Estándares de referencia de péptidos explicados
Estándares de referencia de péptidos: por qué es importante la comparación analítica
En el análisis de calidad de péptidos de investigación, suelen utilizarse técnicas como:
- HPLC;
- LC-MS;
- ensayo de péptidos;
- análisis de aminoácidos;
- espectrofotometría UV.
Estos instrumentos generan datos de medición, pero una señal del detector o un pico cromatográfico no tiene automáticamente un significado exacto.
Para identificar o cuantificar de forma fiable una muestra desconocida, esta puede compararse con un material cuyas propiedades relevantes ya se hayan determinado cuidadosamente.
Este tipo de material se denomina estándar de referencia.
Un estándar de referencia de péptidos bien caracterizado puede utilizarse para:
- identificación;
- comparación de los tiempos de retención;
- cuantificación;
- calibración;
- evaluación de métodos de HPLC;
- investigación de impurezas;
- análisis de productos de degradación;
- apoyo a la trazabilidad de las mediciones.
Por tanto, la calidad de un resultado analítico no depende únicamente del instrumento de laboratorio. También son importantes la identidad, la pureza, el contenido de péptido, el almacenamiento y la documentación del estándar de referencia utilizado.
Además, un estándar de referencia no es automáticamente lo mismo que una muestra cualquiera con un porcentaje elevado de HPLC. Para el uso cuantitativo, debe quedar claro cuánto péptido real está presente y qué componentes no peptídicos contribuyen a la masa total.
En este artículo explicamos qué son los estándares de referencia de péptidos, en qué se diferencian los estándares primarios de los secundarios y por qué la comparación analítica es importante para un análisis fiable de péptidos.
¿Qué es un estándar de referencia de péptidos?
Un estándar de referencia de péptidos es un material cuidadosamente caracterizado que se utiliza como base de comparación durante el análisis de laboratorio.
Dependiendo del objetivo de la investigación, pueden determinarse propiedades como:
- secuencia de aminoácidos;
- masa molecular;
- identidad;
- Pureza por HPLC;
- contenido de péptido;
- contenido de agua;
- contenido de contraiones;
- presencia de impurezas relevantes;
- estabilidad durante el almacenamiento.
A continuación, el estándar puede utilizarse para comparar analíticamente una muestra desconocida.
La caracterización necesaria depende de la aplicación.
Un estándar para identificación no siempre tiene que cumplir exactamente los mismos requisitos que un estándar para un ensayo cuantitativo.
¿Por qué es necesaria la comparación analítica?
Un instrumento de laboratorio mide una señal física o química.
Algunos ejemplos son:
- absorción UV;
- fluorescencia;
- área del pico cromatográfico;
- relación masa-carga;
- intensidad iónica.
Una señal no equivale automáticamente a una cantidad exacta de péptido.
Para ello se necesita una relación fiable entre:
- cantidad conocida;
- señal medida;
- muestra desconocida.
Un estándar de referencia puede ayudar a establecer esta relación.
Un ejemplo sencillo
Supongamos que un laboratorio quiere determinar la cantidad de un péptido mediante HPLC cuantitativa.
El laboratorio prepara diferentes soluciones a partir de un estándar de referencia caracterizado:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Cada solución se analiza.
Las áreas de los picos medidos se representan frente a las concentraciones conocidas.
De ello se obtiene una curva de calibración.
A continuación, se mide la muestra desconocida.
La concentración puede calcularse comparando la señal de la muestra con la curva de calibración.
La fiabilidad de este cálculo depende, entre otros factores, de:
- calidad del estándar de referencia;
- cálculo correcto de la concentración;
- pesada precisa;
- pipeteado preciso;
- linealidad del método;
- estabilidad de las soluciones.
¿Qué es un estándar de referencia primario?
Un estándar de referencia primario es un material cuyas propiedades relevantes se han determinado exhaustivamente.
El estándar puede caracterizarse mediante varias técnicas analíticas independientes.
Los análisis posibles incluyen:
- HPLC;
- LC-MS;
- análisis de aminoácidos;
- determinación de agua;
- análisis de contraiones;
- RMN;
- análisis elemental;
- balance de masas.
El objetivo es determinar con un alto grado de fiabilidad:
- qué material está presente;
- cuál es su pureza;
- cuánta cantidad del componente deseado está presente;
- qué factores de corrección son necesarios.
Posteriormente, un estándar primario puede utilizarse para cualificar otros estándares.
¿Qué es un estándar de referencia secundario?
Un estándar de referencia secundario también se denomina:
- estándar de trabajo;
- estándar de trabajo;
- estándar de referencia interno.
Este estándar se cualifica mediante comparación con un estándar primario o un estándar de referencia reconocido oficialmente.
Un estándar secundario puede utilizarse para análisis de laboratorio rutinarios.
Las posibles ventajas son:
- mayor disponibilidad;
- menores costes;
- conservación del estándar primario;
- uso rutinario más eficiente.
Sin embargo, el estándar secundario debe comprobarse periódicamente y almacenarse correctamente.
¿Por qué no se utiliza siempre el estándar primario?
Los estándares primarios pueden:
- tener disponibilidad limitada;
- ser costosos;
- suministrarse en pequeñas cantidades;
- estar destinados a métodos analíticos oficiales específicos.
Al cualificar un estándar secundario frente a un estándar primario, pueden realizarse análisis rutinarios sin utilizar continuamente el estándar primario.
La fiabilidad depende de la calidad de la cualificación.
¿Qué significa la cualificación de un estándar de trabajo?
La cualificación significa que las propiedades del estándar de trabajo se investigan sistemáticamente y se comparan con una referencia adecuada.
Un programa de cualificación puede constar de:
- control de identidad;
- Pureza por HPLC;
- ensayo de péptidos;
- contenido de agua;
- contenido de contraiones;
- comparación de cromatogramas;
- comparación de espectros de masas;
- evaluación de la estabilidad.
Las pruebas necesarias dependen del uso previsto.
Identidad frente a cuantificación
Un estándar de referencia puede tener varias funciones analíticas.
Estándar de identidad
Se utiliza un estándar de identidad para investigar si una muestra desconocida coincide con el péptido esperado.
Las posibles comparaciones son:
- Tiempo de retención de HPLC;
- masa molecular;
- perfil espectrométrico de masas;
- propiedades espectroscópicas.
Estándar cuantitativo
Un estándar cuantitativo se utiliza para determinar la cantidad de péptido.
Para ello, el contenido real de péptido debe conocerse con suficiente fiabilidad.
Por lo general, una alta pureza por HPLC por sí sola no es suficiente para ello.
¿Por qué no es suficiente la pureza por HPLC?
Por ejemplo, un péptido puede tener una pureza por HPLC del 99 %.
Eso no significa automáticamente que el 99 % de la masa total esté compuesto por el péptido.
El material también puede contener:
- agua;
- acetato;
- cloruro;
- TFA;
- sales;
- otros componentes no medidos cromatográficamente.
Por lo tanto, para un estándar cuantitativo debe distinguirse entre:
- pureza cromatográfica;
- masa total del material;
- contenido neto de péptido.
¿Qué es el valor asignado?
Un estándar de referencia puede tener un valor asignado.
Este valor describe, por ejemplo:
- contenido de péptido;
- pureza;
- concentración;
- potencia;
- cantidad por envase.
El valor asignado debe basarse en datos analíticos adecuados.
También puede indicarse un factor de corrección.
¿Qué es un factor de corrección?
Se utiliza un factor de corrección para convertir la cantidad de material pesado en la cantidad real de péptido.
Supongamos:
- material pesado: 10,0 mg;
- contenido de péptido asignado: 85 %;
- cantidad real de péptido: 8,5 mg.
Si no se aplica esta corrección, la concentración calculada puede sobreestimarse.
¿Por qué es importante el contenido neto de péptido?
El contenido neto de péptido describe la proporción de péptido real en el material analizado.
En el cálculo pueden tenerse en cuenta factores como:
- humedad residual;
- contraiones;
- componentes orgánicos;
- componentes inorgánicos.
Para el análisis cuantitativo, esto suele ser más relevante que la pureza determinada únicamente por HPLC.
¿Qué función desempeña el análisis de aminoácidos?
El análisis de aminoácidos puede utilizarse para determinar el contenido de péptido.
La cadena peptídica se hidroliza en aminoácidos individuales.
A continuación, se cuantifican los aminoácidos seleccionados.
Cuando se conoce cuántos de estos aminoácidos están presentes en cada cadena peptídica, puede calcularse la cantidad de péptido.
El análisis de aminoácidos puede contribuir así a la asignación del valor de un estándar de referencia.
¿Qué función desempeña la espectrometría de masas?
La espectrometría de masas puede ayudar a confirmar:
- masa molecular;
- identidad;
- determinadas modificaciones;
- productos de degradación.
La LC-MS puede combinar la separación cromatográfica con la detección de masas.
Una masa molecular coincidente respalda la identidad, pero no demuestra por sí sola:
- cantidad exacta de péptido;
- secuencia completa;
- ausencia de todas las impurezas.
Por eso, a menudo se combinan varias técnicas.
¿Qué función desempeña la MS/MS?
En la espectrometría de masas en tándem, se fragmenta un ion peptídico seleccionado.
Los fragmentos pueden proporcionar información sobre la secuencia de aminoácidos.
Por ello, la MS/MS puede proporcionar apoyo adicional para:
- confirmación de la secuencia;
- localización de modificaciones;
- identificación de productos de degradación.
La capacidad analítica depende de:
- tamaño del péptido;
- fragmentación;
- resolución del instrumento;
- procesamiento de datos.
¿Qué función desempeña la HPLC?
La HPLC puede utilizarse para:
- comparación de los tiempos de retención;
- evaluación de la pureza cromatográfica;
- estudio de los picos secundarios;
- ensayo cuantitativo;
- estudio de estabilidad.
Al comparar, la referencia y la muestra deben analizarse con el mismo método controlado.
Los parámetros importantes son:
- tipo de columna;
- fase móvil;
- temperatura;
- caudal;
- longitud de onda de detección.
¿Qué es una curva de calibración?
Una curva de calibración describe la relación entre concentraciones conocidas y las señales medidas del detector.
Una curva de calibración fiable debe evaluarse en función de:
- linealidad;
- intervalo de medición;
- reproducibilidad;
- desviaciones;
- idoneidad para el método analítico.
La concentración desconocida se calcula dentro del intervalo de medición validado.
La extrapolación fuera de este intervalo puede causar incertidumbre adicional.
¿Qué es la linealidad?
La linealidad describe en qué medida la señal medida cambia proporcionalmente con la concentración.
Cuando la concentración se duplica, dentro de un intervalo lineal se espera un cambio correspondiente de la señal.
La relación no tiene por qué ser lineal para todos los métodos en todo el intervalo de concentración.
Por ello, el intervalo de medición relevante se estudia experimentalmente.
¿Qué significa trazabilidad analítica?
La trazabilidad analítica o metrológica describe cómo un resultado de medición está vinculado a una referencia reconocida mediante una cadena documentada de comparaciones.
Los componentes importantes son:
- estándar utilizado;
- certificado;
- valor asignado;
- calibración;
- método analítico;
- incertidumbre de medición;
- documentación.
La trazabilidad favorece la comparabilidad de los resultados entre:
- diferentes días de medición;
- laboratorios;
- instrumentos;
- lotes.
¿Qué es la trazabilidad metrológica?
La metrología es la ciencia de la medición.
La trazabilidad metrológica requiere una cadena de comparación documentada e ininterrumpida con una referencia especificada. Cada etapa contribuye a la incertidumbre total de medición.
Para el análisis de péptidos, la trazabilidad práctica puede depender, entre otros factores, de:
- estándar de referencia;
- contenido de péptido asignado;
- balanza calibrada;
- equipos volumétricos;
- método analítico.
¿Qué es la incertidumbre de medición?
Toda medición analítica contiene incertidumbre.
Las posibles fuentes son:
- incertidumbre del estándar de referencia;
- pesada;
- pipeteo;
- dilución;
- variación del instrumento;
- calibración;
- integración de picos;
- preparación de muestras.
La incertidumbre de medición no significa que un resultado no sea fiable.
Describe el intervalo estimado dentro del cual razonablemente puede encontrarse el valor real.
¿Por qué los estándares deben ser específicos para cada lote?
Los estándares de referencia también se producen en lotes.
Los diferentes lotes pueden diferir en:
- contenido de péptido;
- contenido de agua;
- contenido de contraiones;
- perfil de pureza;
- estabilidad.
Por ello, debe quedar claro qué número de lote del estándar de referencia se utilizó.
¿Qué figura en un certificado de un estándar de referencia?
Un certificado puede contener información sobre:
- nombre;
- número de catálogo;
- número de lote;
- valor asignado;
- uso previsto;
- condiciones de almacenamiento;
- información sobre la validez;
- métodos analíticos;
- factor de corrección.
No todos los certificados contienen la misma información.
El estándar debe utilizarse de acuerdo con las instrucciones correspondientes.
¿Por qué son importantes las condiciones de almacenamiento?
Un estándar de referencia puede cambiar durante el almacenamiento.
Los procesos posibles incluyen:
- oxidación;
- desamidación;
- absorción de humedad;
- agregación;
- degradación.
Por lo tanto, pueden establecerse condiciones para:
- temperatura;
- protección de la luz;
- protección contra la humedad;
- uso después de la apertura;
- duración del almacenamiento.
Un estándar almacenado incorrectamente puede provocar comparaciones erróneas.
¿Qué es una fecha de caducidad?
Algunos estándares de referencia tienen una fecha de caducidad establecida.
Otros estándares utilizan:
- verificación de validez;
- fecha de recualificación;
- estado actual del lote.
El laboratorio debe comprobar que el estándar es adecuado y válido en el momento de su uso.
¿Qué es la recualificación?
La recualificación consiste en volver a evaluar un estándar de referencia.
Los análisis posibles incluyen:
- HPLC;
- LC-MS;
- ensayo de péptidos;
- contenido de agua;
- comparación con un estándar primario.
Puede ser necesaria una recualificación después de:
- periodo de uso predeterminado;
- almacenamiento prolongado;
- cambio de apariencia;
- resultado analítico aberrante.
¿Por qué son importantes los estándares de impurezas?
No solo el péptido deseado puede utilizarse como estándar.
Las impurezas o los productos de degradación conocidos también pueden servir como material de referencia.
Algunos ejemplos son:
- productos de oxidación;
- variantes desamidadas;
- fragmentos;
- secuencias de deleción;
- componentes relacionados con la agregación.
Estos estándares pueden ayudar a identificar y cuantificar picos secundarios.
¿Qué son los estándares de degradación?
Un estándar de degradación representa una variante de degradación conocida.
Se puede utilizar para investigar:
- dónde eluye un producto de degradación;
- qué masa molecular está presente;
- qué tan sensible es el método analítico;
- cuánto producto de degradación está presente.
No todos los productos de degradación están disponibles como estándares puros.
Estándares de referencia y validación de métodos
Un método analítico debe demostrar que es adecuado para el propósito previsto.
ICH Q2(R2) describe los principios para la validación de procedimientos analíticos. Las características pertinentes pueden incluir, entre otras, la especificidad, la exactitud, la precisión, la linealidad y el rango de medición.
Los estándares de referencia pueden utilizarse para investigar:
- exactitud;
- especificidad;
- linealidad;
- rango cuantitativo;
- rendimiento del método.
¿Qué es la exactitud?
La exactitud describe qué tan cerca está un resultado medido de un valor de referencia aceptado.
Se puede utilizar un estándar bien caracterizado para investigar la exactitud de un método analítico.
¿Qué es la precisión?
La precisión describe qué tan cerca están entre sí los resultados de mediciones repetidas.
Un método puede producir resultados muy precisos que, aun así, se desvíen sistemáticamente.
Por lo tanto, tanto la precisión como la exactitud son importantes.
¿Qué es la especificidad?
La especificidad describe si el método analítico puede distinguir suficientemente el componente deseado de otros componentes.
Algunos ejemplos son:
- impurezas;
- productos de degradación;
- componentes de la formulación;
- contraiones.
Un estándar de referencia adecuado puede ayudar a identificar el pico principal.
¿Pueden dos laboratorios obtener resultados diferentes?
Sí.
Las diferencias pueden deberse a:
- estándar de referencia;
- método analítico;
- preparación de la muestra;
- equipo;
- calibración;
- procesamiento de datos;
- incertidumbre de medición.
El uso de estándares bien caracterizados y métodos validados puede mejorar la comparabilidad.
¿Un péptido comercial es automáticamente un estándar de referencia?
No.
Un péptido comercial puede ser adecuado como material de investigación, pero no es automáticamente un estándar de referencia cualificado.
Para utilizarlo como estándar, debe estar claramente definido:
- identidad;
- contenido de péptido;
- pureza;
- contenido de agua;
- contenido de contraiones;
- estabilidad durante el almacenamiento;
- documentación.
Los requisitos dependen del objetivo analítico.
Estándares de referencia farmacopéicos oficiales
Las organizaciones oficiales ponen a disposición estándares de referencia para aplicaciones compendiales específicas.
Algunos ejemplos son:
- Estándares de Referencia de la USP;
- Estándares de Referencia de la Farmacopea Europea;
- Sustancias Químicas Internacionales de Referencia de la OMS.
Estos estándares están destinados a las aplicaciones descritas en los métodos oficiales o la documentación correspondiente.
No existe un estándar farmacopéico oficial para todos los péptidos de investigación.
Limitaciones científicas
Un estándar de referencia mejora la comparabilidad analítica, pero no resuelve todos los desafíos de medición.
La fiabilidad sigue dependiendo de:
- método analítico;
- preparación de la muestra;
- instrumento;
- calibración;
- almacenamiento;
- procesamiento de datos;
- incertidumbre de medición.
Un tiempo de retención coincidente en HPLC no demuestra por sí solo la identidad molecular completa.
Una masa molecular coincidente no demuestra automáticamente:
- secuencia completa correcta;
- cantidad exacta de péptido;
- ausencia de todas las impurezas.
Por lo tanto, se utilizan varias técnicas analíticas complementarias.
Resumen
Un estándar de referencia peptídico es un material bien caracterizado que se utiliza como base de comparación analítica.
Los estándares de referencia pueden utilizarse para:
- identificación;
- comparación por HPLC;
- calibración;
- ensayo de péptidos;
- cuantificación;
- validación del método;
- análisis de impurezas.
Un estándar primario se caracteriza exhaustivamente.
Un estándar secundario o de trabajo se califica frente a una referencia primaria adecuada y puede utilizarse para análisis rutinarios.
Para aplicaciones cuantitativas, la pureza por HPLC por sí sola suele ser insuficiente. También deben evaluarse el contenido de péptido, el agua, los contraiones y otros componentes pertinentes.
La comparación analítica fiable requiere:
- estándar de referencia adecuado;
- asignación correcta de valores;
- trazabilidad del lote;
- almacenamiento controlado;
- método analítico validado;
- evaluación de la incertidumbre de medición.
Fuentes oficiales y referencias científicas
-
ICH Q2(R2) — Validación de procedimientos analíticos
Directriz internacional para la validación de procedimientos analíticos, incluidos la especificidad, la exactitud, la precisión, la linealidad y el intervalo de medición. -
USP — Estándares de referencia oficiales
La USP describe los estándares de referencia como materiales ampliamente caracterizados para, entre otros fines, investigar la identidad, la potencia, la pureza y la calidad. -
Estándares de referencia de la Farmacopea Europea — EDQM
El catálogo de la EDQM contiene estándares de referencia oficialmente válidos para las aplicaciones descritas en la Farmacopea Europea. -
OMS — Sustancias químicas de referencia internacionales
Las sustancias químicas de referencia de la OMS (WHO-ICRS) se establecen mediante procedimientos alineados con las directrices de la OMS para sustancias químicas de referencia. -
NIST — Trazabilidad metrológica
El NIST describe la trazabilidad metrológica como una cadena documentada e ininterrumpida de calibraciones hasta referencias especificadas. -
NIST — Materiales de referencia estándar
El NIST desarrolla y certifica materiales de referencia con una composición o unas propiedades bien caracterizadas para respaldar mediciones fiables y comparables. -
FDA — Procedimientos analíticos y validación de métodos para fármacos y productos biológicos
Las directrices de la FDA abordan el uso y la cualificación de estándares de referencia en la validación de métodos analíticos.
Aviso sobre investigación
Los péptidos de investigación de Peptidera se ofrecen exclusivamente para Research Use Only (RUO) y están destinados a la investigación de laboratorio y a aplicaciones analíticas.
No destinados al consumo humano o animal, al uso diagnóstico, a aplicaciones terapéuticas ni a la autoadministración.
Categoría:
Conocimientos sobre péptidos y control de calidad
Productos relacionados de Peptidera:
Péptidos de investigación con identificación del lote y datos analíticos de calidad independientes disponibles
Blogs internos relacionados:
- PB-0230 — Pureza de los péptidos y HPLC
- PB-0231 — Espectrometría de masas en péptidos
- PB-0233 — Ensayo de péptidos: pureza frente a contenido de péptidos
- PB-0238 — Contraiones en péptidos
- PB-0239 — Análisis de aminoácidos en péptidos
- PB-0241 — Cadena de custodia en el análisis de péptidos
Propuestas de enlaces internos:
- Enlace a PB-0230 sobre el tiempo de retención mediante HPLC y la comparación cromatográfica
- Enlace a PB-0231 sobre LC-MS, masa molecular y MS/MS
- Enlace a PB-0233 sobre ensayos cuantitativos de péptidos
- Enlace a PB-0238 sobre contraiones y contenido neto de péptidos
- Enlace a PB-0239 sobre el análisis de aminoácidos y la asignación de valores
- Enlace a PB-0241 sobre la trazabilidad de estándares y muestras
- Enlace a la página de Peptidera con certificados de análisis independientes
- Enlace a la colección de péptidos de investigación