Pureza del péptido: ¿qué significa 99% HPLC?
Pureza del péptido explicada: ¿qué indica realmente un porcentaje de HPLC?
En los péptidos de investigación, a menudo se indica un porcentaje de pureza. Valores como 98%, 99% o 99,5% de pureza se utilizan habitualmente para describir la calidad de un péptido.
Un porcentaje elevado parece fácil de interpretar: cuanto mayor sea el número, mejor será el producto. En la práctica, la pureza del péptido es más compleja.
Un resultado de HPLC proporciona información sobre la composición relativa de una muestra analizada. Sin embargo, el porcentaje no demuestra automáticamente:
- que esté presente el péptido correcto;
- que la secuencia de aminoácidos sea completamente correcta;
- que la cantidad indicada de péptido en el vial sea correcta;
- que el material sea estéril;
- que esté libre de endotoxinas;
- que se hayan medido todas las posibles impurezas.
Para evaluar cuidadosamente la calidad de un péptido, es necesario analizar conjuntamente varios datos analíticos.
En este blog explicamos cómo se mide la pureza del péptido, qué significa un porcentaje de HPLC y por qué la pureza es solo un componente del control de calidad integral.
¿Qué significa la pureza del péptido?
La pureza del péptido describe qué proporción de los componentes relacionados con el péptido detectados corresponde al componente principal de la muestra analizada.
Cuando un certificado de análisis indica, por ejemplo, una pureza por HPLC de 99% indica, normalmente, que aproximadamente el 99 % de la señal cromatográfica integrada se ha asignado al pico principal.
Esto no significa automáticamente que el 99 % del peso total del vial corresponda al péptido deseado.
Un vial puede contener, además del péptido, otros componentes, como:
- agua;
- contraiones;
- sales;
- excipientes;
- residuos del proceso de producción;
- componentes no detectables.
Por lo tanto, el porcentaje de HPLC y la cantidad real de péptido son parámetros de calidad diferentes.
¿Qué es la HPLC?
HPLC significa cromatografía líquida de alta resolución.
Es una técnica analítica que permite separar entre sí diferentes componentes químicos de una muestra.
Durante un análisis de HPLC, una muestra disuelta se hace pasar por una columna. Esta columna contiene una fase estacionaria.
El líquido que fluye por la columna se denomina fase móvil.
Las distintas moléculas no reaccionan todas de la misma manera con estas fases. Por ello, algunos componentes se desplazan por la columna más rápidamente que otros.
El resultado se muestra en un cromatograma.
Un cromatograma suele constar de:
- un eje horizontal de tiempo;
- un eje vertical de señal;
- uno o varios picos.
Cada pico representa un componente o grupo de componentes detectado.
¿Qué es un tiempo de retención?
El tiempo que necesita un componente para desplazarse por la columna de HPLC y llegar al detector se denomina tiempo de retención.
El tiempo de retención puede verse afectado por:
- tipo de columna de HPLC;
- composición de la fase móvil;
- temperatura;
- velocidad de flujo;
- propiedades del péptido;
- método analítico utilizado.
Un tiempo de retención coincidente puede ayudar a compararlo con un estándar de referencia.
Sin embargo, por lo general, el tiempo de retención por sí solo no basta para confirmar definitivamente la identidad de un péptido.
En determinadas condiciones, diferentes moléculas pueden tener tiempos de retención similares.
Por eso, la HPLC suele combinarse con la espectrometría de masas.
¿Cómo se calcula el porcentaje de pureza?
En muchos análisis de HPLC, se calcula el área bajo cada pico cromatográfico.
Esto se denomina integración del área de los picos.
Un ejemplo simplificado:
- pico principal: 99%;
- pico secundario A: 0,5%;
- pico secundario B: 0,3%;
- otras picos detectados: 0,2%.
La pureza cromatográfica informada es entonces de aproximadamente el 99%.
Este cálculo depende de:
- método de detección;
- ajustes de integración;
- longitud de onda seleccionada;
- método analítico;
- límite de detección;
- concentración de la muestra.
Por lo tanto, el porcentaje de pureza siempre debe interpretarse en el contexto del método utilizado.
¿Qué significa pico principal?
El pico más grande de un cromatograma suele denominarse pico principal.
En un péptido bien caracterizado, se espera que este pico corresponda al péptido deseado.
Sin embargo, esto debe confirmarse analíticamente.
Un pico grande no demuestra por sí solo que esté presente la estructura molecular correcta.
Para respaldar la identidad, pueden utilizarse técnicas adicionales, como:
- espectrometría de masas;
- análisis de aminoácidos;
- análisis de secuencia;
- resonancia magnética nuclear;
- comparación con un estándar de referencia.
La HPLC describe principalmente la composición cromatográfica de la muestra.
¿Qué impurezas pueden surgir durante la síntesis de péptidos?
Muchos péptidos sintéticos se producen mediante síntesis de péptidos en fase sólida, normalmente abreviada como SPPS.
Durante este proceso, los aminoácidos se acoplan gradualmente a una cadena peptídica en crecimiento.
En cada etapa pueden producirse pequeñas desviaciones del proceso.
Las posibles impurezas relacionadas con los péptidos son:
Cadenas peptídicas truncadas
Cuando un aminoácido no se acopla correctamente, puede formarse una cadena peptídica incompleta.
También se denomina producto de truncamiento.
Secuencias de deleción
En una secuencia de deleción faltan uno o más aminoácidos de la cadena prevista.
Por ello, la masa molecular difiere de la del péptido deseado.
Variantes modificadas químicamente
Durante la producción, purificación o almacenamiento pueden producirse cambios químicos.
Algunos ejemplos son:
- oxidación;
- desamidación;
- hidrólisis;
- isomerización.
Residuos de grupos protectores
Durante la síntesis de péptidos se utilizan grupos protectores temporales para evitar reacciones no deseadas.
Estos deben eliminarse posteriormente.
La eliminación incompleta puede contribuir a la presencia de componentes secundarios.
Agregados
Las moléculas peptídicas pueden formar estructuras más grandes en determinadas condiciones.
No todos los métodos de HPLC detectan o caracterizan la agregación de la misma manera.
¿Una pureza por HPLC del 99 % equivale a un contenido de péptido del 99 %?
No.
Esta es una distinción importante.
La pureza por HPLC suele describir la proporción relativa de los componentes cromatográficos detectados.
El contenido de péptido describe cuánto péptido real está presente en relación con el material total.
Por ejemplo, un vial liofilizado puede contener:
- el péptido deseado;
- agua;
- contraiones;
- sales;
- excipientes.
Estos componentes no se miden necesariamente todos de la misma manera durante un análisis de HPLC estándar.
Por lo tanto, una muestra puede presentar una alta pureza cromatográfica, aunque el contenido total de péptido sea inferior al porcentaje de HPLC.
Para la determinación cuantitativa se necesitan métodos analíticos adicionales.
¿Qué es un ensayo de péptidos?
Un ensayo se utiliza para determinar la cantidad o concentración de un componente específico.
Dependiendo del objetivo del estudio, pueden utilizarse distintos métodos.
Algunos ejemplos son:
- HPLC cuantitativa con un estándar de referencia;
- análisis de aminoácidos;
- análisis de nitrógeno;
- técnicas espectroscópicas;
- cálculos de balance de masas.
Un ensayo responde a una pregunta diferente de la de un análisis de pureza estándar.
El análisis de pureza plantea:
¿Qué proporción de los componentes peptídicos detectados pertenece al pico principal?
Un ensayo cuantitativo requiere:
¿Cuánto del péptido deseado está realmente presente?
Ambos datos pueden ser relevantes para una caracterización completa de la calidad.
¿Por qué es importante la espectrometría de masas?
La espectrometría de masas, a menudo abreviada como MS, mide la relación masa-carga de las moléculas ionizadas.
En el análisis de péptidos, se puede comprobar si la masa molecular medida coincide con la masa teórica esperada.
La espectrometría de masas puede contribuir a:
- confirmación de identidad;
- detección de determinadas modificaciones;
- análisis de productos de degradación;
- comparación de variantes peptídicas.
Cuando la masa medida coincide con la masa esperada, esto respalda la identificación.
Sin embargo, la espectrometría de masas no proporciona automáticamente información completa sobre:
- porcentaje de pureza;
- cantidad exacta;
- esterilidad;
- endotoxinas;
- actividad biológica.
Por ello, la HPLC y la espectrometría de masas se complementan.
¿Qué es la LC-MS?
La LC-MS combina la cromatografía líquida con la espectrometría de masas.
Primero, los componentes se separan cromatográficamente. Después, las señales individuales se examinan más a fondo mediante espectrometría de masas.
Esta combinación puede proporcionar información sobre:
- tiempo de retención;
- masa molecular;
- posibles impurezas;
- productos de degradación;
- modificaciones químicas.
Por ello, la LC-MS puede proporcionar más información analítica que una sola técnica independiente.
La calidad de los resultados sigue dependiendo de:
- preparación de la muestra;
- ajustes del instrumento;
- validación del método;
- materiales de referencia;
- interpretación experta.
¿Por qué pueden obtenerse resultados diferentes en distintos laboratorios?
El mismo péptido puede producir resultados ligeramente diferentes en distintos laboratorios.
Entre las posibles causas se encuentran:
- diferentes columnas de HPLC;
- otras fases móviles;
- gradientes diferentes;
- otras longitudes de onda de detección;
- diferencias en la preparación de la muestra;
- otros ajustes de integración;
- variación del instrumento.
Una diferencia no significa automáticamente que uno de los análisis sea incorrecto.
Para comparar correctamente los resultados, también debe examinarse el método analítico.
Un porcentaje sin información sobre el método proporciona un contexto limitado.
¿Qué es la validación del método?
Un método analítico debe demostrar que es adecuado para el propósito previsto.
Esto se denomina validación del método.
Entre las posibles características de validación se encuentran:
- especificidad;
- exactitud;
- precisión;
- linealidad;
- intervalo de medición;
- límite de detección;
- límite de cuantificación;
- robustez.
Un método para la identificación no tiene por qué ser automáticamente adecuado para una cuantificación exacta.
Por lo tanto, debe estar claro de antemano qué cuestión analítica se está investigando.
¿Qué es el límite de detección?
Cada método analítico tiene un límite por debajo del cual un componente no puede detectarse de forma fiable.
Esto se denomina límite de detección.
Por lo tanto, que un componente no sea visible en un cromatograma no significa automáticamente que esté completamente ausente.
La concentración puede ser inferior al límite de detección.
Además, ciertas sustancias pueden:
- no respondan al detector utilizado;
- queden fuera del intervalo de medición;
- se pierdan durante la preparación de la muestra;
- no se separen suficientemente.
Por lo tanto, la afirmación «no detectado» no siempre equivale a «no presente».
¿Se puede manipular un cromatograma?
Un cromatograma debe contener información suficiente para poder evaluarse profesionalmente.
Los datos importantes son:
- nombre del producto;
- número de lote;
- fecha del análisis;
- método utilizado;
- configuración del detector;
- tiempos de retención;
- integración de picos;
- datos del laboratorio.
Una imagen con un solo pico grande y un porcentaje ofrece una verificabilidad limitada.
Además, la configuración de integración puede influir en las señales que se incluyen en el cálculo.
Por lo tanto, la presentación transparente de informes es importante.
¿Qué información debe incluir un COA fiable?
Un certificado de análisis puede incluir, entre otros:
- nombre del péptido;
- secuencia de aminoácidos;
- número de lote;
- fecha de producción;
- fecha de la prueba;
- resultado de HPLC;
- cromatograma;
- resultado espectrométrico de masas;
- masa molecular teórica;
- masa molecular medida;
- métodos analíticos utilizados;
- nombre del laboratorio.
No todos los COA contienen todos los elementos.
La información necesaria depende del producto y del objetivo de la investigación.
Un COA detallado puede ofrecer mayor transparencia, pero su fiabilidad también depende de la calidad del análisis.
¿Es siempre necesaria una pureza elevada?
La pureza deseada depende del objetivo de la investigación.
En algunas aplicaciones analíticas, cantidades muy pequeñas de componentes secundarios pueden influir en:
- resultados de medición;
- investigación de receptores;
- investigación celular;
- reproducibilidad.
En ese caso, puede ser conveniente un nivel de pureza más alto.
Sin embargo, un porcentaje más alto no significa automáticamente que todas las demás características de calidad sean mejores.
Por ejemplo, un péptido con una pureza HPLC del 99,5 % aún puede:
- contener una cantidad diferente;
- haberse almacenado incorrectamente;
- no estar identificados adecuadamente;
- contener un nivel elevado de humedad residual;
- tener un envase dañado.
Por lo tanto, la calidad debe evaluarse de forma multidimensional.
Pureza y diferencias entre lotes
Cada lote de producción tiene su propio proceso de producción y análisis.
Por lo tanto, los resultados de pureza pueden variar entre lotes.
El análisis de un solo lote no debe utilizarse automáticamente como prueba para todos los lotes futuros.
El análisis específico del lote respalda:
- trazabilidad;
- comparación;
- control de calidad;
- investigación de desviaciones.
Por lo tanto, el número de lote del vial debe coincidir con el número del certificado de análisis.
Pureza y estabilidad
Una pureza inicial elevada no garantiza que esta se mantenga durante un almacenamiento prolongado.
Los posibles procesos de degradación son:
- oxidación;
- hidrólisis;
- desamidación;
- agregación.
La velocidad se ve afectada por:
- temperatura;
- humedad;
- luz;
- oxígeno;
- secuencia de aminoácidos;
- envase.
Los estudios de estabilidad pueden utilizarse para seguir los cambios en el perfil cromatográfico a lo largo del tiempo.
Limitaciones científicas
Ningún método analítico ofrece por sí solo una visión completa de la calidad del péptido.
La HPLC puede proporcionar información importante sobre la pureza cromatográfica, pero tiene limitaciones.
Un porcentaje de HPLC no demuestra automáticamente:
- identidad;
- cantidad exacta de péptido;
- secuencia de aminoácidos;
- esterilidad;
- contenido de endotoxinas;
- actividad biológica;
- estabilidad a largo plazo.
Por eso se combinan varios métodos analíticos.
Una evaluación completa de la calidad puede incluir:
- HPLC;
- espectrometría de masas;
- ensayo cuantitativo;
- análisis de humedad;
- estudios de estabilidad;
- pruebas adicionales específicas del producto.
Resumen
La pureza del péptido es un parámetro de calidad importante, pero un porcentaje de HPLC debe interpretarse correctamente.
Un valor del 99 % suele significar que aproximadamente el 99 % de la señal cromatográfica integrada se ha asignado al pico principal.
No significa automáticamente que:
- el 99 % del peso del vial está compuesto por péptido;
- la identidad se ha confirmado por completo;
- la cantidad especificada es correcta;
- el material es estéril;
- se han excluido todos los posibles contaminantes.
Para una evaluación más amplia de la calidad, los resultados de HPLC deben combinarse con otros datos, como:
- espectrometría de masas;
- información del lote;
- análisis cuantitativo;
- datos de almacenamiento;
- estudios de estabilidad.
Por tanto, la calidad de un péptido consta de más de un porcentaje.
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