiálu;
skutečné množství peptidu.

Pro úplnou hmotnostní bilanci mohou být zapotřebí doplňkové analýzy.

Jaký vliv má zbytková vlhkost?

Zbytková vlhkost přispívá k celkové hmotnosti, ale nikoli ke složení aminokyselin.

Při výpočtu čistého obsahu peptidu může analýza vlhkosti poskytnout doplňující informace.

Komplexní hmotnostní bilance může zahrnovat:

obsah peptidu;
obsah vody;
obsah protiiontů;
ostatní složky.

Může analýza aminokyselin prokázat kontaminaci?

Některé odchylující se signály aminokyselin mohou poukazovat na neočekávané složky.

Metoda však není navržena k detekci každé možné kontaminace.

Pro následující analýzy mohou být zapotřebí jiné techniky:

organické nečistoty;
zbytková rozpouštědla;
kovy;
mikrobiologická kontaminace;
endotoxiny.

Co může být uvedeno v COA?

Analytický certifikát může obsahovat například tyto informace:

test: analýza aminokyselin;
analytická metoda;
naměřené poměry aminokyselin;
teoretické poměry;
vypočtený obsah peptidu;
datum testu;
číslo šarže.

Ne každý COA obsahuje analýzu aminokyselin.

Pokud byla provedena pouze HPLC a MS, nelze z toho odvodit úplnou kvantifikaci aminokyselin.

Proč je vazba na šarži důležitá?

Analýza aminokyselin musí být spojena s analyzovanou šarží.

Důležité údaje jsou:

číslo šarže;
název produktu;
datum analýzy;
laboratoř;
analytická metoda.

Analytický protokol bez jasné vazby na šarži má pro sledovatelnost menší hodnotu.

Co znamená nejistota měření?

Každá kvantitativní analýza obsahuje nejistotu měření.

Zdroje variability při analýze aminokyselin mohou zahrnovat:

příprava vzorku;
hydrolýza;
ztráta aminokyselin;
derivatizace;
kalibrace;
chromatografická separace;
integrace píků.

Výsledky proto nelze považovat za absolutně bezchybné.

Proč je validace metody důležitá?

Metoda musí být vhodná pro zamýšlený účel.

Mezi relevantní validační charakteristiky při kvantitativní analýze aminokyselin mohou patřit:

přesnost;
preciznost;
linearita;
specificita;
měřicí rozsah;
robustnost;
opakovatelnost.

Metoda vhodná pro kvalitativní profil aminokyselin není automaticky dostačující pro přesnou kvantifikaci peptidu.

Vědecká omezení

Analýza aminokyselin má významná omezení.

Metoda samostatně neurčuje:

přesné pořadí aminokyselin;
molekulová hmotnost;
čistota stanovená pomocí HPLC;
trojrozměrná struktura;
biologická aktivita;
sterilita;
obsah endotoxinů.

Kromě toho se některé aminokyseliny mohou během hydrolýzy měnit.

Pro komplexní posouzení kvality je třeba kombinovat více analytických technik.

Shrnutí

Analýza aminokyselin zkoumá složení a množství aminokyselin v peptidu.

Při klasické analýze se peptidový řetězec nejprve rozštěpí hydrolýzou.

Poté jsou aminokyseliny:

separovány;
detekovány;
kvantifikovány;
porovnáno s teoretickým složením.

Analýzu aminokyselin lze použít pro:

kontrola složení aminokyselin;
posouzení molárních poměrů;
kvantifikace obsahu peptidu;
podpora identifikace.

Metoda má omezení, protože některé aminokyseliny se mohou během hydrolýzy měnit.

Proto se analýza aminokyselin přednostně kombinuje s:

HPLC;
LC-MS;
MS/MS;
stanovení obsahu peptidu;
analýza zbytkové vlhkosti;
analýza protiiontů.

Upozornění týkající se výzkumu

Výzkumné peptidy Peptidera jsou nabízeny výhradně pro Research Use Only (RUO) a jsou určeny pro laboratorní výzkum a analytické aplikace.

Není určeno ke konzumaci lidmi ani zvířaty, k diagnostickému použití, terapeutickému použití ani k vlastní aplikaci.

Znalosti o peptidech & kontrola kvality

Související produkty Peptidera:
Lyofilizované výzkumné peptidy s identifikací šarže a dostupnými analytickými údaji o kvalitě

Související interní blogy:

PB-0230 — Čistota peptidu a HPLC
PB-0231 — Hmotnostní spektrometrie u peptidů
PB-0233 — Stanovení obsahu peptidu: čistota versus obsah peptidu
PB-0234 — Zbytková vlhkost v lyofilizovaných peptidech
PB-0238 — Protiionty u peptidů

Návrhy interních odkazů:

Odkaz na PB-0233 o analýze aminokyselin jako stanovení obsahu peptidu
Odkaz na PB-0230 o rozdílu oproti čistotě stanovené pomocí HPLC
Odkaz na PB-0231 o molekulové hmotnosti a analýze sekvence
Odkaz na PB-0234 o zbytkové vlhkosti a čistém obsahu peptidu
Odkaz na PB-0238 o protiionech a hmotnostní bilanci
Odkaz na stránku Peptidera s certifikáty analýzy
Odkaz na kolekci výzkumných peptidů

Země/oblast

Jazyk