Peptidereferencestandarderne forklaret
Peptidreferencestandarder: hvorfor analytisk sammenligning er vigtig
Ved kvalitetsanalyse af forskningspeptider anvendes ofte teknikker som:
- HPLC;
- LC-MS;
- peptidassay;
- aminosyreanalyse;
- UV-spektrofotometri.
Disse instrumenter producerer måledata, men et detectorsignal eller en kromatografisk top har ikke automatisk en nøjagtig betydning.
For at identificere eller kvantificere en ukendt prøve pålideligt kan den sammenlignes med et materiale, hvis relevante egenskaber allerede er blevet omhyggeligt fastlagt.
Et sådant materiale kaldes en referencestandard.
En velkarakteriseret peptidreferencestandard kan bruges til:
- identifikation;
- sammenligning af retentionstider;
- kvantificering;
- kalibrering;
- vurdering af HPLC-metoder;
- undersøgelse af urenheder;
- analyse af nedbrydningsprodukter;
- understøttelse af målesporbarhed.
Kvaliteten af et analytisk resultat afhænger derfor ikke kun af laboratorieinstrumentet. Også identiteten, renheden, peptidindholdet, opbevaringen og dokumentationen af den anvendte referencestandard er vigtige.
En referencestandard er desuden ikke automatisk det samme som en vilkårlig prøve med en høj HPLC-procent. Til kvantitativ anvendelse skal det være klart, hvor meget faktisk peptid der er til stede, og hvilke ikke-peptidkomponenter der bidrager til den samlede masse.
I denne blog gennemgår vi, hvad peptidreferencestandarder er, hvordan primære og sekundære standarder adskiller sig, og hvorfor analytisk sammenligning er vigtig for pålidelig peptidanalyse.
Hvad er en peptidreferencestandard?
En peptidreferencestandard er et omhyggeligt karakteriseret materiale, der bruges som sammenligningsgrundlag under laboratorieanalyse.
Afhængigt af forskningens formål kan egenskaber som følgende være fastlagt:
- aminosyresekvens;
- molekylmasse;
- identitet;
- HPLC-renhed;
- peptidindhold;
- vandindhold;
- modionindhold;
- tilstedeværelse af relevante urenheder;
- opbevaringsstabilitet.
Standarden kan derefter bruges til analytisk at sammenligne en ukendt prøve.
Den nødvendige karakterisering afhænger af anvendelsen.
En standard til identifikation behøver ikke altid at opfylde nøjagtig de samme krav som en standard til kvantitativ analyse.
Hvorfor er analytisk sammenligning nødvendig?
Et laboratorieinstrument måler et fysisk eller kemisk signal.
Eksempler omfatter:
- UV-absorption;
- fluorescens;
- kromatografisk topareal;
- masse-til-ladningsforhold;
- ionintensitet.
Et signal svarer ikke automatisk til en nøjagtig mængde peptid.
Derfor er der brug for en pålidelig sammenhæng mellem:
- kendt mængde;
- målt signal;
- ukendt prøve.
En referencestandard kan hjælpe med at fastslå denne sammenhæng.
Et enkelt eksempel
Antag, at et laboratorium ønsker at bestemme mængden af et peptid ved hjælp af kvantitativ HPLC.
Laboratoriet fremstiller forskellige opløsninger af en karakteriseret referencestandard:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Hver opløsning analyseres.
De målte peakarealer afbildes mod de kendte koncentrationer.
Herved opstår en kalibreringskurve.
Derefter måles den ukendte prøve.
Koncentrationen kan beregnes ved at sammenligne prøvens signal med kalibreringskurven.
Pålideligheden af denne beregning afhænger blandt andet af:
- referencestandardens kvalitet;
- korrekt koncentrationsberegning;
- nøjagtig vejning;
- præcis pipettering;
- metodens linearitet;
- opløsningernes stabilitet.
Hvad er en primær referencestandard?
En primær referencestandard er et materiale, hvis relevante egenskaber er fastlagt i detaljer.
Standarden kan karakteriseres ved hjælp af flere uafhængige analyseteknikker.
Mulige analyser omfatter:
- HPLC;
- LC-MS;
- aminosyreanalyse;
- vandbestemmelse;
- modionanalyse;
- NMR;
- elementanalyse;
- massebalance.
Formålet er med høj pålidelighed at fastslå:
- hvilket materiale der er til stede;
- hvor ren den er;
- hvor meget af den ønskede komponent der er til stede;
- hvilke korrektionsfaktorer der er nødvendige.
En primær standard kan derefter bruges til at kvalificere andre standarder.
Hvad er en sekundær referencestandard?
En sekundær referencestandard kaldes også:
- arbejdsstandard;
- arbejdsstandard;
- intern referencestandard.
Denne standard kvalificeres ved sammenligning med en primær eller officielt anerkendt referencestandard.
En sekundær standard kan bruges til rutinemæssige laboratorieanalyser.
Mulige fordele er:
- større tilgængelighed;
- lavere omkostninger;
- bevarelse af den primære standard;
- mere effektiv rutinemæssig anvendelse.
Den sekundære standard skal dog kontrolleres regelmæssigt og opbevares korrekt.
Hvorfor bruges den primære standard ikke altid?
Primære standarder kan:
- have begrænset tilgængelighed;
- være kostbare;
- leveres i små mængder;
- være beregnet til specifikke officielle analysemetoder.
Ved at kvalificere en sekundær standard mod en primær standard kan rutinemæssige undersøgelser udføres uden konstant at bruge den primære standard.
Pålideligheden afhænger af kvalificeringens kvalitet.
Hvad betyder kvalificering af en arbejdstandard?
Kvalificering betyder, at arbejdstandardens egenskaber undersøges systematisk og sammenlignes med en egnet reference.
Et kvalificeringsprogram kan omfatte:
- identitetskontrol;
- HPLC-renhed;
- peptidassay;
- vandindhold;
- modionindhold;
- sammenligning af kromatogrammer;
- sammenligning af massespektre;
- stabilitetsvurdering.
De nødvendige tests afhænger af den tilsigtede anvendelse.
Identitet versus kvantificering
En referencestandard kan have forskellige analytiske funktioner.
Identitetsstandard
En identitetsstandard bruges til at undersøge, om en ukendt prøve stemmer overens med det forventede peptid.
Mulige sammenligninger er:
- HPLC-retentietid;
- molekylmasse;
- massespektrometrisk profil;
- spektroskopiske egenskaber.
Kvantitativ standard
En kvantitativ standard bruges til at bestemme mængden af peptid.
Derfor skal det faktiske peptidindhold være kendt med tilstrækkelig pålidelighed.
En høj HPLC-renhed alene er normalt ikke tilstrækkelig til dette.
Hvorfor er HPLC-renhed ikke tilstrækkelig?
Et peptid kan for eksempel have en HPLC-renhed på 99 %.
Det betyder ikke automatisk, at 99 % af den samlede masse består af peptidet.
Materialet kan desuden indeholde:
- vand;
- acetat;
- chlorid;
- TFA;
- salte;
- andre komponenter, der ikke er målt kromatografisk.
For en kvantitativ standard skal der derfor skelnes mellem:
- kromatografisk renhed;
- samlet materialemasse;
- nettopeptidindhold.
Hvad er den tildelte værdi?
En referencestandard kan have en tildelt værdi.
Denne værdi beskriver for eksempel:
- peptidindhold;
- renhed;
- koncentration;
- potens;
- mængde pr. pakning.
Den tildelte værdi skal være baseret på egnede analytiske data.
Der kan også angives en korrektionsfaktor.
Hvad er en korrektionsfaktor?
En korrektionsfaktor bruges til at omregne den afvejede materialemængde til den faktiske peptidmængde.
Antag:
- afvejet materiale: 10,0 mg;
- tildelt peptidindhold: 85 %;
- faktisk peptidmængde: 8,5 mg.
Hvis denne korrektion ikke anvendes, kan den beregnede koncentration blive overvurderet.
Hvorfor er nettopeptidindhold vigtigt?
Nettopeptidindhold beskriver andelen af det faktiske peptid i det undersøgte materiale.
Ved beregningen kan faktorer som følgende medtages:
- restfugtighed;
- modioner;
- organiske komponenter;
- uorganiske komponenter.
Til kvantitativ analyse er dette ofte mere relevant end kun HPLC-renheden.
Hvilken rolle spiller aminosyreanalyse?
Aminosyreanalyse kan bruges til at bestemme peptidindholdet.
Peptidkæden hydrolyseres derved til individuelle aminosyrer.
Udvalgte aminosyrer kvantificeres derefter.
Når det er kendt, hvor meget af disse aminosyrer der er til stede i hver peptidkæde, kan mængden af peptid beregnes.
Aminosyreanalyse kan derfor bidrage til værditildelingen af en referencestandard.
Hvilken rolle spiller massespektrometri?
Massespektrometri kan hjælpe med at bekræfte:
- molekylmasse;
- identitet;
- visse modifikationer;
- nedbrydningsprodukter.
LC-MS kan kombinere kromatografisk separation med massedetektion.
En tilsvarende molekylmasse understøtter identiteten, men beviser ikke i sig selv:
- præcis peptidmængde;
- fuldstændig sekvens;
- fravær af alle urenheder.
Derfor kombineres ofte flere teknikker.
Hvilken rolle spiller MS/MS?
Ved tandem-massespektrometri fragmenteres en udvalgt peptidion.
Fragmenterne kan give oplysninger om aminosyresekvensen.
MS/MS kan derfor give yderligere støtte til:
- sekvensbekræftelse;
- lokalisering af modifikationer;
- identifikation af nedbrydningsprodukter.
Analysekraften afhænger af:
- peptidstørrelse;
- fragmentering;
- instrumentopløsning;
- databehandling.
Hvilken rolle spiller HPLC?
HPLC kan anvendes til:
- sammenligning af retentionstider;
- vurdering af kromatografisk renhed;
- undersøgelse af hjælpepeaks;
- kvantitativ assay;
- stabilitetsundersøgelse.
Ved sammenligning skal reference og prøve analyseres med den samme kontrollerede metode.
Vigtige parametre er:
- kolonnetype;
- mobil fase;
- temperatur;
- flowhastighed;
- detektionsbølgelængde.
Hvad er en kalibreringskurve?
En kalibreringskurve beskriver forholdet mellem kendte koncentrationer og målte detectorsignaler.
En pålidelig kalibreringskurve skal vurderes med hensyn til:
- linearitet;
- måleområde;
- reproducerbarhed;
- afvigelser;
- egnethed til den analytiske metode.
Den ukendte koncentration beregnes inden for det validerede måleområde.
Ekstrapolation uden for dette område kan medføre yderligere usikkerhed.
Hvad er linearitet?
Linearitet beskriver, i hvilken grad det målte signal ændrer sig proportionalt med koncentrationen.
Når koncentrationen fordobles, forventes der inden for et lineært område en tilsvarende ændring i signalet.
Sammenhængen behøver ikke være lineær for hver metode over hele koncentrationsområdet.
Derfor undersøges det relevante måleområde eksperimentelt.
Hvad betyder analytisk sporbarhed?
Analytisk eller metrologisk sporbarhed beskriver, hvordan et måleresultat via en dokumenteret sammenligningskæde er forbundet med en anerkendt reference.
Vigtige elementer er:
- anvendt standard;
- certifikat;
- tildelt værdi;
- kalibrering;
- analysemetode;
- måleusikkerhed;
- dokumentation.
Sporbarhed understøtter sammenligneligheden af resultater mellem:
- forskellige måledage;
- laboratorier;
- instrumenter;
- batches.
Hvad er metrologisk sporbarhed?
Metrologi er videnskaben om måling.
Metrologisk sporbarhed kræver en dokumenteret og ubrudt sammenligningskæde til en specificeret reference. Hvert trin bidrager til den samlede måleusikkerhed.
For peptidanalyse kan den praktiske sporbarhed blandt andet afhænge af:
- referencestandard;
- tildelt peptidindhold;
- kalibreret vægt;
- volumetrisk udstyr;
- analytisk metode.
Hvad er måleusikkerhed?
Hver analytisk måling indeholder usikkerhed.
Mulige kilder er:
- usikkerhed for referencestandarden;
- vejning;
- pipettering;
- fortynding;
- instrumentvariation;
- kalibrering;
- peak-integration;
- prøveforberedelse.
Måleusikkerhed betyder ikke, at et resultat er upålideligt.
Det beskriver den estimerede spredning, som den sande værdi med rimelighed kan ligge inden for.
Hvorfor skal standarder være batchspecifikke?
Også referencestandarder produceres i batches.
Forskellige batches kan variere med hensyn til:
- peptidindhold;
- vandindhold;
- modionindhold;
- renhedsprofil;
- stabilitet.
Derfor skal det være tydeligt, hvilket lotnummer for referencestandarden der blev anvendt.
Hvad står der på et certifikat for en referencestandard?
Et certifikat kan indeholde oplysninger om:
- navn;
- katalognummer;
- lotnummer;
- tildelt værdi;
- tilsigtet anvendelse;
- opbevaringsbetingelser;
- gyldighedsoplysninger;
- analysemetoder;
- korrektionsfaktor.
Ikke alle certifikater indeholder de samme oplysninger.
Standarden skal anvendes i henhold til de tilhørende instruktioner.
Hvorfor er opbevaringsbetingelser vigtige?
En referencestandard kan ændre sig under opbevaring.
Mulige processer omfatter:
- oxidation;
- deamidering;
- fugtabsorption;
- aggregering;
- nedbrydning.
Derfor kan der fastsættes betingelser for:
- temperatur;
- beskyttelse mod lys;
- beskyttelse mod fugt;
- anvendelse efter åbning;
- opbevaringsvarighed.
En standard, der er opbevaret forkert, kan føre til ukorrekte sammenligninger.
Hvad er en udløbsdato?
Nogle referencestandarder har en fastsat udløbsdato.
Andre standarder anvender:
- gyldighedskontrol;
- rekvalificeringsdato;
- aktuel lotstatus.
Laboratoriet skal kontrollere, om standarden er egnet og gyldig på anvendelsestidspunktet.
Hvad er rekvalificering?
Rekvalificering er en fornyet vurdering af en referencestandard.
Mulige analyser omfatter:
- HPLC;
- LC-MS;
- peptidassay;
- vandindhold;
- sammenligning med en primær standard.
Rekvalificering kan være nødvendig efter:
- forudbestemt anvendelsesperiode;
- langvarig opbevaring;
- ændring i udseende;
- afvigende analyseresultat.
Hvorfor er urenhedsstandarder vigtige?
Det er ikke kun det ønskede peptid, der kan bruges som standard.
Også kendte urenheder eller nedbrydningsprodukter kan fungere som referencemateriale.
Eksempler omfatter:
- oxidationsprodukter;
- deamiderede varianter;
- fragmenter;
- deletionssekvenser;
- aggregationsrelaterede komponenter.
Disse standarder kan hjælpe med at identificere og kvantificere bipidser.
Hvad er nedbrydningsstandarder?
En nedbrydningsstandard repræsenterer en kendt nedbrydningsvariant.
Denne kan bruges til at undersøge:
- hvor et nedbrydningsprodukt eluerer;
- hvilken molekylvægt der er til stede;
- hvor følsom analysemetoden er;
- hvor meget nedbrydningsprodukt der er til stede.
Ikke alle nedbrydningsprodukter er tilgængelige som rene standarder.
Referencestandarder og metodevalidering
En analysemetode skal kunne dokumenteres egnet til det tilsigtede formål.
ICH Q2(R2) beskriver principper for validering af analytiske procedurer. Relevante egenskaber kan blandt andet omfatte specificitet, nøjagtighed, præcision, linearitet og måleområde.
Referencestandarder kan bruges til at undersøge:
- nøjagtighed;
- specificitet;
- linearitet;
- kvantitativt interval;
- metodeydelse.
Hvad er nøjagtighed?
Nøjagtighed beskriver, hvor tæt et målt resultat ligger på en accepteret referenceværdi.
En velkarakteriseret standard kan bruges til at undersøge en analysemetodes nøjagtighed.
Hvad er præcision?
Præcision beskriver, hvor tæt gentagne måleresultater ligger på hinanden.
En metode kan give meget præcise resultater, som alligevel afviger systematisk.
Derfor er både præcision og nøjagtighed vigtige.
Hvad er specificitet?
Specificitet beskriver, om analysemetoden i tilstrækkelig grad kan skelne den ønskede komponent fra andre komponenter.
Eksempler omfatter:
- urenheder;
- nedbrydningsprodukter;
- formuleringskomponenter;
- modioner.
En passende referencestandard kan hjælpe med identifikationen af hovedtoppen.
Kan to laboratorier opnå forskellige resultater?
Ja.
Forskelle kan skyldes:
- referencestandard;
- analysemetode;
- prøveforberedelse;
- udstyr;
- kalibrering;
- databehandling;
- måleusikkerhed.
Anvendelse af velkarakteriserede standarder og validerede metoder kan forbedre sammenligneligheden.
Er et kommercielt peptid automatisk en referencestandard?
Nej.
Et kommercielt peptid kan være egnet som forskningsmateriale, men er ikke automatisk en kvalificeret referencestandard.
Følgende skal være klart ved anvendelse som standard:
- identitet;
- peptidindhold;
- renhed;
- vandindhold;
- modionindhold;
- opbevaringsstabilitet;
- dokumentation.
Kravene afhænger af det analytiske formål.
Officielle farmakopéale referencestandarder
Officielle organisationer stiller referencestandarder til rådighed for specifikke kompendiale anvendelser.
Eksempler omfatter:
- USP Reference Standards;
- European Pharmacopoeia Reference Standards;
- WHO International Chemical Reference Substances.
Disse standarder er beregnet til de anvendelser, der er beskrevet i de tilhørende officielle metoder eller den tilhørende dokumentation.
Der findes ikke en officiel farmakopéstandard for alle forskningspeptider.
Videnskabelige begrænsninger
En referencestandard forbedrer den analytiske sammenlignelighed, men løser ikke enhver måleudfordring.
Pålideligheden afhænger fortsat af:
- analysemetode;
- prøveforberedelse;
- instrument;
- kalibrering;
- opbevaring;
- databehandling;
- måleusikkerhed.
En overensstemmende HPLC-retentionstid beviser ikke i sig selv den fuldstændige molekylære identitet.
En overensstemmende molekylmasse beviser ikke automatisk:
- korrekt fuldstændig sekvens;
- præcis peptidmængde;
- fravær af alle urenheder.
Derfor anvendes flere komplementære analyseteknikker.
Resumé
En peptidreferencestandard er et velkarakteriseret materiale, der anvendes som analytisk sammenligningsgrundlag.
Referencestandarder kan anvendes til:
- identifikation;
- HPLC-sammenligning;
- kalibrering;
- peptidassay;
- kvantificering;
- metodevalidering;
- analyse af urenheder.
En primær standard karakteriseres omfattende.
En sekundær standard eller arbejdsstandard kvalificeres mod en passende primær reference og kan anvendes til rutineanalyse.
Til kvantitative anvendelser er HPLC-renhed alene normalt utilstrækkelig. Også peptidindhold, vand, modioner og andre relevante komponenter skal vurderes.
Pålidelig analytisk sammenligning kræver:
- egnet referencestandard;
- korrekt værditildeling;
- batchsporbarhed;
- kontrolleret opbevaring;
- valideret analysemetode;
- vurdering af måleusikkerhed.
Officielle kilder og videnskabelige referencer
-
ICH Q2(R2) — Validation of Analytical Procedures
International retningslinje for validering af analytiske procedurer, herunder specificitet, nøjagtighed, præcision, linearitet og måleområde. -
USP — Official Reference Standards
USP beskriver referencestandarder som omfattende karakteriserede materialer til blandt andet undersøgelse af identitet, styrke, renhed og kvalitet. -
European Pharmacopoeia Reference Standards — EDQM
EDQM-kataloget indeholder officielt gyldige referencestandarder til de anvendelser, der er beskrevet i Den Europæiske Farmakopé. -
WHO — International Chemical Reference Substances
WHO-ICRS fastlægges gennem procedurer, der følger WHO's retningslinjer for kemiske referencestoffer. -
NIST — Metrological Traceability
NIST beskriver metrologisk sporbarhed som en dokumenteret, ubrudt kæde af kalibreringer til specificerede referencer. -
NIST — Standard Reference Materials
NIST udvikler og certificerer referencematerialer med velkarakteriseret sammensætning eller velkarakteriserede egenskaber for at understøtte pålidelige og sammenlignelige målinger. -
FDA — Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics
FDA-retningslinjer omhandler anvendelse og kvalificering af referencestandarder inden for validering af analytiske metoder.
Forskningsdisclaimer
Peptideras forskningspeptider tilbydes udelukkende til Research Use Only (RUO) og er beregnet til laboratorieforskning og analytiske anvendelser.
Ikke beregnet til indtagelse af mennesker eller dyr, diagnostisk brug, terapeutisk anvendelse eller selvadministration.
Kategori:
Peptidviden & kvalitetskontrol
Relaterede Peptidera-produkter:
Forskningspeptider med batchidentifikation og tilgængelige uafhængige analytiske kvalitetsdata
Relaterede interne blogs:
- PB-0230 — Peptidrenhed og HPLC
- PB-0231 — Massespektrometri af peptider
- PB-0233 — Peptidanalyse: renhed versus peptidindhold
- PB-0238 — Modioner i peptider
- PB-0239 — Aminosyreanalyser af peptider
- PB-0241 — Chain of custody ved peptidanalyse
Forslag til interne links:
- Link til PB-0230 om HPLC-retentionstid og kromatografisk sammenligning
- Link til PB-0231 om LC-MS, molekylmasse og MS/MS
- Link til PB-0233 om kvantitative peptidanalyser
- Link til PB-0238 om modioner og nettopeptidindhold
- Link til PB-0239 om aminosyreanalyse og værditildeling
- Link til PB-0241 om sporbarhed af standarder og prøver
- Link til Peptidera-siden med uafhængige analysecertifikater
- Link til samlingen af forskningspeptider