Masse-spektrometri forklaret ved peptider

Massespektrometri af peptider: hvordan undersøges den molekylære identitet?

Ved kvalitetskontrol af forskningspeptider kombineres ofte flere analyseteknikker. HPLC kan give oplysninger om den kromatografiske renhed, men en høj hovedtop beviser ikke automatisk, at det korrekte peptid er til stede.

For at undersøge den molekylære identitet yderligere anvendes ofte massespektrometri.

Massespektrometri, som normalt forkortes til MS, er en analytisk teknik, hvor masse-ladningsforholdet for ioniserede molekyler måles. Ved peptidanalyse kan den målte molekylmasse sammenlignes med den teoretisk forventede masse for aminosyresekvensen.

Når disse værdier stemmer overens, understøtter det identifikationen af det undersøgte peptid. Massespektrometri giver dog heller ikke alene et fuldstændigt billede af kvaliteten.

I denne blog gennemgår vi, hvordan massespektrometri fungerer, hvorfor peptider kan producere flere massesignaler, og hvordan MS-resultater fortolkes sammen med HPLC og andre analysemetoder.

---

Hvad er massespektrometri?

Massespektrometri er en analyseteknik, hvor molekyler omdannes til ladede partikler, såkaldte ioner.

Disse ioner separeres derefter og måles på basis af deres masse-ladningsforhold.

Dette forhold vises som:

m/z

Her betyder:

• m for masse;
• z for elektrisk ladning.

Et massespektrometer måler derfor ikke altid direkte den fulde molekylmasse. Instrumentet måler forholdet mellem masse og ladning.

Ved større molekyler, herunder mange peptider, kan der opstå flere ladninger. Derfor kan det samme peptid være synligt flere steder i massespektret.

---

Hvorfor anvendes massespektrometri til peptidanalyse?

Et peptid består af en bestemt rækkefølge af aminosyrer.

Hver aminosyrekombination har en teoretisk beregnelig molekylmasse.

Massespektrometri kan bruges til at undersøge, om den målte masse stemmer overens med denne teoretiske værdi.

MS-analyse kan bidrage til:

• bekræftelse af molekylær identitet;
• sammenligning med den teoretiske molekylmasse;
• påvisning af bestemte kemiske modifikationer;
• analyse af nedbrydningsprodukter;
• undersøgelse af peptidvarianter;
• sammenligning mellem produktionsbatcher.

En tilsvarende masse understøtter identiteten af et peptid.

Resultatet skal dog altid vurderes i kombination med analysemetoden og andre kvalitetsdata.

---

Hvad er den teoretiske molekylmasse?

Den teoretiske molekylmasse beregnes ud fra:

• aminosyresekvensen;
• antallet af aminosyrer;
• eventuele chemische modificaties;
• de moleculaire vorm;
• specifieke eindgroepen.

Wanneer aminozuren samen een peptideketen vormen, ontstaan peptidebindingen.

Tijdens de vorming van iedere peptidebinding wordt een watermolecuul afgesplitst. Daarom is de massa van een volledig peptide niet simpelweg de optelsom van alle losse aminozuren.

Ook modificaties kunnen de massa beïnvloeden.

Eksempler er:

• amidatie;
• acetylering;
• fosforylering;
• oxidatie;
• toevoeging van vetzuurketens;
• vorming van disulfidebruggen.

De theoretische massa moet daarom worden berekend voor de exacte moleculaire structuur.

---

Wat betekent moleculair gewicht?

De termen moleculaire massa en moleculair gewicht worden vaak door elkaar gebruikt.

Binnen laboratoriumrapporten wordt de waarde meestal weergegeven in:

• dalton, afgekort Da;
• kilodalton, afgekort kDa.

Eén dalton komt ongeveer overeen met de massa van één waterstofatoom.

Een peptide met een moleculaire massa van 3.000 Da heeft dus een massa van ongeveer 3 kDa.

De moleculaire massa van peptiden kan sterk verschillen, afhankelijk van:

• ketenlengte;
• aminosyresammensætning;
• kemiske modifikationer.

---

Hoe werkt een massaspectrometer?

Een massaspectrometer bestaat meestal uit verschillende onderdelen.

1. Monsterintroductie

Het peptide wordt eerst voorbereid en in het instrument gebracht.

De monstervoorbereiding kan invloed hebben op:

• signalstyrke;
• detecteerbaarheid;
• vorming van ionen;
• achtergrondsignalen.

2. Ionisatie

De moleculen worden elektrisch geladen.

Veelgebruikte technieken voor peptideanalyse zijn:

• electrospray-ionisatie;
• matrix-assisted laser desorption/ionization.

3. Massa-analyse

De gevormde ionen worden gescheiden op basis van hun massa-ladingsverhouding.

4. Detectie

De detector registreert de ionen.

5. Gegevensverwerking

De gemeten signalen worden omgezet in een massaspectrum.

Dit spectrum bevat pieken die overeenkomen met gedetecteerde ionen.

---

Wat is electrospray-ionisatie?

Electrospray-ionisatie, afgekort tot ESI, is een veelgebruikte ionisatietechniek voor peptiden.

Tijdens ESI wordt een vloeibaar monster door een fijne opening geleid terwijl een elektrische spanning wordt aangebracht.

Hierdoor ontstaan elektrisch geladen druppeltjes.

Wanneer het oplosmiddel verdampt, blijven geladen moleculen over.

Een belangrijk kenmerk van ESI is dat grotere moleculen meerdere elektrische ladingen kunnen krijgen.

Een peptide kan bijvoorbeeld voorkomen als:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Hierbij staat M voor de moleculaire massa van het peptide.

Door meerdere ladingen ontstaan verschillende m/z-signalen voor dezelfde molecule.

---

Waarom heeft één peptide meerdere pieken?

Wanneer een peptide meerdere protonen opneemt, ontstaan verschillende ladingsvormen.

Stel dat een peptide een moleculaire massa heeft van ongeveer 3.000 Da.

Mogelijke signalen zijn dan ongeveer:

• én positiv ladning: m/z omkring 3.001;
• to positive ladninger: m/z omkring 1.501;
• tre positive ladninger: m/z omkring 1.001.

Disse signaler kan alle stamme fra det samme peptid.

Softwaren kan bruge denne ladningsfordeling til at beregne den oprindelige molekylmasse.

Denne proces kaldes dekonvolution.

---

Hvad er et dekonvoluteret massespektrum?

En rå ESI-måling kan indeholde flere ladningsspidser.

Det kan gøre fortolkningen kompleks.

Med dekonvolutionssoftware omregnes de forskellige ladningsformer til én estimeret molekylmasse.

Det dekonvoluterede spektrum kan derfor lettere sammenlignes med:

• den teoretiske masse;
• en referencestandard;
• produktspecifikationer.

Beregningens kvalitet afhænger af:

• signalstyrke;
• opløsning;
• baggrundsstøj;
• softwareindstillinger;
• tilstedeværelse af overlappende komponenter.

---

Hvad er MALDI?

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, forkortet MALDI, er en anden ioniseringsteknik.

Peptidet blandes med et matrixmateriale og påføres en måleplade.

En laser aktiverer matrixen, så der dannes peptidioner.

MALDI producerer ofte primært enkeltladede ioner.

Derved kan spektret se enklere ud end et ESI-spektrum.

MALDI kombineres ofte med en time-of-flight-masseanalysator.

Denne kombination betegnes som:

MALDI-TOF

---

Hvad er time-of-flight?

I en time-of-flight-masseanalysator accelereres ioner af et elektrisk felt.

Derefter bevæger de sig gennem et målerør.

Ioner med et lavere masse-ladningsforhold når normalt detektoren hurtigere end ioner med et højere forhold.

Flyvetiden bruges til at beregne m/z-værdien.

TOF-systemer kan bruges til:

• peptididentifikation;
• massebestemmelse;
• sammenligning af molekylære varianter.

Den endelige nøjagtighed afhænger af kalibrering, instrumentindstillinger og prøveforberedelse.

---

Hvad er LC-MS?

Liquid chromatography-mass spectrometry, forkortet LC-MS, kombinerer væskekromatografi med massespektrometri.

Komponenterne separeres først kromatografisk.

Derefter analyseres de enkelte signaler af massespektrometeret.

LC-MS kan kombinere oplysninger om:

• retentionstid;
• kromatografisk profil;
• molekylmasse;
• mulige urenheder;
• nedbrydningsprodukter.

Derfor kan LC-MS give mere indsigt end en separat HPLC- eller MS-analyse.

---

Hvad er forskellen mellem HPLC og massespektrometri?

HPLC og massespektrometri besvarer forskellige analytiske spørgsmål.

HPLC

HPLC kan give oplysninger om:

• kromatografisk renhed;
• relativ mængde af detekterede komponenter;
• retentionstider;
• ændringer i den kromatografiske profil.

Massespektrometri

Massespektrometri kan give oplysninger om:

• molekylmasse;
• mulig identitet;
• kemiske modifikationer;
• bestemte nedbrydningsprodukter.

En forenklet sammenligning:

Derfor kombineres de to teknikker ofte.

---

Kan den samme molekylmasse forekomme for forskellige peptider?

Ja.

Forskellige aminosyresekvenser kan have samme eller næsten samme samlede masse.

Disse kaldes undertiden isobare strukturer.

En tilsvarende masse beviser derfor ikke altid, at hele aminosyresekvensen er korrekt.

Til mere omfattende identifikation kan der være behov for yderligere teknikker, såsom:

• tandem-massespektrometri;
• fragmenteringsanalyse;
• aminosyreanalyser;
• sekvensanalyse;
• sammenligning med en referencestandard.

Den nødvendige analysemetode afhænger af den ønskede sikkerhed.

---

Hvad er tandem-massespektrometri?

Tandem-massespektrometri skrives normalt som:

MS/MS

Under MS/MS fragmenteres en udvalgt peptidion yderligere.

De dannede fragmenter måles derefter igen.

Fragmenteringsmønstret kan give oplysninger om:

• aminosyresekvens;
• modifikationernes placering;
• peptididentitet;
• strukturen af nedbrydningsprodukter.

MS/MS kan dermed give flere strukturelle oplysninger end blot den intakte molekylmasse.

---

Hvad er peptidfragmenter?

Når en peptidkæde brydes på bestemte steder under MS/MS, dannes fragmentioner.

Almindelige fragmenttyper er:

• b-ioner;
• y-ioner.

Disse fragmenters masser kan bruges til at rekonstruere dele af aminosyresekvensen.

Fortolkningen kan være kompleks.

Ikke alle peptider fragmenteres på samme måde.

Faktorer, der kan have indflydelse, er:

• aminosyresammensætning;
• elektrisk ladning;
• peptidstørrelse;
• fragmenteringsmetode;
• kemiske modifikationer.

---

Kan massespektrometri detektere oxidation?

Bestemte oxidative ændringer medfører en målbar masseændring.

Tilsætning af ét oxygenatom medfører for eksempel ofte en masseforøgelse på cirka 16 Da.

Derved kan massespektrometri bidrage til at identificere bestemte oxidationsprodukter.

Detektionen afhænger af:

• koncentration;
• instrumentopløsning;
• analysemetode;
• separation af komponenter.

Ikke alle oxidative ændringer kan lokaliseres fuldstændigt udelukkende på grundlag af ét massesignal.

Det kan kræve en supplerende fragmenteringsanalyse.

---

Kan massespektrometri bestemme mængden af peptid?

Ikke automatisk.

Intensiteten af et massesignal påvirkes af:

• ioniseringseffektivitet;
• molekylære egenskaber;
• opløsningsmiddel;
• instrumentindstillinger;
• tilstedeværelsen af andre komponenter.

Et dobbelt så stærkt signal betyder derfor ikke automatisk, at der er dobbelt så meget peptid til stede.

Pålidelig kvantificering kræver validerede metoder og egnede standarder.

Mulige teknikker er:

• kvantitativ LC-MS;
• interne standarder;
• isotopmærkede referencer;
• kalibrerede HPLC-assays.

---

Kan massespektrometri påvise sterilitet?

Nej.

Massespektrometri til identifikation af peptider er ikke en sterilitetsprøve.

Resultatet giver ingen direkte oplysninger om:

• bakterier;
• svampe;
• mikrobiologisk vækst;
• produktets sterilitet.

Sterilitet kræver specifikke mikrobiologiske testmetoder.

Endotoksiner bestemmes heller ikke automatisk under en standardiseret peptid-MS-analyse.

---

Kan massespektrometri måle endotoksiner?

Ikke via en standardidentitetsanalyse.

Endotoksiner er komplekse bakterielle komponenter.

Til endotoksinundersøgelser anvendes specifikke metoder, såsom:

• Limulus Amebocyte Lysate-test;
• rekombinante faktor C-metoder.

Et korrekt massespektrum for et peptid beviser derfor ikke, at materialet har et lavt endotoksinindhold.

Identitet, renhed, sterilitet og endotoksiner er separate kvalitetsparametre.

---

Hvorfor kan laboratorieresultater variere?

Forskellige laboratorier kan rapportere lidt afvigende masseværdier.

Mulige årsager er:

• instrumenttype;
• kalibrering;
• ioniseringsmetode;
• prøveforberedelse;
• saltaddukter;
• anvendt software;
• opløsning;
• fortolkningsmetode.

Små forskelle betyder ikke automatisk, at et resultat er forkert.

Den målte værdi skal vurderes inden for:

• instrumentnøjagtighed;
• forventet molekylform;
• anvendt analysemetode.

---

Hvad er addukter?

Under massespektrometri kan peptidioner binde sig til andre ladede partikler.

Eksempler er:

• natrium;
• kalium;
• ammonium.

Dette kan medføre yderligere toppe.

Et natriumaddukt har for eksempel en anden masse end en simpelt protoneret peptidion.

Addukter betyder ikke automatisk, at der er et andet peptid til stede.

Fortolkningen kræver kendskab til:

• prøveforberedelse;
• anvendte buffere;
• forventede ionformer.

---

Hvilke oplysninger hører hjemme i en MS-rapport?

En professionel analyserapport kan blandt andet indeholde:

• peptidets navn;
• batch- eller lotnummer;
• teoretisk molekylmasse;
• målt molekylmasse;
• ioniseringsmetode;
• type massespektrometer;
• massespektrum;
• analysedato;
• laboratoriets navn.

Ved mere omfattende analyser kan følgende også angives:

• måleområde;
• opløsning;
• masse-nøjagtighed;
• fragmenteringsdata;
• anvendt software.

De benodigde rapportage hangt af van het onderzoeksdoel.

---

Den nødvendige rapportering afhænger af forskningsformålet.

Massespektrometri og batchkontrol

Hver produktionsbatch kan undersøges separat.

• Batchspecifik MS-analyse understøtter:
• identitetskontrol;
• sammenligning mellem batches;
• sporbarhed;

undersøgelse af afvigelser.

Batchnummeret på analyserapporten skal stemme overens med identifikationen på vialsættet.

---

Et massespektrometrisk resultat uden tydelig batchtilknytning har begrænset værdi for sporbarheden.

Videnskabelige begrænsninger

Massespektrometri er en kraftfuld analyseteknik, men ikke en fuldstændig kvalitetsvurdering.

• En tilsvarende molekylmasse beviser ikke automatisk:
• fuldstændig aminosyresekvens;
• høj kromatografisk renhed;
• sterilitet;
• korrekt peptidmængde;
• lavt endotoksinindhold;
• biologisk aktivitet;

langsigtet stabilitet.

• For en bredere vurdering kan flere metoder være nødvendige:
• LC-MS;
• HPLC;
• MS/MS;
• kvantitativ analyse;
• fugtanalyse;
• supplerende produktspecifikke tests.

Resultaterne skal fortolkes samlet.

---

Sammenfatning

Massespektrometri bruges til at undersøge forskningspeptiders molekylmasse.

Teknikken måler masse-til-ladningsforholdet for ioniserede molekyler.

Ved peptidanalyse kan den målte masse sammenlignes med den teoretisk forventede masse.

En overensstemmelse understøtter den molekylære identifikation.

Vigtige analyseteknikker omfatter:

• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;
• MS/MS.

Massespektrometri giver dog ikke automatisk oplysninger om:

• præcis mængde;
• kromatografisk renhed;
• sterilitet;
• endotoksiner;
• biologisk aktivitet.

Derfor kombineres MS ofte med HPLC og supplerende kvalitetsanalyser.

---

Forskningsdisclaimer

Peptideras forskningspeptider tilbydes udelukkende til Research Use Only (RUO) og er beregnet til laboratorieforskning og analytiske anvendelser.

Ikke beregnet til indtagelse af mennesker eller dyr, diagnostisk brug, terapeutisk anvendelse eller selvadministration.

---

Kategori:
Peptidviden & kvalitetskontrol

Relaterede Peptidera-produkter:
Frysetørrede forskningspeptider med batchidentifikation og tilgængelige analytiske kvalitetsdata

Relaterede interne blogs:

• PB-0227 — Frysetørrede peptider og lyofilisering
• PB-0228 — Peptidvials og emballageintegritet
• PB-0229 — Batchnumre og sporbarhed
• PB-0230 — Peptidrenhed og HPLC
• Hvad er et analysecertifikat?

Forslag til interne links:

• Link til PB-0230 om forskellen mellem HPLC og MS
• Link til PB-0229 om batchspecifik analyse
• Link til COA-siden med massespektrometriske testresultater
• Link til samlingen af forskningspeptider
• Link til siden om uafhængig laboratorieanalyse