Zbytková vlhkost v lyofilizovaných peptidech: vliv na stabilitu a kvalitu

Lyofilizované výzkumné peptidy jsou často dodávány jako suchá, pórovitá struktura v uzavřeném skleněném vialu. Odstraněním vody během procesu lyofilizace lze omezit molekulární pohyb a určité chemické rozkladné procesy.

Lyofilizace však automaticky neznamená úplnou bezvodost.

Po lyofilizaci může v produktu zůstat malé množství vody. To se nazývá zbytková vlhkost, reziduální vlhkost nebo residual moisture.

Množství zbytkové vlhkosti může ovlivnit:

chemická stabilita;
fyzikální stabilita;
molekulární mobilita;
agregace;
oxidace;
struktura lyofilizované matrice;
stabilita během skladování.

Velmi vysoký obsah vlhkosti může urychlit určité degradační procesy. Extrémně nízký obsah vlhkosti však není automaticky optimální pro každou peptidovou formulaci. Některé molekulární struktury mohou naopak těžit z omezeného množství vázané vody.

Požadovaná hodnota zbytkové vlhkosti proto závisí na konkrétním peptidu, formulaci, obalu a podmínkách skladování.

V tomto blogu diskutujeme, jak zbytková vlhkost vzniká, jak se měří a proč může být analýza vlhkosti důležitou součástí stability lyofilizovaných výzkumných peptidů.

Co je zbytková vlhkost?

Zbytková vlhkost je množství vody, které zůstává v lyofilizovaném produktu po procesu sušení.

Tato voda může být umístěna:

mezi molekulami;
na povrchu lyofilizované struktury;
v mikroskopických pórech;
vázaná na peptidové skupiny;
vázaná na pomocné látky;
v rovnováze s plynnou fází ve vialu.

Zbytková vlhkost je obvykle uváděna jako procento z celkové hmotnosti.

Hypotetický výsledek může být například:

Zbytková vlhkost: 1,8 %

To znamená, že podle použité měřicí metody je přibližně 1,8 % zkoumané hmotnosti přičítáno vodě.

Význam této hodnoty závisí na:

specifikace produktu;
použitá analytická metoda;
vlastnosti peptidů;
formulace;
účel skladování.

Proč se peptidy lyofilizují?

Peptidy mohou být ve vodném roztoku citlivé na různé chemické a fyzikální změny.

Možné procesy jsou:

hydrolýze;
oxidace;
deamidace;
agregace;
strukturální změny.

Zmrazením roztoku a následným odstraněním většiny vody za sníženého tlaku vzniká suchá matrice.

Tento proces se nazývá:

lyofilizace;
lyofilizace;
lyofilizace.

Cílem není pouze odstranění vody.

Dobře vyvinutý proces lyofilizace by měl také přispívat k:

udržení molekulární integrity;
tvorba stabilního koláče;
reprodukovatelná kvalita produktu;
vhodná rozpustnost pro analytické studie.

Jak vzniká zbytková vlhkost?

Během lyofilizace je voda odstraňována ve více fázích.

Hlavní fáze procesu jsou:

zmrazování;
primární sušení;
sekundární sušení.

Každá fáze ovlivňuje konečné množství zbytkové vlhkosti.

Fáze 1: zmrazování

Během fáze zmrazování je peptidový roztok ochlazován.

Velká část vody tvoří ledové krystaly.

Jiné složky se koncentrují v nezamrzlé části roztoku.

Způsob, jakým produkt zamrzá, může ovlivnit:

velikost ledových krystalů;
pórovitá struktura;
doba sušení;
rozdělení složek;
konečná struktura produktu.

Větší ledové krystaly mohou po sublimaci zanechat větší póry.

To může ovlivnit transport vodní páry během primárního sušení.

Fáze 2: primární sušení

Během primární fáze sušení je tlak snížen.

Zmrazená voda je následně odstraněna sublimací.

Sublimace znamená, že led přechází přímo z pevného stavu do vodní páry.

Teplota produktu musí být během této fáze pečlivě kontrolována.

Když teplota příliš vzroste, může struktura zkolabovat.

To je někdy označováno jako:

kolaps koláče

Zřícená struktura může ovlivnit:

vzhled;
pórovitost;
chování při sušení;
rozpustnost;
stabilita.

Po primární fázi sušení je odstraněna velká část volného ledu.

Přesto může být stále přítomna vázaná voda.

Fáze 3: sekundární sušení

Během sekundární fáze sušení je dále odstraňována pevně vázaná voda.

To se obvykle provádí řízeným zvýšením teploty produktu při zachování nízkého tlaku.

Cílem je snížit zbytkovou vlhkost na předem stanovenou hodnotu.

Optimální konečná hodnota se liší podle produktu.

Příliš krátké sekundární sušení může vést k:

zvýšená zbytková vlhkost;
větší molekulární mobilita;
snížená stabilita.

Příliš intenzivní fáze sušení může mít u některých formulací také nepříznivé účinky.

Proto je proces vyvíjen specificky pro každý produkt.

Je lyofilizovaný peptid zcela suchý?

Obvykle ne.

Termín lyofilizovaný znamená, že byla odstraněna velká část vody.

To automaticky neznamená, že produkt obsahuje 0 % vody.

Molekuly vody mohou zůstat pevně vázány na:

polární aminokyselinové skupiny;
peptidové vazby;
soli;
formulační složky.

Úplné odstranění může být technicky obtížné a není vždy žádoucí.

Proto se obvykle pracuje s přijatelným rozsahem zbytkové vlhkosti.

Proč může být příliš mnoho zbytkové vlhkosti problém?

Voda může zvýšit molekulární mobilitu.

Když se molekuly pohybují snadněji, mohou některé chemické reakce probíhat rychleji.

Zvýšený obsah zbytkové vlhkosti může za určitých podmínek přispět k:

hydrolýze;
deamidace;
oxidačních změnách;
agregace;
strukturální nestabilitě.

Vliv závisí na:

pořadí peptidů;
teplota;
kyslík;
světlo;
pH mikroprostředí;
doba skladování.

Zbytková vlhkost je tedy jedním ze stabilizačních faktorů a musí být hodnocena spolu s dalšími podmínkami.

Co je molekulární mobilita?

V suché lyofilizované matrici jsou molekuly relativně omezené v pohybu.

Voda může fungovat jako molekulární změkčovadlo.

To může vést ke zvýšení molekulárních pohybů.

Vyšší mobilita může zvýšit pravděpodobnost, že se reaktivní skupiny setkají.

To může ovlivnit určité degradační reakce.

Vztah mezi obsahem vody a stabilitou však není vždy lineární.

Více vody neznamená za všech okolností přesně proporcionálně více rozkladu.

Může extrémně nízký obsah vlhkosti také škodit?

Ano, to je možné.

Velmi nízký obsah vlhkosti není automaticky optimální pro každý peptid.

Omezené množství vázané vody může přispět k:

udržení určitých molekulárních interakcí;
stabilizaci struktury;
snížení mechanického napětí.

Nadměrné sušení může u některých formulací způsobit změny v:

molekulární struktura;
produktová matrice;
rozpustnost.

Požadovaná hodnota zbytkové vlhkosti musí být proto stanovena experimentálně.

Co je to lyofilizovaný koláč?

Po lyofilizaci obvykle zůstává porézní pevná struktura.

Často se nazývá lyofilizovaný koláč.

Dobře vytvořený koláč může mít vlastnosti jako:

jednotná struktura;
dostatečná porozita;
omezené smrštění;
žádný viditelný kolaps.

Vzhled však neposkytuje úplné informace o kvalitě.

Vizuálně čistý koláč může stále mít odlišný obsah vlhkosti.

Naopak odlišný tvar nemusí automaticky znamenat, že molekulární kvalita je nedostatečná.

Analytické hodnocení zůstává nezbytné.

Může vzhled ukázat zbytkovou vlhkost?

Ne.

Zbytkovou vlhkost nelze spolehlivě určit pouze pohledem na lahvičku.

Možné vnější změny jsou:

smrštění;
kolaps;
lepivost;
zabarvení;
změna struktury.

Tyto jevy mohou mít různé příčiny.

Pro kvantitativní stanovení je potřeba vhodná analytická metoda.

Jak se měří zbytková vlhkost?

Lze použít různé techniky.

Často používané metody jsou:

Karl Fischerova titrace;
termogravimetrická analýza;
ztráta sušením;
spektroskopické metody.

Každá metoda měří vlhkost jiným způsobem.

Výsledky proto nejsou vždy přímo zaměnitelné.

Co je Karl Fischerova titrace?

Karl Fischerova titrace je často používaná metoda stanovení vody.

Metoda využívá chemickou reakci, která je specificky citlivá na vodu.

Množství spotřebovaného činidla se používá k výpočtu obsahu vody.

Karl Fischerova analýza může být vhodná pro nízké koncentrace vlhkosti.

Existuje několik variant:

volumetrická Karl Fischerova titrace;
coulometrická Karl Fischerova titrace.

Vhodná metoda závisí na množství vody a typu vzorku.

Coulometrická Karl Fischerova analýza

Coulometrická Karl Fischerova titrace se často používá u malých množství vody.

Během analýzy se elektrochemicky vytváří potřebný činidlo.

Množství elektrického náboje se používá k výpočtu obsahu vody.

Možné výhody jsou:

citlivosti;
vhodnosti pro nízké hodnoty vlhkosti;
malém množství vzorku.

Spolehlivost závisí na:

příprava vzorku;
úplná extrakce vody;
zařízení;
kalibrace;
korekce pozadí.

Co je ztráta sušením?

Při ztrátě sušením, zkráceně LOD, se vzorek váží před a po řízeném sušení.

Ztráta hmotnosti se vypočítá.

Tato metoda neměří vždy pouze vodu.

I další prchavé složky mohou během sušení zmizet.

Proto ztráta sušením není automaticky rovna specifickému stanovení vody.

Co je termogravimetrická analýza?

Termogravimetrická analýza se zkracuje na TGA.

Během TGA se měří hmotnost vzorku při řízené změně teploty.

Ztráta hmotnosti může poskytnout informace o:

vlhkost;
prchavé složky;
termické změny.

Interpretace vyžaduje znalost:

teplotní profil;
složení produktu;
možné rozkladné procesy.

Proč může měřicí metoda způsobit rozdíly?

Ne každá metoda detekuje vodu stejným způsobem.

Některé techniky měří:

specifická voda;
celková ztráta hmotnosti;
volná voda;
vázaná voda.

Proto mohou různé metody přinést různé hodnoty.

Výsledek zbytkové vlhkosti by měl být vždy hodnocen společně s:

metoda;
podmínky měření;
specifikace produktu.

Jakou roli hraje gumová zátka?

Pro lyofilizaci musí být lahvička dobře uzavřena.

Gumová zátka tvoří důležitou bariéru proti vlhkosti z okolí.

Ochrana závisí na:

materiál zátky;
utěsnění;
umístění;
kompatibilita;
doba skladování.

Nedostatečně uzavřená lahvička může absorbovat vlhkost.

Proto je integrita obalu důležitá pro stabilitu.

Jakou roli hraje hliníkový uzávěr?

Hliníkový uzávěr mechanicky drží gumovou zátku na místě.

Správné uzavření podporuje:

integrita uzávěru;
ochrana proti pohybu zátky;
konzistentní utěsnění.

Poškozený nebo uvolněný hliníkový uzávěr může být důvodem k dalšímu inspekci.

Pouhý vzhled však neprokazuje, že je uzávěr zcela vzduchotěsný.

Může vlhkost proniknout obalovými materiály?

Obalové materiály tvoří bariéry, ale žádný systém není za všech okolností absolutně nepropustný.

Možné faktory jsou:

druh materiálu;
doba skladování;
teplota;
vlhkost vzduchu;
kvalita uzávěru.

Dlouhodobá expozice vysoké vlhkosti vzduchu může zvýšit pravděpodobnost absorpce vlhkosti, pokud je bariéra obalu nedostatečná.

Co je integrita uzávěru nádoby?

Integrita uzávěru nádoby popisuje, do jaké míry lahvička, zátka a hliníkový uzávěr tvoří ochranné uzavření.

Často se zkracuje na:

CCI

Výzkum integrity obalu může být zaměřen na:

únik;
výměna plynů;
pronikání vlhkosti;
mechanické poškození.

Dobré uzavření podporuje zachování vnitřního prostředí.

Jaký vliv má skladovací teplota?

Teplota může ovlivnit:

molekulární pohyb;
chemické reakce;
migrace vlhkosti;
fyzikální stabilita.

Vyšší teploty mohou urychlit některé degradační procesy.

Zbytková vlhkost a teplota se mohou vzájemně ovlivňovat.

Produkt s vyšším zbytkovým obsahem vlhkosti může při vyšší teplotě měnit rychleji než za kontrolovaných chladnějších podmínek.

Skutečná stabilita musí být experimentálně ověřena.

Proč je vlhkost vzduchu důležitá?

Když je lahvička otevřená nebo nedostatečně uzavřená, může na ni působit vlhkost z okolí.

Míra absorpce vlhkosti závisí na:

relativní vlhkost vzduchu;
doba expozice;
hygroskopičnost;
struktura produktu.

Některé lyofilizované materiály přitahují vlhkost snáze než jiné.

Tomu se říká hygroskopičnost.

Co znamená hygroskopický?

Hygroskopický materiál má tendenci přitahovat vodu z okolí.

Možné důsledky jsou:

vyšší obsah vlhkosti;
změna struktury koláče;
lepivost;
větší molekulární pohyblivost.

Míra hygroskopičnosti závisí na složení produktu.

Může mít přeprava vliv?

Přeprava může produkt vystavit:

kolísání teploty;
vibrace;
změny tlaku;
kolísavá vlhkost vzduchu.

Pokud je lahvička dobře uzavřená, přímé vstřebávání vlhkosti je omezené.

Přesto mohou dlouhodobé nebo extrémní podmínky ovlivnit stabilitu produktu.

Proto jsou důležité vhodné podmínky balení a přepravy.

Zbytková vlhkost a oxidace

Voda může nepřímo ovlivnit oxidační procesy.

Oxidaci dále ovlivňuje:

kyslík;
světlo;
metalické ionty;
teplota;
složení aminokyselin.

Nízký obsah vlhkosti oxidaci zcela nezabrání.

Proto mohou být potřeba další opatření, jako například:

kontrolované balení;
ochrana před světlem;
vhodná skladovací teplota.

Zbytková vlhkost a deamidace

Deamidace je chemická změna, která může ovlivnit určité aminokyselinové zbytky.

Ze všech aminokyselin jsou zvláště citlivé asparagin a glutamin.

Rychlost reakce ovlivňuje:

voda;
teplota;
pH;
pořadí aminokyselin;
molekulární prostředí.

Zvýšená molekulární pohyblivost může za určitých podmínek podporovat deamidaci.

Zbytková vlhkost a agregace

Agregace znamená, že molekuly se spojují do větších struktur.

Zbytková vlhkost může ovlivnit pohyblivost a interakce mezi molekulami.

Vztah je složitý.

Jak příliš vysoký, tak nevhodně nízký obsah vlhkosti může u některých formulací ovlivnit fyzickou stabilitu.

Proto se agregace zkoumá samostatně.

Jak se stanoví vhodná specifikace zbytkové vlhkosti?

Specifikace produktu by měla být založena na experimentálních datech.

Výzkumníci mohou porovnávat šarže s různými hodnotami vlhkosti.

Například se měří:

čistota HPLC;
produkty rozkladu;
agregace;
rozpustnost;
fyzikální struktura;
stabilita během skladování.

Na základě těchto údajů lze stanovit přijatelný rozsah.

Co může být uvedeno na COA?

Analytický certifikát může obsahovat údaje jako:

test: zbytková vlhkost;
metoda: Karl Fischer;
specifikace: stanovený rozsah;
změřený výsledek;
hodnocení: vyhovuje nebo nevyhovuje.

Ne každý COA obsahuje analýzu vlhkosti.

Pokud byly provedeny pouze HPLC a hmotnostní spektrometrie, nelze z toho vyvodit závěr o zbytkové vlhkosti.

Je zbytková vlhkost totéž co čistota peptidů?

Ne.

Zbytková vlhkost a čistota podle HPLC jsou různé parametry kvality.

Čistota podle HPLC obvykle popisuje relativní chromatografické složení.

Zbytková vlhkost popisuje množství vody v materiálu.

Produkt může:

mít vysokou čistotu podle HPLC;
a relativně vysoký obsah vlhkosti.

Obě výsledky mohou být současně správné.

Je zbytková vlhkost totéž co obsah peptidů?

Ne.

Zbytková vlhkost však může ovlivnit vypočítaný obsah peptidů.

Když voda přispívá k celkové hmotnosti, může být čistý podíl peptidů nižší.

Proto může být analýza vlhkosti součástí hmotnostní bilance.

Vědecká omezení

Jednotlivé měření zbytkové vlhkosti neposkytuje úplný obraz o stabilitě produktu.

Skutečná stabilita závisí také na:

aminokyselinové sekvence;
chemické modifikace;
formulace;
kyslík;
světlo;
teplota;
balení;
doba skladování.

Nízká hodnota vlhkosti automaticky neprokazuje:

vysoká čistota peptidů;
správná identita;
správné množství peptidu;
sterilita;
biologická aktivita.

Pro širší hodnocení kvality jsou potřeba další analýzy.

Shrnutí

Lyofilizované výzkumné peptidy obvykle nejsou zcela bez vody.

Po lyofilizaci může zůstat malé množství zbytkové vlhkosti.

Zbytková vlhkost může ovlivnit:

molekulární mobilita;
chemická stabilita;
agregace;
oxidace;
deamidace;
fyzikální struktura produktu.

Často používané analytické metody jsou:

Karl Fischerova titrace;
ztráta sušením;
termogravimetrická analýza.

Optimální množství zbytkové vlhkosti se liší podle peptidu a formulace.

Co nejnižší hodnota proto není automaticky optimální pro každý produkt.

Zbytková vlhkost musí být hodnocena společně s:

čistota HPLC;
peptidový test;
molekulární identita;
integrita balení;
údaje o stabilitě.

Výzkumné prohlášení

Výzkumné peptidy Peptidera jsou nabízeny výhradně pro použití pouze pro výzkum (RUO) a jsou určeny pro laboratorní výzkum a analytické aplikace.

Není určeno pro lidskou ani zvířecí spotřebu, diagnostické použití, terapeutické účely ani samostatnou aplikaci.

Kategorie:
Peptidové znalosti & kontrola kvality

Související produkty Peptidera:
Lyofilizované výzkumné peptidy s identifikací šarže a dostupnými analytickými kvalitativními daty

Související interní blogy:

PB-0227 — Lyofilizované peptidy a lyofilizace
PB-0228 — Peptidové lahvičky a integrita balení
PB-0230 — Čistota peptidů a HPLC
PB-0232 — Certifikát analýzy peptidů
PB-0233 — Peptidový test: čistota versus obsah peptidů

Návrhy interních odkazů:

Odkaz na PB-0227 u procesu lyofilizace
Odkaz na PB-0228 u integrity lahviček, zátky a balení
Odkaz na PB-0233 u zbytkové vlhkosti a čistého obsahu peptidů
Odkaz na PB-0232 u analýzy vlhkosti na COA
Odkaz na stránku Peptidera s certifikáty analýzy
Odkaz na kolekci lyofilizovaných výzkumných peptidů

Země/oblast

Jazyk