Vysvětlení standardů referenčních peptidů
Peptidové referenční standardy: proč je analytické srovnání důležité
Při kvalitativní analýze výzkumných peptidů se často používají techniky, jako jsou:
- HPLC;
- LC-MS;
- stanovení obsahu peptidu;
- analýza aminokyselin;
- UV spektrofotometrie.
Tyto přístroje vytvářejí naměřená data, ale signál detektoru ani chromatografický pík nemají automaticky přesný význam.
Pro spolehlivou identifikaci nebo kvantifikaci neznámého vzorku jej lze porovnat s materiálem, jehož relevantní vlastnosti již byly pečlivě stanoveny.
Takový materiál se nazývá referenční standard.
Dobře charakterizovaný peptidový referenční standard lze použít pro:
- identifikace;
- porovnání retenčních časů;
- kvantifikace;
- kalibrace;
- hodnocení HPLC metod;
- zkoumání nečistot;
- analýza degradačních produktů;
- podpora metrologické návaznosti.
Kvalita analytického výsledku proto nezávisí pouze na laboratorním přístroji. Důležitá je také identita, čistota, obsah peptidu, skladování a dokumentace použitého referenčního standardu.
Referenční standard navíc automaticky není totéž co libovolný vzorek s vysokým procentem podle HPLC. Pro kvantitativní použití musí být jasné, kolik skutečného peptidu je přítomno a které nepeptidové složky přispívají k celkové hmotnosti.
V tomto článku se zabýváme tím, co jsou peptidové referenční standardy, jak se liší primární a sekundární standardy a proč je analytické srovnání důležité pro spolehlivou analýzu peptidů.
Co je peptidový referenční standard?
Peptidový referenční standard je pečlivě charakterizovaný materiál, který se používá jako srovnávací základ při laboratorní analýze.
V závislosti na cíli výzkumu lze stanovit například tyto vlastnosti:
- aminokyselinová sekvence;
- molekulová hmotnost;
- identita;
- čistota podle HPLC;
- obsah peptidu;
- obsah vody;
- obsah protiiontů;
- přítomnost relevantních nečistot;
- stabilita při skladování.
Standard lze následně použít k analytickému srovnání neznámého vzorku.
Požadovaná charakterizace závisí na použití.
Standard pro identifikaci nemusí vždy splňovat přesně stejné požadavky jako standard pro kvantitativní stanovení.
Proč je nutné analytické srovnání?
Laboratorní přístroj měří fyzikální nebo chemický signál.
Příklady jsou:
- UV absorpce;
- fluorescence;
- plocha chromatografického píku;
- poměr hmotnosti k náboji;
- intenzita iontů.
Signál se automaticky nerovná přesnému množství peptidu.
K tomu je zapotřebí spolehlivý vztah mezi:
- známé množství;
- naměřený signál;
- neznámý vzorek.
Referenční standard může pomoci tento vztah stanovit.
Jednoduchý příklad
Představme si, že laboratoř chce pomocí kvantitativní HPLC stanovit množství peptidu.
Laboratoř připravuje různá řešení z charakterizovaného referenčního standardu:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Každé řešení je analyzováno.
Naměřené plochy píků se vynesou proti známým koncentracím.
Tím vznikne kalibrační křivka.
Následně se změří neznámý vzorek.
Koncentraci lze vypočítat porovnáním signálu vzorku s kalibrační křivkou.
Spolehlivost tohoto výpočtu závisí mimo jiné na:
- kvalita referenčního standardu;
- správný výpočet koncentrace;
- přesné vážení;
- přesné pipetování;
- linearita metody;
- stabilita roztoků.
Co je primární referenční standard?
Primární referenční standard je materiál, jehož relevantní vlastnosti byly podrobně stanoveny.
Standard lze charakterizovat několika nezávislými analytickými technikami.
Možné analýzy zahrnují:
- HPLC;
- LC-MS;
- analýza aminokyselin;
- stanovení obsahu vody;
- analýza protiiontů;
- NMR;
- elementární analýza;
- hmotnostní bilance.
Cílem je s vysokou spolehlivostí stanovit:
- jaký materiál je přítomen;
- jak čistý je;
- kolik požadované složky je přítomno;
- které korekční faktory jsou potřebné.
Primární standard lze následně použít ke kvalifikaci dalších standardů.
Co je sekundární referenční standard?
Sekundární referenční standard se také nazývá:
- pracovní standard;
- pracovní standard;
- interní referenční standard.
Tento standard je kvalifikován porovnáním s primárním nebo oficiálně uznaným referenčním standardem.
Sekundární standard lze použít pro rutinní laboratorní analýzy.
Možné výhody jsou:
- větší dostupnost;
- nižší náklady;
- zachování primárního standardu;
- efektivnější rutinní používání.
Sekundární standard však musí být pravidelně kontrolován a správně skladován.
Proč se primární standard nepoužívá vždy?
Primární standardy mohou být:
- omezeně dostupné;
- nákladné;
- dodávány v malých množstvích;
- mohou být určeny pro specifické oficiální analytické metody.
Kvalifikací sekundárního standardu vůči primárnímu standardu lze provádět rutinní zkoušky bez neustálého používání primárního standardu.
Spolehlivost závisí na kvalitě kvalifikace.
Co znamená kvalifikace pracovního standardu?
Kvalifikace znamená, že vlastnosti pracovního standardu jsou systematicky zkoumány a porovnávány s vhodným referenčním materiálem.
Kvalifikační program může zahrnovat:
- kontrola identity;
- čistota podle HPLC;
- stanovení obsahu peptidu;
- obsah vody;
- obsah protiiontů;
- srovnání chromatogramů;
- srovnání hmotnostních spekter;
- hodnocení stability.
Potřebné zkoušky závisí na zamýšleném použití.
Identita versus kvantifikace
Referenční standard může mít různé analytické funkce.
Identifikační standard
Identifikační standard se používá ke zjištění, zda neznámý vzorek odpovídá očekávanému peptidu.
Možná srovnání jsou:
- Doba retence HPLC;
- molekulová hmotnost;
- hmotnostně spektrometrický profil;
- spektroskopické vlastnosti.
Kvantitativní standard
Kvantitativní standard se používá ke stanovení množství peptidu.
K tomu musí být skutečný obsah peptidu znám s dostatečnou spolehlivostí.
Samotná vysoká HPLC čistota k tomu obvykle nestačí.
Proč HPLC čistota nestačí?
Peptid může mít například HPLC čistotu 99 %.
To automaticky neznamená, že 99 % celkové hmotnosti tvoří peptid.
Materiál může dále obsahovat:
- voda;
- acetát;
- chlorid;
- TFA;
- soli;
- jiné chromatograficky neměřené složky.
U kvantitativního standardu je proto třeba rozlišovat mezi:
- chromatografická čistota;
- celková hmotnost materiálu;
- čistý obsah peptidu.
Co je přiřazená hodnota?
Referenční standard může mít přiřazenou hodnotu.
Tato hodnota například popisuje:
- obsah peptidu;
- čistota;
- koncentrace;
- účinnost;
- množství v balení.
Přiřazená hodnota musí vycházet z vhodných analytických údajů.
Může být uveden také korekční faktor.
Co je korekční faktor?
K přepočtu naváženého množství materiálu na skutečné množství peptidu se používá korekční faktor.
Předpokládejme:
- navážené množství materiálu: 10,0 mg;
- přiřazený obsah peptidu: 85 %;
- skutečné množství peptidu: 8,5 mg.
Pokud se tato korekce nepoužije, může být vypočtená koncentrace nadhodnocena.
Proč je čistý obsah peptidu důležitý?
Čistý obsah peptidu popisuje podíl skutečného peptidu ve zkoumaném materiálu.
Při výpočtu lze zohlednit faktory, jako jsou:
- zbytková vlhkost;
- protiionty;
- organické složky;
- anorganické složky.
Pro kvantitativní analýzu je to často relevantnější než samotná HPLC čistota.
Jakou roli hraje analýza aminokyselin?
Analýzu aminokyselin lze použít ke stanovení obsahu peptidu.
Peptidový řetězec se přitom hydrolyzuje na jednotlivé aminokyseliny.
Vybrané aminokyseliny jsou následně kvantifikovány.
Když je známo, kolik těchto aminokyselin je přítomno v každém peptidovém řetězci, lze vypočítat množství peptidu.
Analýza aminokyselin tak může přispět k přiřazení hodnoty referenčnímu standardu.
Jakou roli hraje hmotnostní spektrometrie?
Hmotnostní spektrometrie může pomoci potvrdit:
- molekulová hmotnost;
- identita;
- určité modifikace;
- produkty degradace.
LC-MS může kombinovat chromatografickou separaci s hmotnostní detekcí.
Odpovídající molekulová hmotnost podporuje identitu, ale sama o sobě nedokazuje:
- přesné množství peptidu;
- úplná sekvence;
- nepřítomnost všech nečistot.
Proto se často kombinuje více technik.
Jakou roli hraje MS/MS?
Při tandemové hmotnostní spektrometrii se vybraný peptidový ion fragmentuje.
Fragmenty mohou poskytnout informace o pořadí aminokyselin.
MS/MS tak může poskytnout další podporu pro:
- potvrzení sekvence;
- lokalizace modifikací;
- identifikace produktů degradace.
Analytická schopnost závisí na:
- velikost peptidu;
- fragmentace;
- rozlišení přístroje;
- zpracování dat.
Jakou roli hraje HPLC?
HPLC lze použít pro:
- porovnání retenčních časů;
- posouzení chromatografické čistoty;
- zkoumání vedlejších píků;
- kvantitativní analýza;
- zkouška stability.
Při porovnávání musí být referenční standard i vzorek analyzovány stejnou kontrolovanou metodou.
Důležité parametry jsou:
- typ kolony;
- mobilní fáze;
- teplota;
- průtok;
- detekční vlnová délka.
Co je kalibrační křivka?
Kalibrační křivka popisuje vztah mezi známými koncentracemi a naměřenými signály detektoru.
Spolehlivou kalibrační křivku je třeba hodnotit z hlediska:
- linearita;
- rozsah měření;
- reprodukovatelnost;
- odchylky;
- vhodnost pro analytickou metodu.
Neznámá koncentrace se vypočítává v rámci validovaného rozsahu měření.
Extrapolace mimo tento rozsah může způsobit dodatečnou nejistotu.
Co je linearita?
Linearita popisuje, do jaké míry se měřený signál mění úměrně koncentraci.
Když se koncentrace zdvojnásobí, očekává se v lineárním rozsahu odpovídající změna signálu.
Tento vztah nemusí být pro každou metodu a v každém koncentračním rozsahu lineární.
Proto se relevantní rozsah měření zkoumá experimentálně.
Co znamená analytická návaznost?
Analytická nebo metrologická návaznost popisuje, jak je výsledek měření prostřednictvím zdokumentovaného řetězce porovnání propojen s uznávaným referenčním standardem.
Důležitými součástmi jsou:
- použitý standard;
- certifikát;
- přiřazená hodnota;
- kalibrace;
- analytická metoda;
- nejistota měření;
- dokumentace.
Návaznost podporuje porovnatelnost výsledků mezi:
- různé dny měření;
- laboratoře;
- přístroje;
- šarže.
Co je metrologická návaznost?
Metrologie je věda o měření.
Metrologická návaznost vyžaduje zdokumentovaný a nepřerušený řetězec porovnání ke specifikovanému referenčnímu standardu. Každý krok přispívá k celkové nejistotě měření.
U analýzy peptidů může praktická metrologická návaznost mimo jiné záviset na:
- referenční standard;
- stanovený obsah peptidu;
- kalibrované váhy;
- objemové zařízení;
- analytická metoda.
Co je nejistota měření?
Každé analytické měření obsahuje nejistotu.
Možné zdroje jsou:
- nejistota referenčního standardu;
- vážení;
- pipetování;
- ředění;
- variabilita přístroje;
- kalibrace;
- integrace píků;
- příprava vzorku.
Nejistota měření neznamená, že je výsledek nespolehlivý.
Popisuje odhadované rozmezí, v němž se skutečná hodnota může rozumně nacházet.
Proč musí být standardy specifické pro jednotlivé šarže?
Také referenční standardy se vyrábějí v šaržích.
Různé šarže se mohou lišit v:
- obsah peptidu;
- obsah vody;
- obsah protiiontů;
- profil čistoty;
- stabilita.
Proto musí být jasné, které číslo šarže referenčního standardu bylo použito.
Co je uvedeno na certifikátu referenčního standardu?
Certifikát může obsahovat informace o:
- název;
- katalogové číslo;
- číslo šarže;
- přiřazená hodnota;
- zamýšlené použití;
- podmínky skladování;
- informace o platnosti;
- analytické metody;
- korekční faktor.
Ne každý certifikát obsahuje stejné údaje.
Standard musí být používán podle příslušných pokynů.
Proč jsou podmínky skladování důležité?
Referenční standard se může během skladování změnit.
Mezi možné procesy patří:
- oxidaci;
- deamidaci;
- absorpci vlhkosti;
- agregaci;
- degradaci.
Proto lze stanovit podmínky pro:
- teplota;
- ochrana před světlem;
- ochrana před vlhkostí;
- použití po otevření;
- doba skladování.
Nesprávně skladovaný standard může způsobit nesprávná porovnání.
Co je datum exspirace?
Některé referenční standardy mají stanovené datum exspirace.
Jiné standardy se řídí:
- kontrola platnosti;
- datum rekvalifikace;
- aktuální stav šarže.
Laboratoř musí ověřit, zda je standard v okamžiku použití vhodný a platný.
Co je rekvalifikace?
Rekvalifikace je opětovné posouzení referenčního standardu.
Možné analýzy zahrnují:
- HPLC;
- LC-MS;
- stanovení obsahu peptidu;
- obsah vody;
- porovnání s primárním standardem.
Rekvalifikace může být nutná po:
- předem stanovená doba použitelnosti;
- dlouhodobé skladování;
- změna vzhledu;
- odchylný výsledek analýzy.
Proč jsou standardy nečistot důležité?
Jako standard lze použít nejen požadovaný peptid.
Jako referenční materiál mohou sloužit také známé nečistoty nebo degradační produkty.
Příklady jsou:
- oxidační produkty;
- deamidované varianty;
- fragmenty;
- sekvence s delecemi;
- komponenty související s agregací.
Tyto standardy mohou pomoci identifikovat a kvantifikovat vedlejší píky.
Co jsou degradační standardy?
Degradační standard představuje známou degradační variantu.
Lze jej použít ke zkoumání:
- kde degradační produkt eluoval;
- jaká molekulová hmotnost je přítomna;
- jak citlivá je analytická metoda;
- kolik degradačního produktu je přítomno.
Ne každý degradační produkt je dostupný jako čistý standard.
Referenční standardy a validace metody
Analytická metoda musí být prokazatelně vhodná pro zamýšlený účel.
ICH Q2(R2) popisuje zásady validace analytických postupů. Mezi relevantní charakteristiky mohou patřit mimo jiné specificita, přesnost, preciznost, linearita a rozsah měření.
Referenční standardy lze použít při zkoumání:
- přesnost;
- specificita;
- linearita;
- kvantitativní rozsah;
- výkonnost metody.
Co je přesnost?
Přesnost popisuje, jak blízko je naměřený výsledek přijaté referenční hodnotě.
Dobře charakterizovaný standard lze použít k posouzení přesnosti analytické metody.
Co je preciznost?
Preciznost popisuje, jak blízko jsou opakované výsledky měření u sebe.
Metoda může poskytovat velmi precizní výsledky, které se přesto systematicky odchylují.
Proto jsou důležité přesnost i správnost.
Co je specificita?
Specificita popisuje, zda analytická metoda dokáže požadovanou složku dostatečně odlišit od ostatních složek.
Příklady jsou:
- nečistoty;
- produkty degradace;
- složky formulace;
- protiionty.
Vhodný referenční standard může pomoci při identifikaci hlavního píku.
Mohou dvě laboratoře získat odlišné výsledky?
Ano.
Rozdíly mohou vznikat v důsledku:
- referenční standard;
- analytická metoda;
- příprava vzorku;
- zařízení;
- kalibrace;
- zpracování dat;
- nejistota měření.
Použití dobře charakterizovaných standardů a validovaných metod může zlepšit srovnatelnost.
Stává se komerční peptid automaticky referenčním standardem?
Ne.
Komerční peptid může být vhodný jako výzkumný materiál, ale automaticky se nestává kvalifikovaným referenčním standardem.
Pro použití jako standard musí být jasně uvedeno:
- identita;
- obsah peptidu;
- čistota;
- obsah vody;
- obsah protiiontů;
- stabilita při skladování;
- dokumentace.
Požadavky závisí na analytickém účelu.
Oficiální farmakopejní referenční standardy
Oficiální organizace poskytují referenční standardy pro konkrétní kompendiální použití.
Příklady jsou:
- Referenční standardy USP;
- Referenční standardy Evropského lékopisu;
- Mezinárodní chemické referenční látky WHO.
Tyto standardy jsou určeny pro použití popsaná v příslušných oficiálních metodách nebo dokumentaci.
Pro každý výzkumný peptid neexistuje oficiální farmakopejní standard.
Vědecká omezení
Referenční standard zlepšuje analytickou srovnatelnost, ale neřeší všechny problémy měření.
Spolehlivost je stále závislá na:
- analytická metoda;
- příprava vzorku;
- přístroj;
- kalibrace;
- skladování;
- zpracování dat;
- nejistota měření.
Odpovídající retenční čas při HPLC sám o sobě neprokazuje úplnou molekulární identitu.
Odpovídající molekulová hmotnost automaticky neprokazuje:
- správná úplná sekvence;
- přesné množství peptidu;
- nepřítomnost všech nečistot.
Proto se používá několik komplementárních analytických technik.
Shrnutí
Peptidový referenční standard je dobře charakterizovaný materiál používaný jako analytický základ pro porovnání.
Referenční standardy lze použít pro:
- identifikace;
- porovnání pomocí HPLC;
- kalibrace;
- stanovení obsahu peptidu;
- kvantifikace;
- validace metody;
- analýza nečistot.
Primární standard se rozsáhle charakterizuje.
Sekundární nebo pracovní standard se kvalifikuje vůči vhodnému primárnímu referenčnímu standardu a lze jej použít pro rutinní analýzu.
Voor kwantitatieve toepassingen is alleen HPLC-zuiverheid meestal onvoldoende. Ook peptidegehalte, water, tegenionen en andere relevante componenten moeten worden beoordeeld.
Spolehlivé analytické porovnání vyžaduje:
- vhodný referenční standard;
- správné přiřazení hodnoty;
- sledovatelnost šarže;
- kontrolované skladování;
- validovaná analytická metoda;
- posouzení nejistoty měření.
Oficiální zdroje a vědecké reference
-
ICH Q2(R2) — Validation of Analytical Procedures
Mezinárodní pokyn pro validaci analytických postupů včetně specifičnosti, správnosti, preciznosti, linearity a rozsahu měření. -
USP — Official Reference Standards
USP popisuje referenční standardy jako rozsáhle charakterizované materiály mimo jiné pro výzkum identity, účinnosti, čistoty a kvality. -
European Pharmacopoeia Reference Standards — EDQM
Katalog EDQM obsahuje oficiálně platné referenční standardy pro použití popsaná v Evropském lékopisu. -
WHO — International Chemical Reference Substances
WHO-ICRS jsou stanovovány prostřednictvím postupů, které odpovídají pokynům WHO pro chemické referenční látky. -
NIST — Metrological Traceability
NIST popisuje metrologickou sledovatelnost jako zdokumentovaný nepřerušovaný řetězec kalibrací ke stanoveným referencím. -
NIST — Standard Reference Materials
NIST vyvíjí a certifikuje referenční materiály s dobře charakterizovaným složením nebo vlastnostmi na podporu spolehlivých a srovnatelných měření. -
FDA — Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics
Pokyny FDA se zabývají používáním a kvalifikací referenčních standardů v rámci validace analytických metod.
Upozornění týkající se výzkumu
Výzkumné peptidy Peptidera jsou nabízeny výhradně pro Research Use Only (RUO) a jsou určeny pro laboratorní výzkum a analytické aplikace.
Není určeno ke konzumaci lidmi ani zvířaty, k diagnostickému použití, terapeutickému použití ani k vlastní aplikaci.
Kategorie:
Znalosti o peptidech a kontrola kvality
Související produkty Peptidera:
Výzkumné peptidy s identifikací šarže a dostupnými nezávislými analytickými údaji o kvalitě
Související interní blogy:
- PB-0230 — Čistota peptidů a HPLC
- PB-0231 — Hmotnostní spektrometrie u peptidů
- PB-0233 — Peptidový test: čistota versus obsah peptidu
- PB-0238 — Protiionty u peptidů
- PB-0239 — Analýza aminokyselin u peptidů
- PB-0241 — Řetězec péče při analýze peptidů
Návrhy interních odkazů:
- Odkaz na PB-0230 týkající se retenčního času HPLC a chromatografického porovnání
- Odkaz na PB-0231 týkající se LC-MS, molekulové hmotnosti a MS/MS
- Odkaz na PB-0233 týkající se kvantitativních peptidových testů
- Odkaz na PB-0238 týkající se protiiontů a čistého obsahu peptidu
- Odkaz na PB-0239 týkající se analýzy aminokyselin a přiřazení hodnot
- Odkaz na PB-0241 týkající se sledovatelnosti standardů a vzorků
- Odkaz na stránku Peptidera s nezávislými certifikáty analýzy
- Odkaz na kolekci výzkumných peptidů