Aminosyreanalyse af peptider forklaret
Aminosyreanalyse af peptider: sammensætning og kvantificering forklaret
Peptider består af kæder af aminosyrer. Rækkefølgen af disse aminosyrer bestemmer en stor del af et peptids kemiske og strukturelle egenskaber.
Ved kvalitetskontrol anvendes teknikker som HPLC og massespektrometri ofte til at vurdere renhed og molekylmasse. En supplerende analysemetode er aminosyreanalyse, ofte forkortet AAA.
Aminosyreanalyse kan bruges til at undersøge:
- hvilke aminosyrer der er til stede i en prøve;
- hvordan de målte aminosyreforhold stemmer overens med den forventede sammensætning;
- hvor meget peptid der er til stede;
- om aminosyresammensætningen passer til det teoretiske peptid;
- hvordan nettopeptidindholdet kan beregnes.
Metoden fungerer anderledes end HPLC og massespektrometri. Ved klassisk aminosyreanalyse nedbrydes peptidkæden først til individuelle aminosyrer. Derefter separeres, detekteres og kvantificeres disse aminosyrer.
Aminosyreanalyse kan give værdifuld information, men har også begrænsninger. Under nedbrydningen kan nogle aminosyrer delvist ændres eller gå tabt. Derfor skal resultaterne altid fortolkes i den anvendte metodes kontekst.
Hvad er aminosyreanalyse?
Aminosyreanalyse er en laboratorieteknik, der bruges til at undersøge aminosyresammensætningen i en prøve.
Ved en klassisk analyse udføres normalt følgende trin:
- klargøring af prøven;
- hydrolyse af peptidkæden;
- frigivelse af individuelle aminosyrer;
- adskillelse af aminosyrerne;
- detektion og kvantificering;
- sammenligning med den forventede sammensætning.
Resultatet kan angives som:
- mængde pr. aminosyre;
- molforhold;
- massekoncentration;
- aminosyreprofil;
- beregnet peptidindhold.
Hvad er hydrolyse?
Hydrolyse er en kemisk proces, hvor bindinger spaltes ved hjælp af vand.
Ved aminosyreanalyse nedbrydes peptidbindingerne, så individuelle aminosyrer frigives.
En almindeligt anvendt metode er syrehydrolyse.
Prøven udsættes i en kontrolleret periode for:
- stærk syre;
- forhøjet temperatur;
- kontrollerede forhold.
Efter hydrolyse findes den oprindelige peptidkæde ikke længere som et intakt molekyle.
De frigivne aminosyrer kan derefter undersøges individuelt.
Hvorfor nedbrydes peptidkæden?
Et intakt peptid kan indeholde snesevis af forskellige aminosyrerester.
Ved at nedbryde kæden kan den samlede mængde af hver aminosyre måles.
Antag, at et teoretisk peptid indeholder:
- fire alaninrester;
- to glycinrester;
- tre leucinrester;
- én tyrosinrest.
Efter hydrolyse kan det undersøges, om de målte forhold omtrent svarer til denne teoretiske sammensætning.
Dette understøtter vurderingen af aminosyresammensætningen.
Hvad er forskellen mellem aminosyresammensætning og aminosyresekvens?
Aminosyreanalyse måler primært hvilke aminosyrer der er til stede, og i hvilken mængde.
Metoden bestemmer ikke automatisk den nøjagtige rækkefølge.
To forskellige peptider kan have den samme aminosyresammensætning, men en anden rækkefølge.
For eksempel:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Begge indeholder:
- én alanin;
- én glycin;
- én leucin.
Alligevel er sekvensen forskellig.
Til sekvensundersøgelser er der brug for andre teknikker, f.eks.:
- tandem-massespektrometri;
- fragmentanalyse;
- specifikke sekventeringsmetoder.
Kan aminosyreanalyse bekræfte identiteten?
Aminosyreanalyser kan understøtte den forventede sammensætning.
Når den målte aminosyreprofil afviger markant fra den teoretiske sammensætning, kan det give anledning til yderligere undersøgelser.
En matchende profil beviser dog ikke i sig selv, at den nøjagtige aminosyresekvens er korrekt.
For en bredere identitetsvurdering kan følgende kombineres:
- molekylmasse;
- LC-MS;
- MS/MS;
- aminosyreanalyse;
- kromatografiske data.
Hvordan adskilles aminosyrer?
Efter hydrolyse indeholder prøven en blanding af frie aminosyrer.
De skal adskilles analytisk fra hinanden.
Mulige teknikker er:
- ionbytningskromatografi;
- HPLC;
- UPLC;
- kapillærelektroforese.
Den valgte teknik afhænger af:
- den ønskede følsomhed;
- laboratoriemetode;
- prøvetype;
- den nødvendige nøjagtighed.
Hvad er derivatisering?
Veel aminosyrer har begrænset detekterbarhed uden yderligere behandling.
Daarom kunnen ze chemisch worden gekoppeld aan een detecteerbare groep.
Dit wordt derivatisering genoemd.
Derivatisering kan plaatsvinden:
- vóór chromatografische scheiding;
- na chromatografische scheiding.
De gevormde derivaten kunnen beter worden gemeten met bijvoorbeeld:
- UV-detectie;
- fluorescentiedetectie;
- massaspectrometrie.
Precolonderivatisering
Bij precolonderivatisering worden aminozuren vóór de chromatografische scheiding gelabeld.
Daarna worden de gevormde derivaten via een kolom gescheiden.
Mogelijke voordelen zijn:
- hoge gevoeligheid;
- geschikte fluorescentiedetectie;
- analyse van meerdere aminozuren.
Reaktionen skal forløbe reproducerbart.
Ufuldstændig derivatisering kan påvirke kvantificeringen.
Post-column-derivatisering
Ved post-column-derivatisering separeres aminosyrerne først.
Efter kolonnen reagerer de med et detektionsreagens.
Et kendt eksempel er analyse med ninhydrin.
De dannede reaktionsprodukter kan derefter måles optisk.
Hvordan bestemmes mængden af aminosyre?
Til kvantificering anvendes referencestandarder.
Standardopløsninger indeholder kendte mængder af aminosyrer.
Disse måles for at fastslå en sammenhæng mellem:
- koncentration;
- detektorsignal.
Derefter måles den ukendte prøve.
Ved hjælp af kalibreringsdataene kan mængden af hver aminosyre beregnes.
Hvad er en intern standard?
En intern standard er et kendt stof, der tilsættes prøver og kalibreringsopløsninger.
Denne kan hjælpe med at korrigere for variation under:
- prøveforberedelse;
- injektion;
- derivatisering;
- analyse.
Den interne standard skal kunne skelnes tydeligt analytisk fra de undersøgte aminosyrer.
Hvordan kan aminosyreanalyse bestemme peptidindholdet?
Når et peptids aminosyresammensætning er kendt, kan udvalgte aminosyrer bruges til at beregne mængden af peptid.
Antag, at hver peptidkæde indeholder præcis fire alaninrester.
Når den samlede mængde alanin måles, kan man derudfra estimere, hvor mange peptidkæder der var til stede.
Beregningen tager højde for:
- antal rester pr. peptid;
- molekylmasse;
- målt mængde aminosyre;
- analysemetode.
Dette kan anvendes til en kvantitativ peptidanalyse.
Hvorfor anvendes ikke altid alle aminosyrer?
Ikke alle aminosyrer er lige velegnede til kvantificering.
Nogle aminosyrer kan under hydrolyse:
- nedbrydes delvist;
- ændres kemisk;
- frigives ufuldstændigt;
- være vanskelige at måle pålideligt.
Derfor udvælges ofte stabile aminosyrer.
Valget afhænger af peptidsekvensen og analysemetoden.
Hvilke aminosyrer kan ændre sig under hydrolyse?
Sur hydrolyse kan have forskellige virkninger.
Tryptofan
Tryptofan kan i vid udstrækning nedbrydes under standardiseret sur hydrolyse.
Derfor er tilpassede metoder nødvendige, når tryptofan skal måles specifikt.
Asparagin
Asparagin kan under hydrolyse omdannes til aspartat.
Derfor rapporteres asparagin og aspartat ikke altid separat ved klassisk analyse.
Glutamin
Glutamin kan omdannes til glutamat.
Dette gør det muligt at vise glutamin og glutamat samlet.
Serine
Serin kan delvist gå tabt under langvarig hydrolyse.
Threonin
Også threonin kan delvist nedbrydes.
Cystein
Cystein kan undergå oxidative ændringer.
For at opnå en pålidelig analyse kan forudgående oxidation eller en tilpasset metode være nødvendig.
Hvorfor er hydrolysetiden vigtig?
Peptidbindingerne skal nedbrydes tilstrækkeligt.
For kort hydrolyse kan føre til:
- ufuldstændig nedbrydning;
- for lave målte aminosyreværdier.
For lang hydrolyse kan føre til:
- yderligere nedbrydning af følsomme aminosyrer;
- måletab.
Derfor kontrolleres hydrolysetid og -temperatur.
Nogle gange anvendes flere hydrolysetider for at undersøge tab eller ufuldstændig nedbrydning.
Hvad er et molforhold?
Et molforhold beskriver de relative antal aminosyrer.
Antag, at et peptid teoretisk indeholder:
- to alaniner;
- én glycin;
- tre leuciner.
Det teoretiske molforhold er:
2 : 1 : 3
Efter analysen kan de målte værdier normaliseres.
Når forholdet ligger tæt på den teoretiske værdi, understøtter det den forventede aminosyresammensætning.
Små afvigelser kan opstå på grund af:
- måleusikkerhed;
- hydrolysetab;
- derivatisering;
- integration af kromatografiske toppe.
Hvad betyder normalisering?
Ved normalisering omregnes de målte aminosyreværdier til relative forhold.
En egnet aminosyre kan bruges som reference.
Derved kan den målte profil sammenlignes med den teoretiske sammensætning.
Normalisering er nyttig til sammensætningsanalyse, men angiver ikke automatisk den absolutte peptidmængde.
Aminosyreanalyser versus HPLC-renhed
HPLC-renhed og aminosyreanalyse måler forskellige egenskaber.
HPLC-renhed undersøger normalt:
- den kromatografiske hovedtop;
- den relative mængde af bipidser.
Aminosyreanalyser undersøger:
- aminosyresammensætning;
- mængden af udvalgte aminosyrer;
- mulig peptidkvantificering.
En høj HPLC-renhed beviser ikke automatisk, at aminosyresammensætningen er korrekt.
En passende aminosyresammensætning beviser ikke automatisk, at der ikke findes peptidrelaterede urenheder.
Teknikkerne supplerer hinanden.
Aminosyreanalyser versus massespektrometri
Massespektrometri undersøger molekylers masse-ladningsforhold.
En intakt massebestemmelse kan understøtte, at den molekylære masse svarer til den teoretiske værdi.
Aminosyreanalyser undersøger mængden og forholdet mellem aminosyrer efter hydrolyse.
Begge teknikker har forskellige styrker.
En kombination kan give mere information om:
- identiteit;
- sammensætning;
- peptidindhold.
Aminosyreanalyse versus peptid-assay
Aminosyreanalyse kan selv anvendes som assaymetode.
Et peptid-assay beskriver målet:
bestemme mængden af peptid.
Aminosyreanalyse er en af de teknikker, der kan bruges til at nå dette mål.
Andre mulige assaymetoder er:
- kvantitativ HPLC;
- UV-spektrofotometri;
- LC-MS-kvantificering;
- massebalance.
Hvilken indflydelse har modioner?
Modioner såsom:
- acetat;
- chlorid;
- TFA;
bidrager til den samlede masse af frysetørret materiale.
Ved aminosyreanalyse undersøges primært peptidets aminosyrekomponenter.
Derved kan metoden hjælpe med at skelne mellem:
- den samlede materialemasse;
- den faktiske peptidmængde.
Der kan være behov for yderligere analyser for at opnå en fuldstændig massebalance.
Hvilken indflydelse har restfugt?
Restfugt bidrager til den samlede vægt, men ikke til aminosyresammensætningen.
Når nettopeptidindholdet beregnes, kan fugtanalyse give yderligere oplysninger.
En omfattende massebalance kan bestå af:
- peptidindhold;
- vandindhold;
- indhold af modioner;
- øvrige komponenter.
Kan aminosyreanalyse påvise kontaminering?
Nogle afvigende aminosyresignaler kan indikere uventede komponenter.
Metoden er dog ikke designet til at detektere enhver mulig kontaminering.
Der kan være behov for andre teknikker til:
- organiske urenheder;
- rester af opløsningsmidler;
- metaller;
- mikrobiologisk kontaminering;
- endotoksiner.
Hvad kan der stå på et COA?
Et analysecertifikat kan indeholde oplysninger som:
- test: aminosyreanalyse;
- analysemetode;
- målte aminosyreforhold;
- teoretiske forhold;
- beregnet peptidindhold;
- testdato;
- batchnummer.
Ikke alle analysecertifikater indeholder en aminosyreanalyse.
Når der kun er udført HPLC og MS, kan der ikke udledes en fuldstændig kvantificering af aminosyrer heraf.
Hvorfor er batchkobling vigtig?
En aminosyreanalyse skal være knyttet til den undersøgte batch.
Vigtige oplysninger er:
- lotnummer;
- produktnavn;
- analysedato;
- laboratorium;
- analysemetode.
En analyserapport uden en tydelig batchkobling har mindre værdi for sporbarheden.
Hvad betyder måleusikkerhed?
Enhver kvantitativ analyse indeholder måleusikkerhed.
Ved aminosyreanalyse kan variationskilder være:
- prøveforberedelse;
- hydrolyse;
- tab af aminosyrer;
- derivatisering;
- kalibrering;
- kromatografisk separation;
- peak-integration.
Derfor bør resultater ikke betragtes som absolut fejlfri.
Hvorfor er metodevalidering vigtig?
En metode skal være egnet til det tilsigtede formål.
Ved kvantitativ aminosyreanalyse kan relevante valideringsparametre omfatte:
- nøjagtighed;
- præcision;
- linearitet;
- specificitet;
- måleområde;
- robusthed;
- reproducerbarhed.
En metode, der er egnet til en kvalitativ aminosyreprofil, er ikke automatisk tilstrækkelig til nøjagtig kvantificering af peptider.
Videnskabelige begrænsninger
Aminosyreanalyse har væsentlige begrænsninger.
Metoden bestemmer ikke selvstændigt:
- præcis aminosyresekvens;
- molekylmasse;
- HPLC-renhed;
- tredimensionel struktur;
- biologisk aktivitet;
- sterilitet;
- endotoksinindhold.
Derudover kan nogle aminosyrer ændre sig under hydrolyse.
For en bred kvalitetsvurdering skal flere analyseteknikker kombineres.
Resumé
Aminosyreanalyse undersøger sammensætningen og mængden af aminosyrer i et peptid.
Ved klassisk analyse nedbrydes peptidkæden først ved hydrolyse.
Derefter kvantificeres aminosyrerne:
- separeret;
- detekteret;
- kvantificeret;
- sammenlignet med den teoretiske sammensætning.
Aminosyreanalyse kan anvendes til:
- kontrol af aminosyresammensætning;
- vurdering af molforhold;
- kvantificering af peptidindhold;
- understøttelse af identitet.
Metoden har begrænsninger, fordi visse aminosyrer kan ændre sig under hydrolyse.
Derfor kombineres aminosyreanalyse fortrinsvis med:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- peptidassay;
- restfugtanalyse;
- modionanalyse.
Forskningsdisclaimer
Peptideras forskningspeptider tilbydes udelukkende til Research Use Only (RUO) og er beregnet til laboratorieforskning og analytiske anvendelser.
Ikke beregnet til indtagelse af mennesker eller dyr, diagnostisk brug, terapeutisk anvendelse eller selvadministration.
Peptidviden & kvalitetskontrol
Relaterede Peptidera-produkter:
Frysetørrede forskningspeptider med batchidentifikation og tilgængelige analytiske kvalitetsdata
Relaterede interne blogs:
- PB-0230 — Peptidrenhed og HPLC
- PB-0231 — Massespektrometri af peptider
- PB-0233 — Peptidassay: renhed versus peptidindhold
- PB-0234 — Restfugt i frysetørrede peptider
- PB-0238 — Modioner i peptider
Forslag til interne links:
- Link til PB-0233 om aminosyreanalyse som peptidassay
- Link til PB-0230 om forskellen fra HPLC-renhed
- Link til PB-0231 om molekylmasse og sekvensanalyse
- Link til PB-0234 om restfugt og nettopeptidindhold
- Link til PB-0238 om modioner og massebalance
- Link til Peptideras side med analysecertifikater
- Link til samlingen af forskningspeptider