Hmotnostní spektrometrie peptidů vysvětlena

Hmotnostní spektrometrie u peptidů: jak se zkoumá molekulová identita?

Při kontrole kvality výzkumných peptidů se často kombinuje několik analytických technik. HPLC může poskytnout informace o chromatografické čistotě, ale vysoký hlavní pík automaticky nedokazuje, že je přítomen správný peptid.

K dalšímu zkoumání molekulové identity se často používá hmotnostní spektrometrie.

Hmotnostní spektrometrie, obvykle zkráceně MS, je analytická technika, při níž se měří poměr hmotnosti a náboje ionizovaných molekul. Při analýze peptidů lze naměřenou molekulovou hmotnost porovnat s teoreticky očekávanou hmotností sekvence aminokyselin.

Pokud se tyto hodnoty shodují, podporuje to identifikaci zkoumaného peptidu. Ani hmotnostní spektrometrie však sama o sobě neposkytuje úplný obraz o kvalitě.

V tomto článku si vysvětlíme, jak hmotnostní spektrometrie funguje, proč mohou peptidy vytvářet více hmotnostních signálů a jak se výsledky MS interpretují společně s HPLC a dalšími analytickými metodami.

---

Co je hmotnostní spektrometrie?

Hmotnostní spektrometrie je analytická technika, při níž se molekuly převádějí na nabité částice, tedy ionty.

Tyto ionty jsou následně separovány a měřeny na základě jejich poměru hmotnosti a náboje.

Tento poměr se označuje jako:

m/z

Zde platí:

• m hmotnost;
• z elektrický náboj.

Hmotnostní spektrometr tedy ne vždy měří přímo celou molekulovou hmotnost. Přístroj měří poměr hmotnosti a náboje.

U větších molekul, včetně mnoha peptidů, může vzniknout více nábojů. Proto může být tentýž peptid viditelný na různých místech hmotnostního spektra.

---

Proč se při analýze peptidů používá hmotnostní spektrometrie?

Peptid se skládá z konkrétní sekvence aminokyselin.

Každá kombinace aminokyselin má teoreticky vypočitatelnou molekulovou hmotnost.

Hmotnostní spektrometrii lze použít ke zkoumání, zda naměřená hmotnost odpovídá této teoretické hodnotě.

MS analýza může přispět k:

• potvrzení molekulové identity;
• porovnání s teoretickou molekulovou hmotností;
• detekce určitých chemických modifikací;
• analýza produktů rozkladu;
• zkoumání variant peptidů;
• porovnání výrobních šarží.

Odpovídající hmotnost podporuje identitu peptidu.

Výsledek je však vždy nutné posuzovat v kombinaci s analytickou metodou a dalšími údaji o kvalitě.

---

Jaká je teoretická molekulová hmotnost?

Teoretická molekulová hmotnost se vypočítává na základě:

• sekvence aminokyselin;
• počet aminokyselin;
• případné chemické modifikace;
• molekulární tvar;
• specifické koncové skupiny.

Když aminokyseliny vytvoří peptidový řetězec, vznikají peptidové vazby.

Při vzniku každé peptidové vazby se odštěpí molekula vody. Hmotnost celého peptidu proto není jednoduše součtem všech jednotlivých aminokyselin.

Také modifikace mohou ovlivnit hmotnost.

Příklady:

• amidace;
• acetylace;
• fosforylace;
• oxidace;
• přidání řetězců mastných kyselin;
• tvorby disulfidových můstků.

Teoretickou hmotnost je proto nutné vypočítat pro přesnou molekulovou strukturu.

---

Co znamená molekulová váha?

Termíny molekulová hmotnost a molekulová váha se často používají zaměnitelně.

V laboratorních zprávách se tato hodnota obvykle uvádí v:

• dalton, zkráceně Da;
• kilodalton, zkráceně kDa.

Jeden dalton přibližně odpovídá hmotnosti jednoho atomu vodíku.

Peptid s molekulovou hmotností 3 000 Da má tedy hmotnost přibližně 3 kDa.

Molekulová hmotnost peptidů se může výrazně lišit v závislosti na:

• délka řetězce;
• složení aminokyselin;
• chemické modifikace.

---

Jak funguje hmotnostní spektrometr?

Hmotnostní spektrometr se obvykle skládá z několika částí.

1. Zavedení vzorku

Peptid se nejprve připraví a vloží do přístroje.

Příprava vzorku může ovlivnit:

• intenzita signálu;
• detekovatelnost;
• tvorba iontů;
• signály pozadí.

2. Ionizace

Molekuly se elektricky nabijí.

Mezi běžně používané techniky analýzy peptidů patří:

• elektrosprejová ionizace;
• matrix-assisted laser desorption/ionization.

3. Analýza hmotnosti

Vzniklé ionty se oddělují na základě svého poměru hmotnosti k náboji.

4. Detekce

Detektor zaznamenává ionty.

5. Zpracování dat

Naměřené signály se převádějí na hmotnostní spektrum.

Toto spektrum obsahuje píky odpovídající detekovaným iontům.

---

Co je elektrosprejová ionizace?

Elektrosprejová ionizace, zkráceně ESI, je běžně používaná ionizační technika pro peptidy.

Během ESI je kapalný vzorek veden malým otvorem, na který je přivedeno elektrické napětí.

Tím vznikají elektricky nabité kapičky.

Když se rozpouštědlo odpaří, zůstanou nabité molekuly.

Důležitou vlastností ESI je, že větší molekuly mohou získat více elektrických nábojů.

Peptid se může například vyskytovat jako:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

M zde označuje molekulovou hmotnost peptidu.

Více nábojů vede k různým signálům m/z pro tutéž molekulu.

---

Proč má jeden peptid více píků?

Když peptid přijme více protonů, vznikají různé nabité formy.

Předpokládejme, že peptid má molekulovou hmotnost přibližně 3 000 Da.

Možné signály jsou tedy přibližně:

• jeden kladný náboj: m/z přibližně 3.001;
• dva kladné náboje: m/z přibližně 1.501;
• tři kladné náboje: m/z přibližně 1.001.

Všechny tyto signály mohou patřit témuž peptidu.

Software může toto rozložení nábojů použít k výpočtu původní molekulové hmotnosti.

Tento proces se nazývá dekonvoluce.

---

Co je dekonvoluované hmotnostní spektrum?

Surové měření ESI může obsahovat více nabitých píků.

To může interpretaci zkomplikovat.

Pomocí dekonvolučního softwaru se různé nabité formy převedou na jednu odhadovanou molekulovou hmotnost.

Dekonvoluované spektrum lze proto snadněji porovnat s:

• teoretická hmotnost;
• referenční standard;
• specifikace produktu.

Kvalita výpočtu závisí na:

• intenzita signálu;
• rozlišení;
• šum pozadí;
• nastavení softwaru;
• přítomnost překrývajících se složek.

---

Co je MALDI?

Desorpce/ionizace pomocí laseru podporovaná matricí, zkráceně MALDI, je další ionizační technika.

Peptid se smíchá s matricovým materiálem a nanese na měřicí destičku.

Laser aktivuje matrici, čímž vznikají peptidové ionty.

MALDI často produkuje především jednomocně nabité ionty.

Díky tomu může spektrum vypadat jednodušeji než spektrum ESI.

MALDI se často kombinuje s analyzátorem doby průletu.

Tato kombinace se označuje jako:

MALDI-TOF

---

Co je doba průletu?

V analyzátoru doby průletu se ionty urychlují elektrickým polem.

Poté procházejí měřicí trubicí.

Ionty s nižším poměrem hmotnosti k náboji obvykle dosáhnou detektoru rychleji než ionty s vyšším poměrem.

Doba průletu se používá k výpočtu hodnoty m/z.

Systémy TOF lze použít pro:

• identifikace peptidů;
• stanovení hmotnosti;
• porovnání molekulárních variant.

Konečná přesnost závisí na kalibraci, nastavení přístroje a přípravě vzorku.

---

Co je LC-MS?

Kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií, zkráceně LC-MS, kombinuje kapalinovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií.

Složky se nejprve chromatograficky oddělí.

Poté jsou jednotlivé signály analyzovány hmotnostním spektrometrem.

LC-MS může kombinovat informace o:

• retenční čas;
• chromatografický profil;
• molekulová hmotnost;
• možné nečistoty;
• produkty rozkladu.

LC-MS tak může poskytnout hlubší vhled než samostatná analýza HPLC nebo MS.

---

Jaký je rozdíl mezi HPLC a hmotnostní spektrometrií?

HPLC a hmotnostní spektrometrie odpovídají na různé analytické otázky.

HPLC

HPLC může poskytnout informace o:

• chromatografickou čistotu;
• relativní množství detekovaných složek;
• retenční časy;
• změny v chromatografickém profilu.

Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie může poskytnout informace o:

• molekulová hmotnost;
• možná identita;
• chemické modifikace;
• určité degradační produkty.

Zjednodušené srovnání:

Proto se obě techniky často kombinují.

---

Může se stejná molekulová hmotnost vyskytovat u různých peptidů?

Ano.

Různé aminokyselinové sekvence mohou mít stejnou nebo téměř stejnou celkovou hmotnost.

Někdy se jim říká isobarické struktury.

Odpovídající hmotnost proto nemusí vždy dokazovat, že je celé pořadí aminokyselin správné.

Pro podrobnější identifikaci mohou být zapotřebí doplňkové techniky, například:

• tandemová hmotnostní spektrometrie;
• fragmentační analýza;
• analýza aminokyselin;
• analýza sekvence;
• porovnání s referenčním standardem.

Potřebná analytická metoda závisí na požadované míře jistoty.

---

Co je tandemová hmotnostní spektrometrie?

Tandemová hmotnostní spektrometrie se obvykle zapisuje jako:

MS/MS

Během MS/MS se vybraný peptidový ion dále fragmentuje.

Vzniklé fragmenty se následně znovu měří.

Fragmentační profil může poskytnout informace o:

• pořadí aminokyselin;
• umístění modifikací;
• identita peptidu;
• struktura degradačních produktů.

MS/MS tak může poskytnout více strukturních informací než pouze celková molekulová hmotnost.

---

Co jsou peptidové fragmenty?

Když se peptidový řetězec během MS/MS štěpí na specifických místech, vznikají fragmentové ionty.

Běžné typy fragmentů jsou:

• b-ionty;
• y-ionty.

Hmotnosti těchto fragmentů lze použít k rekonstrukci částí aminokyselinové sekvence.

Interpretace může být složitá.

Ne každý peptid fragmentuje stejným způsobem.

Mezi faktory, které mohou mít vliv, patří:

• složení aminokyselin;
• elektrický náboj;
• velikost peptidu;
• fragmentační metoda;
• chemické modifikace.

---

Dokáže hmotnostní spektrometrie detekovat oxidaci?

Některé oxidativní změny způsobují měřitelnou změnu hmotnosti.

Například přidání jednoho atomu kyslíku často vede ke zvýšení hmotnosti přibližně o 16 Da.

Hmotnostní spektrometrie tak může pomoci identifikovat určité oxidační produkty.

Detekce závisí na:

• koncentrace;
• rozlišení přístroje;
• analytická metoda;
• separace složek.

Ne každou oxidativní změnu lze zcela lokalizovat pouze na základě jediného hmotnostního signálu.

K tomu může být zapotřebí doplňková fragmentační analýza.

---

Může hmotnostní spektrometrie určit množství peptidu?

Ne automaticky.

Intenzitu hmotnostního signálu ovlivňuje:

• účinnost ionizace;
• molekulární vlastnosti;
• rozpouštědlo;
• nastavení přístroje;
• přítomnost dalších složek.

Dvakrát silnější signál proto automaticky neznamená, že je přítomno dvakrát více peptidu.

Spolehlivá kvantifikace vyžaduje validované metody a vhodné standardy.

Možné techniky:

• kvantitativní LC-MS;
• interní standardy;
• izotopicky značené referenční látky;
• kalibrované testy HPLC.

---

Lze hmotnostní spektrometrií prokázat sterilitu?

Ne.

Hmotnostní spektrometrie pro identifikaci peptidu není testem sterility.

Výsledek neposkytuje přímé informace o:

• bakterie;
• plísně;
• mikrobiální růst;
• sterilita výrobku.

Sterilita vyžaduje specifické mikrobiologické testovací metody.

Endotoxiny se rovněž automaticky neurčují během standardní peptidové analýzy pomocí MS.

---

Lze hmotnostní spektrometrií měřit endotoxiny?

Nikoli standardní analýzou identity.

Endotoxiny jsou komplexní bakteriální složky.

Pro testování endotoxinů se používají specifické metody, například:

• test s lyzátem amebocytů Limulus;
• metody rekombinantního faktoru C.

Správné hmotnostní spektrum peptidu proto nedokazuje, že materiál má nízký obsah endotoxinů.

Identita, čistota, sterilita a endotoxiny jsou samostatné parametry kvality.

---

Proč se mohou laboratorní výsledky lišit?

Různé laboratoře mohou uvádět mírně odlišné hodnoty hmotnosti.

Možné příčiny:

• typ přístroje;
• kalibrace;
• ionizační metoda;
• příprava vzorku;
• solné adukty;
• použitý software;
• rozlišení;
• interpretační metoda.

Malé rozdíly automaticky neznamenají, že je výsledek nesprávný.

Naměřenou hodnotu je třeba posuzovat v rámci:

• přesnost přístroje;
• očekávaná molekulová forma;
• použitá analytická metoda.

---

Co jsou addukty?

Během hmotnostní spektrometrie se peptidové ionty mohou spojovat s jinými nabitými částicemi.

Příklady:

• sodík;
• draslík;
• amonný ion.

V důsledku toho mohou vznikat další píky.

Natriový adukt má například jinou hmotnost než jednoduše protonovaný peptidový ion.

Addukty automaticky neznamenají přítomnost jiného peptidu.

Interpretace vyžaduje znalost:

• příprava vzorku;
• použité pufry;
• očekávané iontové formy.

---

Jaké informace patří do zprávy z MS?

Profesionální analytická zpráva může mimo jiné obsahovat:

• název peptidu;
• číslo šarže nebo partie;
• teoretická molekulová hmotnost;
• naměřená molekulová hmotnost;
• ionizační metoda;
• typ hmotnostního spektrometru;
• hmotnostní spektrum;
• datum analýzy;
• název laboratoře.

Při podrobnější analýze lze uvést také:

• rozsah měření;
• rozlišení;
• hmotnostní přesnost;
• údaje o fragmentaci;
• použitý software.

Potřebný rozsah dokumentace závisí na účelu výzkumu.

---

Hmotnostní spektrometrie a kontrola šarží

Každou výrobní šarži lze zkoumat samostatně.

Analýza MS specifická pro danou šarži podporuje:

• kontrolu identity;
• porovnání mezi šaržemi;
• sledovatelnost;
• šetření odchylek.

Číslo šarže na analytickém protokolu musí odpovídat identifikaci na lahvičce.

Výsledek hmotnostně spektrometrické analýzy bez jasného přiřazení ke konkrétní šarži má pro sledovatelnost omezenou hodnotu.

---

Vědecká omezení

Hmotnostní spektrometrie je účinná analytická technika, nikoli však úplné posouzení kvality.

Shodná molekulová hmotnost automaticky nedokazuje:

• úplnou aminokyselinovou sekvenci;
• vysokou chromatografickou čistotu;
• správné množství peptidu;
• sterilitu;
• nízký obsah endotoxinů;
• biologickou aktivitu;
• dlouhodobou stabilitu.

Pro širší posouzení může být zapotřebí více metod:

• HPLC;
• LC-MS;
• MS/MS;
• kvantitativní stanovení;
• stabilitní studie;
• analýzu vlhkosti;
• doplňkové testy specifické pro daný produkt.

Výsledky je třeba interpretovat společně.

---

Shrnutí

Hmotnostní spektrometrie se používá ke zkoumání molekulové hmotnosti výzkumných peptidů.

Tato technika měří poměr hmotnosti a náboje ionizovaných molekul.

Při analýze peptidů lze naměřenou hmotnost porovnat s teoreticky očekávanou hmotností.

Shoda podporuje molekulární identifikaci.

Mezi důležité analytické techniky patří:

• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;
• MS/MS.

Hmotnostní spektrometrie však automaticky neposkytuje informace o:

• přesné množství;
• chromatografickou čistotu;
• sterilitu;
• endotoxiny;
• biologickou aktivitu.

Proto se MS často kombinuje s HPLC a dalšími analýzami kvality.

---

Vyloučení odpovědnosti za výzkumné použití

Výzkumné peptidy Peptidera jsou nabízeny výhradně pro Research Use Only (RUO) a jsou určeny pro laboratorní výzkum a analytické použití.

Není určeno k lidské ani zvířecí spotřebě, diagnostickému použití, terapeutickému použití ani k vlastní aplikaci.

---

Kategorie:
Znalosti o peptidech a kontrola kvality

Související produkty Peptidera:
Lyofilizované výzkumné peptidy s identifikací šarže a dostupnými analytickými údaji o kvalitě

Související interní blogy:

• PB-0227 — Lyofilizované peptidy a lyofilizace
• PB-0228 — Lahvičky s peptidy a integrita obalu
• PB-0229 — Čísla šarží a sledovatelnost
• PB-0230 — Čistota peptidů a HPLC
• Co je Certificate of Analysis?

Návrhy interních odkazů:

• Odkaz na PB-0230 týkající se rozdílu mezi HPLC a MS
• Odkaz na PB-0229 týkající se analýzy specifické pro šarži
• Odkaz na stránku s výsledky hmotnostně spektrometrického testování a certifikátem COA
• Odkaz na kolekci výzkumných peptidů
• Odkaz na stránku o nezávislé laboratorní analýze