Aminohappoanalyysi peptideillä selitettynä
Peptidien aminohappoanalyysi: koostumus ja kvantifiointi selitettynä
Peptidit koostuvat aminohappoketjuista. Näiden aminohappojen järjestys määrittää suuren osan peptidin kemiallisista ja rakenteellisista ominaisuuksista.
Laadunvalvonnassa käytetään usein HPLC:n ja massaspektrometrian kaltaisia tekniikoita puhtauden ja molekyylimassan arviointiin. Täydentävä analyysimenetelmä on aminohappoanalyysi, josta käytetään usein lyhennettä AAA.
Aminohappoanalyysiä voidaan käyttää seuraavien asioiden tutkimiseen:
- mitä aminohappoja näytteessä on;
- miten mitatut aminohapposuhteet vastaavat odotettua koostumusta;
- kuinka paljon peptidiä on läsnä;
- sopiiko aminohappokoostumus teoreettiseen peptidiin;
- miten peptidin nettomäärä voidaan laskea.
Menetelmä toimii eri tavalla kuin HPLC ja massaspektrometria. Klassisessa aminohappoanalyysissä peptidiketju hajotetaan ensin yksittäisiksi aminohapoiksi. Sen jälkeen aminohapot erotellaan, havaitaan ja kvantifioidaan.
Aminohappoanalyysi voi antaa arvokasta tietoa, mutta sillä on myös rajoituksia. Hajotuksen aikana jotkin aminohapot voivat muuttua osittain tai hävitä. Siksi tuloksia on aina tulkittava käytetyn menetelmän kontekstissa.
Mitä aminohappoanalyysi on?
Aminohappoanalyysi on laboratoriotekniikka, jolla tutkitaan näytteen aminohappokoostumusta.
Klassisessa analyysissä suoritetaan yleensä seuraavat vaiheet:
- näytteen valmistelu;
- peptidiketjun hydrolyysi;
- yksittäisten aminohappojen vapauttaminen;
- aminohappojen erottelu;
- havaitseminen ja kvantifiointi;
- vertailu odotettuun koostumukseen.
Tulos voidaan esittää seuraavilla tavoilla:
- aminohapon määrä;
- moolisuhde;
- massapitoisuus;
- aminohappoprofiili;
- laskettu peptidipitoisuus.
Mitä hydrolyysi on?
Hydrolyysi on kemiallinen prosessi, jossa sidokset katkaistaan veden avulla.
Aminohappoanalyysissä peptidisidokset hajotetaan, jolloin yksittäiset aminohapot vapautuvat.
Yksi yleisesti käytetty menetelmä on happohydrolyysi.
Tällöin näyte altistetaan valvotun ajanjakson ajan seuraaville tekijöille:
- vahva happo;
- kohotettu lämpötila;
- valvotuissa olosuhteissa.
Hydrolyysin jälkeen alkuperäistä peptidiketjua ei enää ole ehjänä molekyylinä.
Vapautuneet aminohapot voidaan sen jälkeen tutkia yksittäin.
Miksi peptidiketju hajotetaan?
Ehjä peptidi voi sisältää kymmeniä erilaisia aminohappotähteitä.
Hajottamalla ketjun voidaan mitata kunkin aminohapon kokonaismäärä.
Oletetaan, että teoreettinen peptidi sisältää:
- neljä alaniinitähdettä;
- kaksi glysiinitähdettä;
- kolme leusiinitähdettä;
- yksi tyrosiinitähde.
Hydrolyysin jälkeen voidaan tutkia, vastaavatko mitatut suhteet suunnilleen tätä teoreettista koostumusta.
Tämä tukee aminohappokoostumuksen arviointia.
Mikä on ero aminohappokoostumuksen ja aminohappojärjestyksen välillä?
Aminohappoanalyysillä mitataan ennen kaikkea mitä aminohappoja on läsnä ja kuinka paljon niitä on.
Menetelmä ei määritä automaattisesti tarkkaa järjestystä.
Kahdella eri peptidillä voi olla sama aminohappokoostumus mutta erilainen järjestys.
Esimerkiksi:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Molemmat sisältävät:
- yksi alaniini;
- yksi glysiini;
- yksi leusiini.
Silti sekvenssi on erilainen.
Sekvenssin tutkimiseen tarvitaan muita tekniikoita, kuten:
- tandem-massaspektrometria;
- fragmenttianalyysi;
- erityisiä sekvensointimenetelmiä.
Voiko aminohappoanalyysi vahvistaa identiteetin?
Aminohappoanalyysi voi tukea odotetun koostumuksen arviointia.
Kun mitattu aminohappoprofiili poikkeaa merkittävästi teoreettisesta koostumuksesta, se voi olla peruste lisätutkimuksille.
Vastaava profiili ei kuitenkaan yksinään todista, että tarkka aminohappojärjestys on oikea.
Laajempaa identiteetin arviointia varten voidaan yhdistää:
- molekyylimassa;
- LC-MS;
- MS/MS;
- aminohappoanalyysi;
- kromatografiset tiedot.
Miten aminohapot erotetaan?
Hydrolyysin jälkeen näyte sisältää vapaiden aminohappojen seoksen.
Ne on erotettava toisistaan analyyttisesti.
Mahdollisia tekniikoita ovat:
- ioninvaihtokromatografia;
- HPLC;
- UPLC;
- kapillaarielektroforeesi.
Valittu tekniikka riippuu seuraavista tekijöistä:
- haluttu herkkyys;
- laboratoriomenetelmä;
- näytetyyppi;
- tarvittava tarkkuus.
Mitä derivatisointi on?
Monilla aminohapoilla on ilman lisäkäsittelyä rajallinen havaittavuus.
Siksi ne voidaan sitoa kemiallisesti havaittavaan ryhmään.
Tätä kutsutaan derivatisoinniksi.
Derivatisointi voi tapahtua:
- ennen kromatografista erottelua;
- kromatografisen erottelun jälkeen.
Muodostuneet johdokset voidaan mitata paremmin esimerkiksi seuraavilla menetelmillä:
- UV-detektio;
- fluoresenssidetektio;
- massaspektrometria.
Esikolonniderivatisointi
Esikolonniderivatisoinnissa aminohapot leimataan ennen kromatografista erottelua.
Tämän jälkeen muodostuneet johdokset erotetaan kolonnissa.
Mahdollisia etuja ovat:
- suuri herkkyys;
- sopiva fluoresenssidetektio;
- useiden aminohapon analyysi.
Reaktion on tapahduttava toistettavasti.
Epätäydellinen derivatisointi voi vaikuttaa kvantifiointiin.
Kolonnin jälkeinen derivatisointi
Kolonnin jälkeisessä derivatisoinnissa aminohapot erotetaan ensin.
Kolonnin jälkeen ne reagoivat detektioreagenssin kanssa.
Tunnettu esimerkki on ninhydriinianalyysi.
Muodostuneet reaktiotuotteet voidaan sen jälkeen mitata optisesti.
Miten aminohapon määrä määritetään?
Kvantifioinnissa käytetään vertailustandardeja.
Standardiliuokset sisältävät tunnettuja määriä aminohappoja.
Ne mitataan seuraavien välisen suhteen määrittämiseksi:
- pitoisuus;
- detektorisignaali.
Sen jälkeen mitataan tuntematon näyte.
Kalibrointitietojen avulla voidaan laskea kunkin aminohapon määrä.
Mikä on sisäinen standardi?
Sisäinen standardi on tunnettu aine, jota lisätään näytteisiin ja kalibrointiliuoksiin.
Se voi auttaa korjaamaan vaihtelua seuraavien vaiheiden aikana:
- näytteen valmistelu;
- injektio;
- derivatisointi;
- analyysi.
Sisäisen standardin on oltava analyyttisesti hyvin erotettavissa tutkittavista aminohapoista.
Miten aminohappoanalyysillä voidaan määrittää peptidipitoisuus?
Kun peptidin aminohappokoostumus tunnetaan, valittuja aminohappoja voidaan käyttää peptidin määrän laskemiseen.
Oletetaan, että jokainen peptidiketju sisältää täsmälleen neljä alaniiniresidua.
Kun alaniinin kokonaismäärä mitataan, sen perusteella voidaan arvioida peptidiketjujen määrä.
Laskennassa otetaan huomioon:
- residujen määrä peptidiä kohti;
- molekyylimassa;
- mitattu aminohappomäärä;
- analyysimenetelmä.
Tätä voidaan käyttää kvantitatiiviseen peptidimääritykseen.
Miksi kaikkia aminohappoja ei aina käytetä?
Kaikki aminohapot eivät sovellu yhtä hyvin kvantifiointiin.
Jotkin aminohapot voivat hydrolyysin aikana:
- hajota osittain;
- muuttua kemiallisesti;
- vapautua epätäydellisesti;
- vaikeasti luotettavasti mitattavissa.
Siksi usein valitaan stabiileja aminohappoja.
Valinta riippuu peptidisekvenssistä ja analyysimenetelmästä.
Mitkä aminohapot voivat muuttua hydrolyysin aikana?
Happohydrolyysillä voi olla erilaisia vaikutuksia.
Tryptofaani
Tryptofaani voi hajota suuressa määrin tavanomaisen happohydrolyysin aikana.
Siksi tarvitaan mukautettuja menetelmiä, kun tryptofaani on mitattava spesifisesti.
Asparagiini
Asparagiini voi muuttua hydrolyysin aikana aspartaatiksi.
Siksi asparagiinia ja aspartaattia ei klassisessa analyysissä aina ilmoiteta erikseen.
Glutamiini
Glutamiini voidaan muuttaa glutamaatiksi.
Näin glutamiini ja glutamaatti voidaan esittää yhdessä.
Seriini
Seriini voi hävitä osittain pitkäkestoisen hydrolyysin aikana.
Treoniini
Myös treoniini voi hajota osittain.
Kysteiini
Kysteiini voi hapettua.
Luotettavaa analyysiä varten voidaan tarvita esihapetus tai mukautettu menetelmä.
Miksi hydrolyysiaika on tärkeä?
Peptidisidosten on hajottava riittävästi.
Liian lyhyt hydrolyysi voi johtaa seuraavaan:
- epätäydellinen hajoaminen;
- mitattujen aminohappoarvojen jääminen liian pieniksi.
Liian pitkä hydrolyysi voi johtaa seuraavaan:
- herkkien aminohappojen jatkuva hajoaminen;
- mittaushäviö.
Siksi hydrolyysiaikaa ja lämpötilaa valvotaan.
Joskus käytetään useita hydrolyysiaikoja häviön tai epätäydellisen hajoamisen tutkimiseen.
Mikä on moolisuhde?
Moolisuhde kuvaa aminohappojen suhteellisia määriä.
Oletetaan, että peptidi sisältää teoreettisesti:
- kaksi alaniinia;
- yksi glysiini;
- kolme leusiinia.
Teoreettinen moolisuhde on:
2 : 1 : 3
Analyysin jälkeen mitatut arvot voidaan normalisoida.
Kun suhde on lähellä teoreettista arvoa, tämä tukee odotettua aminohappokoostumusta.
Pieniä poikkeamia voi syntyä seuraavista syistä:
- mittausepävarmuus;
- hydrolyysihäviö;
- derivatisointi;
- kromatografisten huippujen integrointi.
Mitä normalisointi tarkoittaa?
Normalisoinnissa mitatut aminohappoarvot muunnetaan suhteellisiksi suhteiksi.
Sopivaa aminohappoa voidaan käyttää vertailukohtana.
Näin mitattua profiilia voidaan verrata teoreettiseen koostumukseen.
Normalisointi on hyödyllistä koostumuksen tutkimisessa, mutta se ei automaattisesti ilmoita peptidin absoluuttista määrää.
Aminohappoanalyysi verrattuna HPLC-puhtauteen
HPLC-puhtaus ja aminohappoanalyysi mittaavat eri ominaisuuksia.
HPLC-puhtaudessa tutkitaan yleensä:
- kromatografinen päähuippu;
- sivuhuippujen suhteellinen määrä.
Aminohappoanalyysissä tutkitaan:
- aminohappokoostumus;
- valittujen aminohappojen määrä;
- mahdollinen peptidien kvantifiointi.
Korkea HPLC-puhtaus ei automaattisesti todista, että aminohappokoostumus on oikea.
Sopiva aminohappokoostumus ei automaattisesti todista, ettei peptidiin liittyviä epäpuhtauksia ole läsnä.
Tekniikat täydentävät toisiaan.
Aminohappoanalyysi verrattuna massaspektrometriaan
Massaspektrometriassa tutkitaan molekyylien massa-varaussuhdetta.
Ehjän molekyylin massaspektrometrinen mittaus voi tukea sitä, että molekyylimassa vastaa teoreettista arvoa.
Aminohappoanalyysissä tutkitaan aminohappojen määrää ja suhdetta hajoamisen jälkeen.
Molemmilla tekniikoilla on erilaiset vahvuutensa.
Yhdistelmä voi antaa enemmän tietoa seuraavista:
- identiteet;
- koostumus;
- peptidipitoisuus.
Aminohappoanalyysi verrattuna peptidimääritykseen
Aminohappoanalyysiä voidaan käyttää määritysmenetelmänä.
Peptidimääritys kuvaa tavoitteen:
määrittää peptidin määrä.
Aminohappoanalyysi on yksi tekniikoista, joilla tämä tavoite voidaan saavuttaa.
Muita mahdollisia määritysmenetelmiä ovat:
- kvantitatiivinen HPLC;
- UV-spektrofotometria;
- LC-MS-kvantifiointi;
- massatase.
Mikä vaikutus vastaioneilla on?
Vastaioneja ovat esimerkiksi:
- asetaatti;
- kloridi;
- TFA;
vaikuttavat pakastekuivatun materiaalin kokonaismassaan.
Aminohappoanalyysissä tutkitaan pääasiassa peptidin aminohappokomponentteja.
Näin menetelmä voi auttaa erottamaan toisistaan:
- materiaalin kokonaismassa;
- todellinen peptidimäärä.
Täydellistä massatasetta varten voidaan tarvita lisäanalyysejä.
Mikä vaikutus jäännöskosteudella on?
Jäännöskosteus lisää kokonaispainoa, mutta ei aminohappokoostumusta.
Kun peptidin nettomäärä lasketaan, kosteusanalyysi voi antaa lisätietoa.
Laaja massatase voi sisältää seuraavat:
- peptidipitoisuus;
- vesipitoisuus;
- vastaionipitoisuus;
- muut komponentit.
Voidaanko aminohappoanalyysillä osoittaa epäpuhtauksia?
Jotkin poikkeavat aminohapposignaalit voivat viitata odottamattomiin komponentteihin.
Menetelmää ei kuitenkaan ole suunniteltu havaitsemaan kaikkia mahdollisia epäpuhtauksia.
Muita tekniikoita voidaan tarvita seuraavien määrittämiseen:
- orgaaniset epäpuhtaudet;
- jäännösliuottimet;
- metallit;
- mikrobiologinen kontaminaatio;
- endotoksiinit.
Mitä COA-todistuksessa voi olla?
Analyysitodistus voi sisältää esimerkiksi seuraavia tietoja:
- testi: aminohappoanalyysi;
- analyysimenetelmä;
- mitatut aminohapposuhteet;
- teoreettiset suhteet;
- laskennallinen peptidipitoisuus;
- testauspäivä;
- eränumero.
Kaikki COA-todistukset eivät sisällä aminohappoanalyysiä.
Jos on suoritettu ainoastaan HPLC ja MS, niiden perusteella ei voida määrittää aminohappojen kokonaismäärää.
Miksi eräyhteys on tärkeä?
Aminohappoanalyysi on yhdistettävä tutkittuun erään.
Tärkeitä tietoja ovat:
- eränumero;
- tuotteen nimi;
- analyysipäivä;
- laboratorio;
- analyysimenetelmä.
Analyysiraportti, josta puuttuu selkeä eräyhteys, on jäljitettävyyden kannalta vähemmän arvokas.
Mitä mittausepävarmuus tarkoittaa?
Jokaiseen kvantitatiiviseen analyysiin liittyy mittausepävarmuutta.
Aminohappoanalyysissä vaihtelun lähteitä voivat olla:
- näytteen valmistelu;
- hydrolyysi;
- aminohappohävikki;
- derivatisointi;
- kalibrointi;
- kromatografinen erotus;
- piikkien integrointi.
Siksi tuloksia ei pidä pitää ehdottoman virheettöminä.
Miksi menetelmän validointi on tärkeää?
Menetelmän on sovelluttava aiottuun tarkoitukseen.
Kvantitatiivisen aminohappoanalyysin olennaisia validointiominaisuuksia voivat olla:
- oikeellisuus;
- tarkkuus;
- lineaarisuus;
- spesifisyys;
- mittausalue;
- robustius;
- toistettavuus.
Menetelmä, joka soveltuu laadulliseen aminohappoprofiiliin, ei automaattisesti riitä peptidin täsmälliseen kvantifiointiin.
Tieteelliset rajoitukset
Aminohappoanalyysillä on merkittäviä rajoituksia.
Menetelmällä ei voida itsenäisesti määrittää:
- tarkka aminohapposekvenssi;
- molekyylimassa;
- HPLC-puhtaus;
- kolmiulotteinen rakenne;
- biologinen aktiivisuus;
- steriiliys;
- endotoksiinipitoisuus.
Lisäksi jotkin aminohapot voivat muuttua hydrolyysin aikana.
Kattavaa laadunarviointia varten on yhdistettävä useita analyysimenetelmiä.
Yhteenveto
Aminohappoanalyysissä tutkitaan peptidin aminohappojen koostumusta ja määrää.
Klassisessa analyysissä peptidiketju hajotetaan ensin hydrolyysillä.
Sen jälkeen aminohapot:
- erottaa;
- havaita;
- kvantifioida;
- verrattuna teoreettiseen koostumukseen.
Aminohappoanalyysiä voidaan käyttää seuraaviin:
- aminohappokoostumuksen valvonta;
- moolisuhteiden arviointi;
- peptidipitoisuuden kvantifiointi;
- identiteetin varmistaminen.
Menetelmällä on rajoituksia, koska tietyt aminohapot voivat muuttua hydrolyysin aikana.
Siksi aminohappoanalyysi yhdistetään mieluiten seuraaviin:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- peptidimääritys;
- jäännöskosteusanalyysi;
- vastaionianalyysi.
Tutkimuskäyttöä koskeva vastuuvapauslauseke
Peptideran tutkimuspeptidejä tarjotaan ainoastaan Research Use Only (RUO) -käyttöön, ja ne on tarkoitettu laboratoriotutkimukseen ja analyyttisiin sovelluksiin.
Ei tarkoitettu ihmisille tai eläimille nautittavaksi, diagnostiseen käyttöön, terapeuttiseen käyttöön tai itse annosteltavaksi.
Peptiditietous & laadunvalvonta
Aiheeseen liittyvät Peptidera-tuotteet:
Pakastekuivatut tutkimuspeptidit, joissa on erätunnisteet ja saatavilla olevat analyyttiset laatutiedot
Aiheeseen liittyvät sisäiset blogit:
- PB-0230 — Peptidipuhtaus ja HPLC
- PB-0231 — Peptidien massaspektrometria
- PB-0233 — Peptidimääritys: puhtaus verrattuna peptidipitoisuuteen
- PB-0234 — Pakastekuivattujen peptidien jäännöskosteus
- PB-0238 — Peptidien vastaionit
Sisäiset linkkiehdotukset:
- Linkki PB-0233-sivulle aminohappoanalyysistä peptidimäärityksenä
- Linkki PB-0230-sivulle erosta HPLC-puhtauteen
- Linkki PB-0231-sivulle molekyylimassasta ja sekvenssianalyysistä
- Linkki PB-0234-sivulle jäännöskosteudesta ja peptidin nettomäärästä
- Linkki PB-0238-sivulle vastaioneista ja massataseesta
- Linkki Peptidera-sivulle, jolla on analyysitodistukset
- Linkki tutkimuspeptidikokoelmaan