Análisis de aminoácidos en péptidos explicado
Análisis de aminoácidos en péptidos: explicación de la composición y la cuantificación
Los péptidos están formados por cadenas de aminoácidos. La secuencia de estos aminoácidos determina gran parte de las propiedades químicas y estructurales de un péptido.
En los análisis de calidad, suelen utilizarse técnicas como la HPLC y la espectrometría de masas para evaluar la pureza y la masa molecular. Un método analítico complementario es el análisis de aminoácidos, a menudo abreviado como AAA.
El análisis de aminoácidos puede utilizarse para investigar:
- qué aminoácidos están presentes en una muestra;
- cómo se corresponden las proporciones de aminoácidos medidas con la composición esperada;
- cuánto péptido está presente;
- si la composición de aminoácidos corresponde a la del péptido teórico;
- cómo se puede calcular el contenido peptídico neto.
El método funciona de manera diferente a la HPLC y la espectrometría de masas. En el análisis clásico de aminoácidos, la cadena peptídica se descompone primero en aminoácidos individuales. Después, estos aminoácidos se separan, detectan y cuantifican.
El análisis de aminoácidos puede proporcionar información valiosa, pero también tiene limitaciones. Durante la degradación, algunos aminoácidos pueden modificarse parcialmente o perderse. Por ello, los resultados siempre deben interpretarse en el contexto del método utilizado.
¿Qué es el análisis de aminoácidos?
El análisis de aminoácidos es una técnica de laboratorio que permite estudiar la composición de aminoácidos de una muestra.
En un análisis clásico, normalmente se realizan los siguientes pasos:
- preparación de la muestra;
- hidrólisis de la cadena peptídica;
- liberación de aminoácidos individuales;
- separación de los aminoácidos;
- detección y cuantificación;
- comparación con la composición esperada.
El resultado puede expresarse como:
- cantidad de cada aminoácido;
- relación molar;
- concentración másica;
- perfil de aminoácidos;
- contenido peptídico calculado.
¿Qué es la hidrólisis?
La hidrólisis es un proceso químico en el que los enlaces se rompen con ayuda del agua.
En el análisis de aminoácidos, se rompen los enlaces peptídicos para liberar aminoácidos individuales.
Un método muy utilizado es la hidrólisis ácida.
Para ello, la muestra se expone durante un período controlado a:
- ácido fuerte;
- temperatura elevada;
- condiciones controladas.
Después de la hidrólisis, la cadena peptídica original ya no existe como molécula intacta.
A continuación, los aminoácidos liberados pueden analizarse por separado.
¿Por qué se descompone la cadena peptídica?
Un péptido intacto puede contener decenas de residuos de aminoácidos diferentes.
Al romper la cadena, se puede medir la cantidad total de cada aminoácido.
Supongamos que un péptido teórico contiene:
- cuatro residuos de alanina;
- dos residuos de glicina;
- tres residuos de leucina;
- un residuo de tirosina.
Tras la hidrólisis, se puede investigar si las proporciones medidas coinciden aproximadamente con esta composición teórica.
Esto respalda la evaluación de la composición de aminoácidos.
¿Cuál es la diferencia entre la composición de aminoácidos y la secuencia de aminoácidos?
El análisis de aminoácidos mide principalmente qué aminoácidos están presentes y en qué cantidad.
El método no determina automáticamente el orden exacto.
Dos péptidos diferentes pueden tener la misma composición de aminoácidos, pero un orden diferente.
Por ejemplo:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Ambos contienen:
- una alanina;
- una glicina;
- una leucina.
Aun así, la secuencia es diferente.
Para el análisis de secuencias se necesitan otras técnicas, como:
- espectrometría de masas en tándem;
- análisis de fragmentos;
- métodos de secuenciación específicos.
¿Puede el análisis de aminoácidos confirmar la identidad?
El análisis de aminoácidos puede respaldar la composición esperada.
Cuando el perfil de aminoácidos medido se desvía considerablemente de la composición teórica, esto puede dar lugar a una investigación adicional.
Sin embargo, un perfil coincidente no demuestra por sí solo que la secuencia exacta de aminoácidos sea correcta.
Para una evaluación más amplia de la identidad, pueden combinarse:
- masa molecular;
- LC-MS;
- MS/MS;
- análisis de aminoácidos;
- datos cromatográficos.
¿Cómo se separan los aminoácidos?
Tras la hidrólisis, la muestra contiene una mezcla de aminoácidos libres.
Estos deben separarse analíticamente entre sí.
Las técnicas posibles son:
- cromatografía de intercambio iónico;
- HPLC;
- UPLC;
- electroforesis capilar.
La técnica elegida depende de:
- sensibilidad deseada;
- método de laboratorio;
- tipo de muestra;
- precisión necesaria.
¿Qué es la derivatización?
Muchos aminoácidos tienen una detectabilidad limitada sin un tratamiento adicional.
Por ello, pueden unirse químicamente a un grupo detectable.
Esto se denomina derivatización.
La derivatización puede realizarse:
- antes de la separación cromatográfica;
- después de la separación cromatográfica.
Los derivados formados pueden medirse mejor, por ejemplo, mediante:
- detección UV;
- detección fluorescente;
- espectrometría de masas.
Derivatización precolumna
En la derivatización precolumna, los aminoácidos se marcan antes de la separación cromatográfica.
Después, los derivados formados se separan mediante una columna.
Las posibles ventajas son:
- alta sensibilidad;
- detección fluorescente adecuada;
- análisis de varios aminoácidos.
La reacción debe desarrollarse de forma reproducible.
Una derivatización incompleta puede afectar a la cuantificación.
Derivatización poscolumna
En la derivatización poscolumna, primero se separan los aminoácidos.
Después de la columna reaccionan con un reactivo de detección.
Un ejemplo conocido es el análisis con ninhidrina.
A continuación, los productos de reacción formados pueden medirse ópticamente.
¿Cómo se determina la cantidad de aminoácido?
Para la cuantificación se utilizan estándares de referencia.
Las soluciones estándar contienen cantidades conocidas de aminoácidos.
Estos se miden para establecer una relación entre:
- concentración;
- señal del detector.
Después se mide la muestra desconocida.
Con los datos de calibración se puede calcular la cantidad de cada aminoácido.
¿Qué es un estándar interno?
Un estándar interno es una sustancia conocida que se añade a las muestras y a las soluciones de calibración.
Este puede ayudar a corregir la variación durante la:
- preparación de muestras;
- inyección;
- derivatización;
- análisis.
El estándar interno debe distinguirse analíticamente bien de los aminoácidos analizados.
¿Cómo puede el análisis de aminoácidos determinar el contenido de péptidos?
Cuando se conoce la composición de aminoácidos de un péptido, se pueden utilizar aminoácidos seleccionados para calcular la cantidad de péptido.
Supongamos que cada cadena peptídica contiene exactamente cuatro residuos de alanina.
Cuando se mide la cantidad total de alanina, se puede estimar cuántas cadenas peptídicas había.
El cálculo tiene en cuenta:
- número de residuos por péptido;
- masa molecular;
- cantidad de aminoácido medida;
- método analítico.
Esto puede utilizarse para un ensayo cuantitativo de péptidos.
¿Por qué no siempre se utilizan todos los aminoácidos?
No todos los aminoácidos son igual de adecuados para la cuantificación.
Algunos aminoácidos pueden durante la hidrólisis:
- degradarse parcialmente;
- cambiar químicamente;
- liberarse de forma incompleta;
- medirse de forma fiable.
Por eso, a menudo se seleccionan aminoácidos estables.
La elección depende de la secuencia peptídica y del método analítico.
¿Qué aminoácidos pueden cambiar durante la hidrólisis?
La hidrólisis ácida puede tener distintos efectos.
Triptófano
El triptófano puede degradarse en gran medida durante la hidrólisis ácida estándar.
Por eso se necesitan métodos adaptados cuando se debe medir específicamente el triptófano.
Asparagina
La asparagina puede convertirse en aspartato durante la hidrólisis.
Por ello, en el análisis clásico, la asparagina y el aspartato no siempre se informan por separado.
Glutamina
La glutamina puede convertirse en glutamato.
Esto permite mostrar conjuntamente la glutamina y el glutamato.
Serina
La serina puede perderse parcialmente durante una hidrólisis prolongada.
Treonina
La treonina también puede degradarse parcialmente.
Cisteína
La cisteína puede experimentar cambios oxidativos.
Para realizar un análisis fiable, puede ser necesaria una oxidación previa o un método adaptado.
¿Por qué es importante el tiempo de hidrólisis?
Los enlaces peptídicos deben degradarse lo suficiente.
Una hidrólisis demasiado breve puede provocar:
- degradación incompleta;
- valores de aminoácidos medidos demasiado bajos.
Una hidrólisis demasiado prolongada puede provocar:
- degradación adicional de aminoácidos sensibles;
- pérdida de medición.
Por ello, se controlan el tiempo y la temperatura de hidrólisis.
A veces se utilizan varios tiempos de hidrólisis para investigar la pérdida o la degradación incompleta.
¿Qué es una proporción molar?
Una proporción molar describe las cantidades relativas de aminoácidos.
Supongamos que un péptido contiene teóricamente:
- dos alaninas;
- una glicina;
- tres leucinas.
La proporción molar teórica es:
2 : 1 : 3
Tras el análisis, los valores medidos pueden normalizarse.
Cuando la proporción se aproxima al valor teórico, esto respalda la composición de aminoácidos esperada.
Pueden producirse pequeñas desviaciones debido a:
- incertidumbre de medición;
- pérdida por hidrólisis;
- derivatización;
- integración de picos cromatográficos.
¿Qué significa normalización?
En la normalización, los valores de aminoácidos medidos se convierten en proporciones relativas.
Se puede utilizar un aminoácido adecuado como referencia.
Esto permite comparar el perfil medido con la composición teórica.
La normalización es útil para estudiar la composición, pero no proporciona automáticamente la cantidad absoluta de péptido.
Análisis de aminoácidos frente a pureza por HPLC
La pureza por HPLC y el análisis de aminoácidos miden propiedades diferentes.
La pureza por HPLC suele examinar:
- pico cromatográfico principal;
- cantidad relativa de picos secundarios.
El análisis de aminoácidos examina:
- composición de aminoácidos;
- cantidad de aminoácidos seleccionados;
- posible cuantificación de péptidos.
Una alta pureza por HPLC no demuestra automáticamente que la composición de aminoácidos sea correcta.
Una composición de aminoácidos adecuada no demuestra automáticamente que no haya impurezas relacionadas con péptidos.
Las técnicas se complementan.
Análisis de aminoácidos frente a espectrometría de masas
La espectrometría de masas examina la relación masa-carga de las moléculas.
Una medición de masa intacta puede respaldar que la masa molecular coincide con el valor teórico.
El análisis de aminoácidos examina la cantidad y la proporción de aminoácidos tras la degradación.
Ambas técnicas tienen distintos puntos fuertes.
Una combinación puede proporcionar más información sobre:
- identidad;
- composición;
- contenido de péptidos.
Análisis de aminoácidos frente a ensayo de péptidos
El análisis de aminoácidos puede utilizarse como método de ensayo.
Un ensayo de péptidos describe el objetivo:
determinar la cantidad de péptido.
El análisis de aminoácidos es una de las técnicas con las que se puede alcanzar este objetivo.
Otros posibles métodos de ensayo son:
- HPLC cuantitativa;
- espectrofotometría UV;
- cuantificación por LC-MS;
- balance de masas.
¿Qué influencia tienen los contraiones?
Contraiones como:
- acetato;
- cloruro;
- TFA;
contribuyen a la masa total del material liofilizado.
En el análisis de aminoácidos se examinan principalmente los componentes aminoacídicos del péptido.
Por lo tanto, el método puede ayudar a distinguir entre:
- masa total del material;
- cantidad real de péptidos.
Para un balance de masas completo pueden ser necesarios análisis adicionales.
¿Qué influencia tiene la humedad residual?
La humedad residual contribuye al peso total, pero no a la composición de aminoácidos.
Al calcular el contenido neto de péptidos, el análisis de humedad puede aportar información adicional.
Un balance de masas completo puede incluir:
- contenido de péptidos;
- contenido de agua;
- contenido de contraiones;
- otros componentes.
¿Puede el análisis de aminoácidos demostrar la presencia de contaminantes?
Algunas señales anómalas de aminoácidos pueden indicar la presencia de componentes inesperados.
Sin embargo, el método no está diseñado para detectar todas las posibles impurezas.
Pueden ser necesarias otras técnicas para:
- impurezas orgánicas;
- disolventes residuales;
- metales;
- contaminación microbiológica;
- endotoxinas.
¿Qué puede aparecer en un COA?
Un certificado de análisis puede contener información como:
- prueba: análisis de aminoácidos;
- método analítico;
- proporciones de aminoácidos medidas;
- proporciones teóricas;
- contenido de péptidos calculado;
- fecha de análisis;
- número de lote.
No todos los COA contienen un análisis de aminoácidos.
Cuando solo se han realizado HPLC y EM, no puede deducirse de ello una cuantificación completa de aminoácidos.
¿Por qué es importante la vinculación con el lote?
Un análisis de aminoácidos debe estar vinculado al lote analizado.
Los datos importantes son:
- número de lote;
- nombre del producto;
- fecha del análisis;
- laboratorio;
- método analítico.
Un informe analítico sin una vinculación clara con el lote tiene menos valor para la trazabilidad.
¿Qué significa incertidumbre de medición?
Todo análisis cuantitativo contiene incertidumbre de medición.
En el análisis de aminoácidos, las fuentes de variación pueden ser:
- preparación de muestras;
- hidrólisis;
- pérdida de aminoácidos;
- derivatización;
- calibración;
- separación cromatográfica;
- integración de picos.
Por lo tanto, los resultados no deben considerarse absolutamente libres de errores.
¿Por qué es importante la validación del método?
Un método debe ser adecuado para el propósito previsto.
En el análisis cuantitativo de aminoácidos, las características de validación relevantes pueden incluir:
- exactitud;
- precisión;
- linealidad;
- especificidad;
- rango de medición;
- robustez;
- repetibilidad.
Un método adecuado para obtener un perfil cualitativo de aminoácidos no es automáticamente suficiente para la cuantificación exacta de péptidos.
Limitaciones científicas
El análisis de aminoácidos tiene limitaciones importantes.
El método no determina por sí solo:
- secuencia exacta de aminoácidos;
- masa molecular;
- pureza por HPLC;
- estructura tridimensional;
- actividad biológica;
- esterilidad;
- contenido de endotoxinas.
Además, algunos aminoácidos pueden cambiar durante la hidrólisis.
Para una evaluación amplia de la calidad, deben combinarse varias técnicas analíticas.
Resumen
El análisis de aminoácidos examina la composición y la cantidad de aminoácidos de un péptido.
En el análisis clásico, la cadena peptídica se descompone primero mediante hidrólisis.
A continuación, los aminoácidos son:
- separados;
- detectados;
- cuantificados;
- comparada con la composición teórica.
El análisis de aminoácidos puede utilizarse para:
- control de la composición de aminoácidos;
- evaluación de las proporciones molares;
- cuantificación del contenido de péptido;
- apoyo a la identidad.
El método tiene limitaciones porque determinados aminoácidos pueden cambiar durante la hidrólisis.
Por ello, el análisis de aminoácidos se combina preferentemente con:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- ensayo de péptidos;
- análisis de humedad residual;
- análisis de contraiones.
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