Čistota peptidu: co znamená 99 % HPLC?
Vysvětlení čistoty peptidu: co skutečně vypovídá procento HPLC?
U výzkumných peptidů se často uvádí procento čistoty. Hodnoty jako 98%, 99% nebo 99,5% čistoty se pravidelně používají k popisu kvality peptidu.
Vysoké procento se zdá být snadno interpretovatelné: čím vyšší číslo, tím lepší produkt. Ve skutečnosti je čistota peptidu složitější.
Výsledek HPLC poskytuje informace o relativním složení analyzovaného vzorku. Procento však automaticky nedokazuje:
- že je přítomen správný peptid;
- že je sekvence aminokyselin zcela správná;
- že uvedené množství peptidu ve vialce odpovídá skutečnosti;
- že je materiál sterilní;
- že je bez endotoxinů;
- že byly změřeny všechny možné kontaminanty.
Pro pečlivé posouzení kvality peptidu je třeba společně vyhodnotit více analytických údajů.
V tomto článku probereme, jak se čistota peptidu měří, co znamená procento HPLC a proč je čistota pouze jednou součástí komplexní kontroly kvality.
Co znamená čistota peptidu?
Čistota peptidu popisuje, jaká část detekovaných složek souvisejících s peptidem odpovídá hlavní složce v analyzovaném vzorku.
Pokud certifikát analýzy například uvádí HPLC čistotu 99% uvádí, obvykle to znamená, že přibližně 99 % integrovaného chromatografického signálu bylo přiřazeno hlavnímu píku.
To automaticky neznamená, že 99 % celkové hmotnosti ve vialce tvoří požadovaný peptid.
Vialka může kromě peptidu obsahovat i další složky, například:
- voda;
- protionty;
- soli;
- pomocné látky;
- zbytkové produkty z výroby;
- nedetekovatelné složky.
Procento HPLC a skutečné množství peptidu jsou proto různé parametry kvality.
Co je HPLC?
HPLC je zkratka pro High-Performance Liquid Chromatography.
Jedná se o analytickou techniku, pomocí které lze oddělit různé chemické složky ve vzorku.
Během analýzy HPLC se rozpuštěný vzorek vede kolonou. Tato kolona obsahuje stacionární fázi.
Kapalina protékající kolonou se nazývá mobilní fáze.
Jednotlivé molekuly nereagují s těmito fázemi všechny stejně. Některé složky se proto kolonou pohybují rychleji než jiné.
Výsledek je zobrazen v podobě chromatogramu.
Chromatogram se obvykle skládá z:
- horizontální časová osa;
- svislá signálová osa;
- jeden nebo více píků.
Každý pík představuje detekovanou komponentu nebo skupinu komponent.
Co je retenční čas?
Čas, který komponenta potřebuje k průchodu kolonou HPLC a dosažení detektoru, se nazývá retenční čas.
Retenční čas může být ovlivněn:
- typ kolony HPLC;
- složení mobilní fáze;
- teplota;
- průtoková rychlost;
- vlastnosti peptidu;
- použitá analytická metoda.
Odpovídající retenční čas může pomoci při porovnání s referenčním standardem.
Samotný retenční čas však obvykle nestačí k definitivnímu potvrzení identity peptidu.
Různé molekuly mohou mít za určitých podmínek podobné retenční časy.
Proto se HPLC často kombinuje s hmotnostní spektrometrií.
Jak se vypočítává procento čistoty?
Při mnoha analýzách HPLC se vypočítává plocha pod každým chromatografickým píkem.
Toto se nazývá integrace plochy píku.
Zjednodušený příklad:
- hlavní pík: 99 %;
- vedlejší pík A: 0,5 %;
- vedlejší pík B: 0,3 %;
- ostatní detekované píky: 0,2 %.
Uvedená chromatografická čistota je pak přibližně 99 %.
Tento výpočet závisí na:
- metoda detekce;
- nastavení integrace;
- zvolená vlnová délka;
- analytická metoda;
- mez detekce;
- koncentrace vzorku.
Procento čistoty je proto vždy nutné interpretovat v kontextu použité metody.
Co znamená hlavní pík?
Největší pík v chromatogramu se často nazývá hlavní pík.
U dobře charakterizovaného peptidu se očekává, že tento pík bude odpovídat požadovanému peptidu.
To však musí být analyticky potvrzeno.
Velký pík sám o sobě nedokazuje přítomnost správné molekulární struktury.
K potvrzení identity lze použít doplňkové techniky, například:
- hmotnostní spektrometrie;
- analýza aminokyselin;
- analýza sekvence;
- jaderná magnetická rezonance;
- porovnání s referenčním standardem.
HPLC popisuje především chromatografické složení vzorku.
Jaké nečistoty mohou vznikat během syntézy peptidů?
Mnoho syntetických peptidů se vyrábí pomocí syntézy peptidů na pevné fázi, obvykle zkráceně SPPS.
Během tohoto procesu se aminokyseliny postupně navazují na rostoucí peptidový řetězec.
V každém kroku mohou vzniknout drobné odchylky v procesu.
Mezi možné nečistoty související s peptidy patří:
Zkrácené peptidové řetězce
Když není aminokyselina správně navázána, může vzniknout neúplný peptidový řetězec.
Tento produkt se také nazývá produkt truncace.
Sekvence delecí
U deleční sekvence chybí z zamýšleného řetězce jedna nebo více aminokyselin.
Molekulová hmotnost se tím liší od hmotnosti požadovaného peptidu.
Chemicky modifikované varianty
Během výroby, čištění nebo skladování mohou nastat chemické změny.
Příklady zahrnují:
- oxidací;
- deamidací;
- hydrolýzou;
- izomerizace.
Zbytky ochranných skupin
Během syntézy peptidů se používají dočasné ochranné skupiny, aby se zabránilo nežádoucím reakcím.
Ty musí být později odstraněny.
Neúplné odstranění může přispívat ke vzniku vedlejších složek.
Agregáty
Molekuly peptidů mohou za určitých podmínek vytvářet větší struktury.
Ne každá metoda HPLC detekuje nebo charakterizuje agregaci stejným způsobem.
Je 99% čistota podle HPLC totéž co 99% obsah peptidu?
Ne.
To je důležitý rozdíl.
Čistota HPLC obvykle popisuje relativní poměr detekovaných chromatografických složek.
Obsah peptidu popisuje, jaké množství skutečného peptidu je přítomno vzhledem k celkovému materiálu.
Lyofilizovaná vialka může například obsahovat:
- požadovaný peptid;
- voda;
- protionty;
- soli;
- pomocné látky.
Tyto složky nemusí být během standardní HPLC analýzy měřeny všechny stejným způsobem.
Vzorek proto může mít vysokou chromatografickou čistotu, zatímco celkový obsah peptidu je nižší než procentuální hodnota HPLC.
Pro kvantitativní stanovení jsou zapotřebí další analytické metody.
Co je peptidový assay?
Assay se používá ke stanovení množství nebo koncentrace konkrétní složky.
V závislosti na cíli výzkumu lze použít různé metody.
Příklady zahrnují:
- kvantitativní HPLC s referenčním standardem;
- analýza aminokyselin;
- analýza dusíku;
- spektroskopické techniky;
- výpočty hmotnostní bilance.
Assay zodpovídá jinou otázku než standardní analýza čistoty.
Analýza čistoty vyžaduje:
Jaká část detekovaných peptidových složek patří k hlavnímu píku?
Kvantitativní assay vyžaduje:
Jaké množství požadovaného peptidu je skutečně přítomno?
Oba údaje mohou být relevantní pro úplnou charakterizaci kvality.
Proč je hmotnostní spektrometrie důležitá?
Hmotnostní spektrometrie, často zkracovaná na MS, měří poměr hmotnosti k náboji ionizovaných molekul.
Při analýze peptidů lze zkoumat, zda naměřená molekulová hmotnost odpovídá teoreticky očekávané hmotnosti.
Hmotnostní spektrometrie může přispět k:
- potvrzení identity;
- detekce určitých modifikací;
- analýza produktů rozkladu;
- porovnání variant peptidů.
Když naměřená hmotnost odpovídá očekávané hmotnosti, podporuje to identifikaci.
Hmotnostní spektrometrie však automaticky neposkytuje úplné informace o:
- procento čistoty;
- přesné množství;
- sterilita;
- endotoxiny;
- biologická aktivita.
HPLC a hmotnostní spektrometrie se proto vzájemně doplňují.
Co je LC-MS?
LC-MS kombinuje kapalinovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií.
Nejprve se komponenty chromatograficky separují. Poté se jednotlivé signály dále zkoumají pomocí hmotnostní spektrometrie.
Tato kombinace může poskytnout informace o:
- retenční čas;
- molekulová hmotnost;
- možné nečistoty;
- produkty rozkladu;
- chemické modifikace.
LC-MS tak může poskytnout více analytických informací než jedna samostatná technika.
Kvalita výsledků je stále závislá na:
- příprava vzorku;
- nastavení přístroje;
- validace metody;
- referenční materiály;
- odborná interpretace.
Proč mohou různé laboratoře naměřit odlišné výsledky?
Stejný peptid může v různých laboratořích poskytovat mírně odlišné výsledky.
Možné příčiny jsou:
- různé HPLC kolony;
- jiné mobilní fáze;
- odlišné gradienty;
- jiné detekční vlnové délky;
- rozdíly v přípravě vzorku;
- jiná nastavení integrace;
- variace přístroje.
Rozdíl automaticky neznamená, že jedna z analýz je nesprávná.
Pro správné porovnání výsledků je třeba zohlednit také analytickou metodu.
Procento bez informací o metodě poskytuje jen omezený kontext.
Co je validace metody?
Analytická metoda musí být prokazatelně vhodná pro zamýšlený účel.
Toto se nazývá validace metody.
Mezi možné validační charakteristiky patří:
- specificita;
- správnost;
- preciznost;
- linearita;
- měřicí rozsah;
- mez detekce;
- mez kvantifikace;
- robustnost.
Metoda pro identifikační analýzu nemusí být automaticky vhodná pro přesnou kvantifikaci.
Proto musí být předem jasné, jaká analytická otázka se zkoumá.
Co je mez detekce?
Každá analytická metoda má hranici, pod níž nelze komponentu spolehlivě detekovat.
Toto se nazývá mez detekce.
Komponenta, která není v chromatogramu viditelná, proto nemusí být automaticky zcela nepřítomná.
Koncentrace může být nižší než mez detekce.
Kromě toho mohou některé látky:
- nereagovat na použitý detektor;
- spadat mimo měřicí rozsah;
- se během přípravy vzorku ztratit;
- nejsou dostatečně separovány.
Výrok „nedetekováno“ proto nemusí vždy znamenat totéž co „nepřítomno“.
Lze s chromatogramem manipulovat?
Chromatogram musí obsahovat dostatek informací, aby mohl být odborně posouzen.
Důležité údaje jsou:
- název produktu;
- číslo šarže;
- datum analýzy;
- použitá metoda;
- nastavení detektoru;
- retenční časy;
- integrace píků;
- laboratorní údaje.
Pouhý obrázek s jedním velkým píkem a procentuálním údajem poskytuje jen omezenou kontrolovatelnost.
Nastavení integrace může také ovlivnit, které signály jsou zahrnuty do výpočtu.
Transparentní vykazování je proto důležité.
Jaké informace by měl obsahovat spolehlivý COA?
Certifikát analýzy může mimo jiné obsahovat:
- název peptidu;
- sekvence aminokyselin;
- číslo šarže nebo lotu;
- datum výroby;
- datum testu;
- výsledek HPLC;
- chromatogram;
- výsledek hmotnostní spektrometrie;
- teoretická molekulová hmotnost;
- naměřená molekulová hmotnost;
- použité analytické metody;
- název laboratoře.
Ne každý COA obsahuje všechny části.
Požadované informace závisí na produktu a cíli výzkumu.
Podrobný COA může poskytnout větší transparentnost, ale jeho spolehlivost závisí také na kvalitě analýzy.
Je vysoká čistota vždy nezbytná?
Požadovaná čistota závisí na cíli výzkumu.
U některých analytických aplikací mohou velmi malá množství vedlejších složek ovlivnit:
- výsledky měření;
- výzkumu receptorů;
- buněčném výzkumu;
- reprodukovatelnost.
Vyšší úroveň čistoty může být v takovém případě žádoucí.
Vyšší procento přesto automaticky neznamená, že všechny ostatní kvalitativní charakteristiky jsou lepší.
Peptid s čistotou 99,5 % podle HPLC může například stále:
- obsahovat odlišné množství;
- být nesprávně skladován;
- nebýt dostatečně identifikován;
- obsahovat zvýšené zbytkové množství vlhkosti;
- mít poškozený obal.
Kvalita proto musí být posuzována multidimenzionálně.
Čistota a rozdíly mezi šaržemi
Každá výrobní šarže má vlastní výrobní a analytický postup.
Výsledky čistoty se proto mohou mezi šaržemi lišit.
Analýzu jedné šarže nelze automaticky použít jako důkaz pro všechny budoucí šarže.
Analýza specifická pro danou šarži podporuje:
- sledovatelností;
- porovnáním;
- kontrolou kvality;
- zkoumání odchylek.
Číslo šarže na vialce proto musí odpovídat číslu na certifikátu analýzy.
Čistota a stabilita
Vysoká počáteční čistota nezaručuje, že zůstane zachována během dlouhodobého skladování.
Možné degradační procesy jsou:
- oxidací;
- hydrolýzou;
- deamidací;
- agregací.
Rychlost je ovlivněna:
- teplota;
- vlhkost;
- světlo;
- kyslík;
- sekvence aminokyselin;
- obal.
Studii stability lze využít ke sledování změn chromatografického profilu v průběhu času.
Vědecká omezení
Žádná analytická metoda sama o sobě neposkytuje úplný obraz kvality peptidu.
HPLC může poskytnout důležité informace o chromatografické čistotě, ale má omezení.
Procentuální údaj z HPLC automaticky nedokazuje:
- identita;
- přesné množství peptidu;
- sekvence aminokyselin;
- sterilita;
- obsah endotoxinů;
- biologická aktivita;
- dlouhodobá stabilita.
Proto se kombinuje více analytických metod.
Úplné posouzení kvality může zahrnovat:
- HPLC;
- hmotnostní spektrometrie;
- kvantitativní test;
- analýza vlhkosti;
- studie stability;
- doplňkové testy specifické pro produkt.
Shrnutí
Čistota peptidu je důležitým parametrem kvality, ale procentuální údaj z HPLC je třeba správně interpretovat.
Hodnota 99 % obvykle znamená, že přibližně 99 % integrovaného chromatografického signálu bylo přiřazeno hlavnímu píku.
Neznamená to automaticky, že:
- 99 % hmotnosti lahvičky tvoří peptid;
- identita je plně potvrzena;
- uvedené množství je správné;
- materiál je sterilní;
- všechny možné kontaminanty jsou vyloučeny.
Pro širší posouzení kvality je třeba výsledky HPLC kombinovat s dalšími údaji, jako jsou:
- hmotnostní spektrometrie;
- informace o šarži;
- kvantitativní analýza;
- údaje o skladování;
- studie stability.
Kvalita peptidu se proto skládá z více než jednoho procentuálního údaje.
Prohlášení o výzkumném použití
Výzkumné peptidy Peptidera jsou nabízeny výhradně pro Research Use Only (RUO) a jsou určeny pro laboratorní výzkum a analytické aplikace.
Není určeno k lidské ani zvířecí konzumaci, diagnostickému použití, terapeutickému použití ani k samopodávání.
Kategorie:
Znalosti o peptidech & kontrola kvality
Související produkty Peptidera:
Lyofilizované výzkumné peptidy s identifikací šarže a dostupnými analytickými údaji o kvalitě
Související interní blogy:
- PB-0227 — Lyofilizované peptidy a lyofilizace
- PB-0228 — Lahvičky s peptidy a integrita obalu
- PB-0229 — Čísla šarží a sledovatelnost
- Co je certifikát analýzy?
- Jak se výzkumné peptidy analyticky testují?
Návrhy interních odkazů:
- Odkaz na PB-0229 o analýze specifické pro šarži
- Odkaz na stránku COA s certifikáty analýzy
- Odkaz na PB-0227 o stabilitě a degradaci
- Odkaz na kolekci výzkumných peptidů
- Odkaz na stránku o nezávislých laboratorních testech
Název souboru obrázku:PB-0230-peptidezuiverheid-hplc-analyse.jpg