Espectrometría de masas aplicada a péptidos explicada
Espectrometría de masas en péptidos: ¿cómo se investiga la identidad molecular?
En el control de calidad de péptidos de investigación, a menudo se combinan varias técnicas analíticas. La HPLC puede proporcionar información sobre la pureza cromatográfica, pero un pico principal elevado no demuestra automáticamente que esté presente el péptido correcto.
Para investigar más a fondo la identidad molecular, se utiliza a menudo la espectrometría de masas.
La espectrometría de masas, generalmente abreviada como MS, es una técnica analítica que mide la relación masa-carga de moléculas ionizadas. En el análisis de péptidos, la masa molecular medida puede compararse con la masa teórica esperada de la secuencia de aminoácidos.
Cuando estos valores coinciden, esto respalda la identificación del péptido analizado. Sin embargo, la espectrometría de masas tampoco proporciona por sí sola una visión completa de la calidad.
En este blog explicamos cómo funciona la espectrometría de masas, por qué los péptidos pueden producir múltiples señales de masa y cómo se interpretan los resultados de MS junto con HPLC y otros métodos analíticos.
¿Qué es la espectrometría de masas?
La espectrometría de masas es una técnica analítica mediante la cual las moléculas se convierten en partículas cargadas, es decir, iones.
A continuación, estos iones se separan y miden en función de su relación masa-carga.
Esta relación se representa como:
m/z
Aquí:
- m para la masa;
- z para la carga eléctrica.
Por lo tanto, un espectrómetro de masas no siempre mide directamente la masa molecular completa. El instrumento mide la relación entre masa y carga.
En moléculas más grandes, incluidos muchos péptidos, pueden generarse múltiples cargas. Como resultado, el mismo péptido puede aparecer en diferentes posiciones del espectro de masas.
¿Por qué se utiliza la espectrometría de masas en el análisis de péptidos?
Un péptido consta de una secuencia específica de aminoácidos.
Cada combinación de aminoácidos tiene una masa molecular teóricamente calculable.
La espectrometría de masas puede utilizarse para investigar si la masa medida coincide con este valor teórico.
El análisis por MS puede contribuir a:
- confirmación de la identidad molecular;
- comparación con la masa molecular teórica;
- detección de determinadas modificaciones químicas;
- análisis de productos de degradación;
- investigación de variantes peptídicas;
- comparación entre lotes de producción.
Una masa coincidente respalda la identidad de un péptido.
Sin embargo, el resultado siempre debe evaluarse en combinación con el método analítico y otros datos de calidad.
¿Cuál es la masa molecular teórica?
La masa molecular teórica se calcula basándose en:
- la secuencia de aminoácidos;
- el número de aminoácidos;
- posibles modificaciones químicas;
- la forma molecular;
- grupos terminales específicos.
Cuando los aminoácidos forman juntos una cadena peptídica, se crean enlaces peptídicos.
Durante la formación de cada enlace peptídico se separa una molécula de agua. Por eso, la masa de un péptido completo no es simplemente la suma de todos los aminoácidos individuales.
Las modificaciones también pueden afectar a la masa.
Ejemplos:
- amidación;
- acetilación;
- fosforilación;
- oxidación;
- adición de cadenas de ácidos grasos;
- formación de puentes disulfuro.
Por tanto, la masa teórica debe calcularse para la estructura molecular exacta.
¿Qué significa peso molecular?
Los términos masa molecular y peso molecular suelen utilizarse indistintamente.
En los informes de laboratorio, el valor suele expresarse en:
- dalton, abreviado Da;
- kilodalton, abreviado kDa.
Un dalton corresponde aproximadamente a la masa de un átomo de hidrógeno.
Por tanto, un péptido con una masa molecular de 3.000 Da tiene una masa de aproximadamente 3 kDa.
La masa molecular de los péptidos puede variar considerablemente, dependiendo de:
- longitud de la cadena;
- composición de aminoácidos;
- modificaciones químicas.
¿Cómo funciona un espectrómetro de masas?
Un espectrómetro de masas suele constar de varias partes.
1. Introducción de la muestra
Primero se prepara el péptido y se introduce en el instrumento.
La preparación de la muestra puede influir en:
- intensidad de la señal;
- detectabilidad;
- formación de iones;
- señales de fondo.
2. Ionización
Las moléculas adquieren carga eléctrica.
Las técnicas más utilizadas para el análisis de péptidos son:
- ionización por electrospray;
- desorción/ionización láser asistida por matriz.
3. Análisis de masas
Los iones formados se separan en función de su relación masa-carga.
4. Detección
El detector registra los iones.
5. Procesamiento de datos
Las señales medidas se convierten en un espectro de masas.
Este espectro contiene picos que corresponden a los iones detectados.
¿Qué es la ionización por electrospray?
La ionización por electrospray, abreviada como ESI, es una técnica de ionización muy utilizada para péptidos.
Durante la ESI, una muestra líquida pasa por una abertura fina mientras se aplica una tensión eléctrica.
Esto produce gotículas eléctricamente cargadas.
Cuando el disolvente se evapora, quedan moléculas cargadas.
Una característica importante de la ESI es que las moléculas grandes pueden adquirir varias cargas eléctricas.
Por ejemplo, un péptido puede presentarse como:
- [M+H]⁺;
- [M+2H]²⁺;
- [M+3H]³⁺.
Aquí, M representa la masa molecular del péptido.
Varias cargas generan diferentes señales m/z para la misma molécula.
¿Por qué un péptido tiene varios picos?
Cuando un péptido capta varios protones, se forman diferentes estados de carga.
Supongamos que un péptido tiene una masa molecular de aproximadamente 3.000 Da.
Mogelijke signalen zijn dan ongeveer:
- una carga positiva: m/z de aproximadamente 3.001;
- dos cargas positivas: m/z de aproximadamente 1.501;
- tres cargas positivas: m/z de aproximadamente 1.001.
Todas estas señales pueden corresponder al mismo péptido.
El software puede utilizar esta distribución de cargas para calcular la masa molecular original.
Este proceso se denomina deconvolución.
¿Qué es un espectro de masas deconvolucionado?
Una medición de ESI sin procesar puede contener varios picos de carga.
Esto puede complicar la interpretación.
Con un software de deconvolución, las distintas formas de carga se convierten en una única masa molecular estimada.
Por ello, el espectro deconvolucionado puede compararse más fácilmente con:
- la masa teórica;
- un estándar de referencia;
- especificaciones del producto.
La calidad del cálculo depende de:
- intensidad de la señal;
- resolución;
- ruido de fondo;
- ajustes del software;
- presencia de componentes solapados.
¿Qué es la MALDI?
La desorción/ionización láser asistida por matriz, abreviada como MALDI, es otra técnica de ionización.
El péptido se mezcla con un material de matriz y se aplica a una placa de análisis.
Un láser activa la matriz, lo que da lugar a la formación de iones de péptidos.
La MALDI produce a menudo principalmente iones con una sola carga.
Por ello, el espectro puede parecer más sencillo que un espectro de ESI.
La MALDI se combina habitualmente con un analizador de masas de tiempo de vuelo.
Esta combinación se denomina:
MALDI-TOF
¿Qué es el tiempo de vuelo?
En un analizador de masas de tiempo de vuelo, los iones se aceleran mediante un campo eléctrico.
A continuación, se desplazan por un tubo de medición.
Los iones con una relación masa-carga menor suelen llegar al detector más rápido que los iones con una relación mayor.
El tiempo de vuelo se utiliza para calcular el valor de m/z.
Los sistemas TOF pueden utilizarse para:
- identificación de péptidos;
- determinación de masas;
- comparación de variantes moleculares.
La precisión final depende de la calibración, los ajustes del instrumento y la preparación de la muestra.
¿Qué es la LC-MS?
La cromatografía líquida-espectrometría de masas, abreviada como LC-MS, combina la cromatografía líquida con la espectrometría de masas.
Primero, los componentes se separan cromatográficamente.
A continuación, el espectrómetro de masas analiza las señales individuales.
La LC-MS puede combinar información sobre:
- tiempo de retención;
- perfil cromatográfico;
- masa molecular;
- posibles impurezas;
- productos de degradación.
Por ello, la LC-MS puede proporcionar más información que un análisis independiente de HPLC o de MS.
¿Cuál es la diferencia entre la HPLC y la espectrometría de masas?
La HPLC y la espectrometría de masas responden a preguntas analíticas diferentes.
HPLC
La HPLC puede proporcionar información sobre:
- pureza cromatográfica;
- cantidad relativa de los componentes detectados;
- tiempos de retención;
- cambios en el perfil cromatográfico.
Espectrometría de masas
La espectrometría de masas puede proporcionar información sobre:
- masa molecular;
- identidad posible;
- modificaciones químicas;
- determinados productos de degradación.
Una comparación simplificada:
| Pregunta analítica | HPLC | Espectrometría de masas |
|---|---|---|
| ¿Cuántos componentes cromatográficos son visibles? | Sí | Limitadamente |
| ¿Cuál es el pico principal relativo? | Sí | No principalmente |
| ¿Coincide la masa con la del péptido esperado? | No | Sí |
| ¿Puede respaldarse la identidad? | Limitadamente | Sí |
| ¿Se determina la cantidad exacta en el vial? | No automáticamente | No automáticamente |
| ¿Se analiza la esterilidad? | No | No |
Por eso, ambas técnicas suelen combinarse.
¿Puede aparecer la misma masa molecular en diferentes péptidos?
Sí.
Diferentes secuencias de aminoácidos pueden tener la misma masa total o una masa total casi idéntica.
A veces se denominan estructuras isobáricas.
Por tanto, una masa coincidente no siempre demuestra que la secuencia completa de aminoácidos sea correcta.
Para una identificación más exhaustiva, pueden ser necesarias técnicas adicionales, como:
- espectrometría de masas en tándem;
- análisis de fragmentación;
- análisis de aminoácidos;
- análisis de secuencia;
- comparación con un estándar de referencia.
El método analítico necesario depende del nivel de certeza deseado.
¿Qué es la espectrometría de masas en tándem?
La espectrometría de masas en tándem suele escribirse como:
EM/EM
Durante la EM/EM, un ion peptídico seleccionado se fragmenta aún más.
A continuación, los fragmentos generados se vuelven a medir.
El patrón de fragmentación puede proporcionar información sobre:
- secuencia de aminoácidos;
- localización de las modificaciones;
- identidad del péptido;
- estructura de los productos de degradación.
Por tanto, la EM/EM puede proporcionar más información estructural que solo la masa molecular intacta.
¿Qué son los fragmentos peptídicos?
Cuando una cadena peptídica se rompe en lugares específicos durante la EM/EM, se forman iones fragmento.
Los tipos de fragmentos más comunes son:
- iones b;
- iones y.
Las masas de estos fragmentos pueden utilizarse para reconstruir partes de la secuencia de aminoácidos.
La interpretación puede ser compleja.
No todos los péptidos se fragmentan de la misma manera.
Entre los factores que pueden influir se encuentran:
- composición de aminoácidos;
- carga eléctrica;
- tamaño del péptido;
- método de fragmentación;
- modificaciones químicas.
¿Puede la espectrometría de masas detectar la oxidación?
Ciertos cambios oxidativos provocan un cambio de masa medible.
Por ejemplo, la adición de un átomo de oxígeno suele provocar un aumento de masa de aproximadamente 16 Da.
Por tanto, la espectrometría de masas puede ayudar a identificar determinados productos de oxidación.
La detección depende de:
- concentración;
- resolución del instrumento;
- método analítico;
- separación de componentes.
No todos los cambios oxidativos pueden localizarse por completo basándose únicamente en una señal de masa.
Para ello, puede ser necesario realizar un análisis de fragmentación adicional.
¿Puede la espectrometría de masas determinar la cantidad de péptido?
No automáticamente.
La intensidad de una señal de masas se ve afectada por:
- eficiencia de ionización;
- propiedades moleculares;
- disolvente;
- ajustes del instrumento;
- presencia de otros componentes.
Por tanto, una señal dos veces más intensa no significa automáticamente que haya el doble de péptido.
Para una cuantificación fiable se necesitan métodos validados y estándares adecuados.
Las técnicas posibles son:
- LC-MS cuantitativa;
- estándares internos;
- referencias marcadas isotópicamente;
- ensayos de HPLC calibrados.
¿Puede la espectrometría de masas demostrar la esterilidad?
No.
La espectrometría de masas para la identificación de péptidos no es una prueba de esterilidad.
El resultado no proporciona información directa sobre:
- bacterias;
- hongos;
- crecimiento microbiológico;
- esterilidad del producto.
La esterilidad requiere métodos de ensayo microbiológicos específicos.
Las endotoxinas tampoco se determinan automáticamente durante un análisis estándar de EM de péptidos.
¿Puede la espectrometría de masas medir endotoxinas?
No mediante un análisis de identidad estándar.
Las endotoxinas son componentes bacterianos complejos.
Para el análisis de endotoxinas se utilizan métodos específicos, como:
- prueba de lisado de amebocitos de Limulus;
- métodos basados en el factor C recombinante.
Por lo tanto, un espectro de masas correcto de un péptido no demuestra que el material tenga un bajo contenido de endotoxinas.
La identidad, la pureza, la esterilidad y las endotoxinas son parámetros de calidad independientes.
¿Por qué pueden diferir los resultados de laboratorio?
Distintos laboratorios pueden informar valores de masa ligeramente diferentes.
Las posibles causas son:
- tipo de instrumento;
- calibración;
- método de ionización;
- preparación de la muestra;
- aductos salinos;
- software utilizado;
- resolución;
- método de interpretación.
Las pequeñas diferencias no significan automáticamente que un resultado sea incorrecto.
El valor medido debe evaluarse dentro de:
- exactitud del instrumento;
- forma molecular esperada;
- método de análisis utilizado.
¿Qué son los aductos?
Durante la espectrometría de masas, los iones peptídicos pueden unirse a otras partículas cargadas.
Ejemplos:
- sodio;
- potasio;
- amonio.
Esto puede generar picos adicionales.
Por ejemplo, un aducto de sodio tiene una masa diferente de la de un ion peptídico simplemente protonado.
Los aductos no significan automáticamente que esté presente otro péptido.
La interpretación requiere conocimientos sobre:
- preparación de la muestra;
- tampones utilizados;
- formas iónicas esperadas.
¿Qué información debe incluir un informe de EM?
Un informe de análisis profesional puede incluir, entre otros:
- nombre del péptido;
- número de lote;
- masa molecular teórica;
- masa molecular medida;
- método de ionización;
- tipo de espectrómetro de masas;
- espectro de masas;
- fecha del análisis;
- nombre del laboratorio.
En un análisis más detallado también pueden indicarse:
- intervalo de medición;
- resolución;
- exactitud de masa;
- datos de fragmentación;
- software utilizada.
Los informes necesarios dependen del objetivo de la investigación.
Espectrometría de masas y control de lotes
Cada lote de producción puede analizarse por separado.
El análisis de MS específico del lote respalda:
- control de identidad;
- comparación entre lotes;
- trazabilidad;
- investigación de desviaciones.
El número de lote del informe de análisis debe coincidir con la identificación del vial.
Un resultado de espectrometría de masas sin una vinculación clara con el lote tiene un valor más limitado para la trazabilidad.
Limitaciones científicas
La espectrometría de masas es una potente técnica analítica, pero no constituye una evaluación completa de la calidad.
Una masa molecular coincidente no demuestra automáticamente:
- secuencia completa de aminoácidos;
- alta pureza cromatográfica;
- cantidad adecuada de péptido;
- esterilidad;
- bajo contenido de endotoxinas;
- actividad biológica;
- estabilidad a largo plazo.
Para una evaluación más amplia, pueden ser necesarios varios métodos:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- ensayo cuantitativo;
- estudio de estabilidad;
- análisis de humedad;
- pruebas adicionales específicas del producto.
Los resultados deben interpretarse conjuntamente.
Resumen
La espectrometría de masas se utiliza para investigar la masa molecular de los péptidos de investigación.
La técnica mide la relación masa-carga de moléculas ionizadas.
En el análisis de péptidos, la masa medida puede compararse con la masa teórica esperada.
Una coincidencia respalda la identificación molecular.
Las principales técnicas analíticas son:
- ESI-MS;
- MALDI-TOF;
- LC-MS;
- MS/MS.
Sin embargo, la espectrometría de masas no proporciona automáticamente información sobre:
- cantidad exacta;
- pureza cromatográfica;
- esterilidad;
- endotoxinas;
- actividad biológica.
Por ello, la MS suele combinarse con HPLC y análisis de calidad adicionales.
Aviso sobre investigación
Los péptidos de investigación de Peptidera se ofrecen exclusivamente para uso exclusivo en investigación (RUO) y están destinados a la investigación de laboratorio y a aplicaciones analíticas.
No destinado al consumo humano o animal, al uso diagnóstico, a aplicaciones terapéuticas ni a la autoadministración.
Categoría:
Conocimientos sobre péptidos y control de calidad
Productos relacionados de Peptidera:
Péptidos de investigación liofilizados con identificación del lote y datos analíticos de calidad disponibles
Blogs internos relacionados:
- PB-0227 — Péptidos liofilizados y liofilización
- PB-0228 — Viales de péptidos e integridad del envase
- PB-0229 — Números de lote y trazabilidad
- PB-0230 — Pureza de los péptidos y HPLC
- ¿Qué es un Certificado de Análisis?
Propuestas de enlaces internos:
- Enlace a PB-0230 sobre la diferencia entre HPLC y MS
- Enlace a PB-0229 para el análisis específico del lote
- Enlace a la página de COA con resultados de pruebas de espectrometría de masas
- Enlace a la colección de péptidos de investigación
- Enlace a la página sobre análisis de laboratorio independiente