Massaspektrometria peptidien analysoinnissa selitettynä

Massaspektrometria peptideissä: miten molekyyli-identiteettiä tutkitaan?

Tutkimuspeptidien laadunvalvonnassa yhdistetään usein useita analyysitekniikoita. HPLC voi antaa tietoa kromatografisesta puhtaudesta, mutta suuri pääpiikki ei automaattisesti todista, että kyseessä on oikea peptidi.

Molekyyli-identiteetin tutkimiseksi tarkemmin käytetään usein massaspektrometriaa.

Massaspektrometria, josta käytetään yleensä lyhennettä MS, on analyyttinen tekniikka, jolla mitataan ionisoituneiden molekyylien massa-varaus-suhdetta. Peptidianalyysissä mitattua molekyylimassaa voidaan verrata aminohapposekvenssin teoreettisesti odotettuun massaan.

Kun nämä arvot vastaavat toisiaan, se tukee tutkitun peptidin tunnistamista. Massaspektrometria ei kuitenkaan yksin anna täydellistä kuvaa laadusta.

Tässä blogissa käsittelemme, miten massaspektrometria toimii, miksi peptidit voivat tuottaa useita massasignaaleja ja miten MS-tuloksia tulkitaan yhdessä HPLC:n ja muiden analyysimenetelmien kanssa.

---

Mitä massaspektrometria on?

Massaspektrometria on analyysitekniikka, jossa molekyylit muunnetaan varautuneiksi hiukkasiksi eli ioneiksi.

Nämä ionit erotellaan ja mitataan tämän jälkeen niiden massa-varaus-suhteen perusteella.

Tämä suhde esitetään muodossa:

m/z

Tässä:

• m massaa varten;
• z sähkövarausta varten.

Massaspektrometri ei siis aina mittaa suoraan koko molekyylimassaa. Laite mittaa massan ja varauksen suhdetta.

Suuremmissa molekyyleissä, kuten monissa peptideissä, voi muodostua useita varauksia. Tämän vuoksi sama peptidi voi näkyä massaspektrissä eri kohdissa.

---

Miksi massaspektrometriaa käytetään peptidianalyysissä?

Peptidi koostuu aminohappojen tietystä järjestyksestä.

Jokaisella aminohappoyhdistelmällä on teoreettisesti laskettavissa oleva molekyylimassa.

Massaspektrometriaa voidaan käyttää sen tutkimiseen, vastaako mitattu massa tätä teoreettista arvoa.

MS-analyysi voi auttaa seuraavissa:

• molekyyli-identiteetin vahvistaminen;
• vertailu teoreettiseen molekyylimassaan;
• tiettyjen kemiallisten modifikaatioiden havaitseminen;
• hajoamistuotteiden analyysi;
• peptidivarianttien tutkiminen;
• tuotantoerien vertailu.

Vastaava massa tukee peptidin identiteettiä.

Tulos on kuitenkin aina arvioitava yhdessä analyysimenetelmän ja muiden laatutietojen kanssa.

---

Mikä on teoreettinen molekyylimassa?

Teoreettinen molekyylimassa lasketaan seuraavien perusteella:

• aminohapposekvenssi;
• aminohappojen lukumäärä;
• eventuele chemische modificaties;
• de moleculaire vorm;
• specifieke eindgroepen.

Wanneer aminozuren samen een peptideketen vormen, ontstaan peptidebindingen.

Tijdens de vorming van iedere peptidebinding wordt een watermolecuul afgesplitst. Daarom is de massa van een volledige peptide niet simpelweg de optelsom van alle losse aminozuren.

Ook modificaties kunnen de massa beïnvloeden.

Esimerkkejä ovat:

• amidatie;
• acetylering;
• fosforylering;
• oxidatie;
• toevoeging van vetzuurketens;
• vorming van disulfidebruggen.

De theoretische massa moet daarom worden berekend voor de exacte moleculaire structuur.

---

Wat betekent moleculair gewicht?

De termen moleculaire massa en moleculair gewicht worden vaak door elkaar gebruikt.

Binnen laboratoriumrapporten wordt de waarde meestal weergegeven in:

• dalton, afgekort Da;
• kilodalton, afgekort kDa.

Eén dalton komt ongeveer overeen met de massa van één waterstofatoom.

Een peptide met een moleculaire massa van 3.000 Da heeft dus een massa van ongeveer 3 kDa.

De moleculaire massa van peptiden kan sterk verschillen, afhankelijk van:

• ketenlengte;
• aminohappokoostumus;
• kemialliset modifikaatiot.

---

Hoe werkt een massaspectrometer?

Een massaspectrometer bestaat meestal uit verschillende onderdelen.

1. Monsterintroductie

Het peptide wordt eerst voorbereid en in het instrument gebracht.

De monstervoorbereiding kan invloed hebben op:

• signaalin voimakkuus;
• detecteerbaarheid;
• vorming van ionen;
• achtergrondsignalen.

2. Ionisatie

De moleculen worden elektrisch geladen.

Veelgebruikte technieken voor peptideanalyse zijn:

• electrospray-ionisatie;
• matrix-assisted laser desorption/ionization.

3. Massaanalyse

De gevormde ionen worden gescheiden op basis van hun massa-ladingsverhouding.

4. Detectie

De detector registreert de ionen.

5. Dataverwerking

De gemeten signalen worden omgezet in een massaspectrum.

Dit spectrum bevat pieken die overeenkomen met gedetecteerde ionen.

---

Wat is electrospray-ionisatie?

Electrospray-ionisatie, afgekort tot ESI, is een veelgebruikte ionisatietechniek voor peptiden.

Tijdens ESI wordt een vloeibaar monster door een fijne opening geleid terwijl een elektrische spanning wordt aangebracht.

Hierdoor ontstaan elektrisch geladen druppeltjes.

Wanneer het oplosmiddel verdampt, blijven geladen moleculen over.

Een belangrijk kenmerk van ESI is dat grotere moleculen meerdere elektrische ladingen kunnen krijgen.

Een peptide kan bijvoorbeeld voorkomen als:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Hierbij staat M voor de moleculaire massa van de peptide.

Door meerdere ladingen ontstaan verschillende m/z-signalen voor dezelfde molecule.

---

Waarom heeft één peptide meerdere pieken?

Wanneer een peptide meerdere protonen opneemt, ontstaan verschillende ladingsvormen.

Stel dat een peptide een moleculaire massa heeft van ongeveer 3.000 Da.

Mogelijke signalen zijn dan ongeveer:

• yksi positiivinen varaus: m/z noin 3,001;
• kaksi positiivista varausta: m/z noin 1,501;
• kolme positiivista varausta: m/z noin 1,001.

Kaikki nämä signaalit voivat kuulua samaan peptidiin.

Ohjelmisto voi käyttää tätä varausjakaumaa alkuperäisen molekyylimassan laskemiseen.

Tätä prosessia kutsutaan dekonvoluutioksi.

---

Mikä on dekonvolutoitu massaspektri?

Raaka ESI-mittaus voi sisältää useita varauspiikkejä.

Tämä voi vaikeuttaa tulkintaa.

Dekonvoluutio-ohjelmistolla eri varaustilat muunnetaan yhdeksi arvioiduksi molekyylimassaksi.

Dekonvolutoidun spektrin vertaaminen näihin on siten helpompaa:

• teoreettinen massa;
• referenssistandardi;
• tuotetiedot.

Laskennan laatu riippuu seuraavista:

• signaalin voimakkuus;
• resoluutio;
• taustakohina;
• ohjelmistoasetukset;
• päällekkäisten komponenttien esiintyminen.

---

Mikä on MALDI?

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, lyhennettynä MALDI, on toinen ionisaatiotekniikka.

Peptidi sekoitetaan matriisimateriaaliin ja levitetään mittauslevylle.

Laser aktivoi matriisin, jolloin syntyy peptidi-ioneja.

MALDI tuottaa usein pääasiassa yksinkertaisesti varautuneita ioneja.

Tämän ansiosta spektri voi näyttää yksinkertaisemmalta kuin ESI-spektri.

MALDI yhdistetään usein time-of-flight -massanalysaattoriin.

Tätä yhdistelmää kutsutaan:

MALDI-TOF

---

Mikä on time-of-flight?

time-of-flight-massanalysaattorissa ionit kiihdytetään sähkökentällä.

Sen jälkeen ne liikkuvat mittausputken läpi.

Pienemmän massa-varaussuhteen omaavat ionit saavuttavat ilmaisimen yleensä nopeammin kuin ionit, joiden suhde on suurempi.

Lentoajan perusteella lasketaan m/z-arvo.

TOF-järjestelmiä voidaan käyttää seuraaviin:

• peptidin tunnistus;
• massan määritys;
• molekyylivarianttien vertailu.

Lopullinen tarkkuus riippuu kalibroinnista, laitteen asetuksista ja näytteenkäsittelystä.

---

Mikä on LC-MS?

Liquid chromatography-mass spectrometry, lyhennettynä LC-MS, yhdistää nestekromatografian ja massaspektrometrian.

Komponentit erotetaan ensin kromatografisesti.

Sen jälkeen massaspektrometri analysoi yksittäiset signaalit.

LC-MS voi yhdistää tietoja seuraavista:

• retentioaika;
• kromatografinen profiili;
• molekyylimassa;
• mahdolliset epäpuhtaudet;
• hajoamistuotteet.

Tämän ansiosta LC-MS voi tarjota enemmän tietoa kuin erillinen HPLC- tai MS-analyysi.

---

Mikä ero on HPLC:llä ja massaspektrometrialla?

HPLC ja massaspektrometria vastaavat erilaisiin analyyttisiin kysymyksiin.

HPLC

HPLC voi antaa tietoa seuraavista:

• tarkka määrä;
• havaittujen komponenttien suhteellinen määrä;
• retentioajat;
• kromatografisen profiilin muutokset.

Massaspektrometria

Massaspektrometria voi antaa tietoa seuraavista:

• molekyylimassa;
• mahdollinen identiteetti;
• kemialliset modifikaatiot;
• tietyt hajoamistuotteet.

Yksinkertaistettu vertailu:

Siksi molempia tekniikoita käytetään usein yhdessä.

---

Voiko sama molekyylimassa esiintyä eri peptideillä?

Kyllä.

Eri aminohapposekvensseillä voi olla sama tai lähes sama kokonaismassa.

Näitä kutsutaan joskus isobaarisiksi rakenteiksi.

Vastaava massa ei siksi aina todista, että koko aminohappojärjestys on oikea.

Laajempaa tunnistamista varten voidaan tarvita täydentäviä tekniikoita, kuten:

• tandem-massaspektrometria;
• fragmentaatioanalyysi;
• aminohappoanalyysi;
• sekvenssianalyysi;
• vertailu referenssistandardiin.

Tarvittava analyysimenetelmä riippuu halutusta varmuudesta.

---

Mitä tandem-massaspektrometria on?

Tandem-massaspektrometria kirjoitetaan yleensä muodossa:

MS/MS

MS/MS-analyysissä valittu peptidi-ioni fragmentoidaan edelleen.

Syntyneet fragmentit mitataan sen jälkeen uudelleen.

Fragmentaatiokuvio voi antaa tietoa seuraavista:

• aminohappojärjestys;
• modifikaatioiden sijainti;
• peptidin identiteetti;
• hajoamistuotteiden rakenne.

MS/MS voi siten antaa enemmän rakennetietoa kuin pelkkä ehjän molekyylin massa.

---

Mitä peptidifragmentit ovat?

Kun peptidiketju katkeaa MS/MS-analyysin aikana tietyistä kohdista, syntyy fragmentti-ioneja.

Yleisiä fragmenttityyppejä ovat:

• b-ionit;
• y-ionit.

Näiden fragmenttien massoja voidaan käyttää aminohapposekvenssin osien rekonstruointiin.

Tulkinta voi olla monimutkaista.

Kaikki peptidit eivät fragmentoidu samalla tavalla.

Vaikuttavia tekijöitä voivat olla:

• aminohappokoostumus;
• sähkövaraus;
• peptidin koko;
• fragmentaatiomenetelmä;
• kemialliset modifikaatiot.

---

Voiko massaspektrometria havaita hapettumisen?

Tietyt oksidatiiviset muutokset aiheuttavat mitattavan massan muutoksen.

Esimerkiksi yhden happiatomin lisääminen aiheuttaa usein noin 16 Da:n massan kasvun.

Näin massaspektrometria voi auttaa tunnistamaan tiettyjä hapettumistuotteita.

Havaitseminen riippuu seuraavista:

• pitoisuus;
• laitteen resoluutio;
• analyysimenetelmä;
• komponenttien erottelu.

Kaikkia oksidatiivisia muutoksia ei voida paikantaa täydellisesti pelkästään yhden massasignaalin perusteella.

Tätä varten voidaan tarvita täydentävää fragmentaatioanalyysiä.

---

Voiko massaspektrometria määrittää peptidin määrän?

Ei automaattisesti.

Massasignaalin voimakkuuteen vaikuttavat:

• ionisaatiotehokkuus;
• molekyyliominaisuudet;
• liuotin;
• laitteen asetukset;
• muiden komponenttien läsnäolo.

Siksi kaksi kertaa voimakkaampi signaali ei automaattisesti tarkoita, että peptidiä olisi kaksi kertaa enemmän.

Luotettava kvantifiointi edellyttää validoituja menetelmiä ja soveltuvia standardeja.

Mahdollisia tekniikoita ovat:

• kvantitatiivinen LC-MS;
• sisäiset standardit;
• isotooppileimatut referenssit;
• kalibroidut HPLC-määritykset.

---

Voidaanko massaspektrometrialla osoittaa steriiliys?

Ei.

Peptidin identiteetin määrittämiseen käytettävä massaspektrometria ei ole steriiliystesti.

Tulos ei anna suoraa tietoa seuraavista:

• bakteerit;
• sienet;
• mikrobikasvu;
• tuotteen steriiliys.

Steriiliys edellyttää erityisiä mikrobiologisia testimenetelmiä.

Endotoksiineja ei myöskään määritetä automaattisesti tavanomaisen peptidi-MS-analyysin aikana.

---

Voidaanko endotoksiineja mitata massaspektrometrialla?

Ei tavanomaisella identiteettianalyysillä.

Endotoksiinit ovat monimutkaisia bakteeriperäisiä komponentteja.

Endotoksiinitutkimuksissa käytetään erityisiä menetelmiä, kuten:

• Limulus-amebosyyttilysaatitesti;
• rekombinanttiin faktori C:hen perustuvat menetelmät.

Peptidin oikea massaspektri ei siksi osoita, että materiaalin endotoksiinipitoisuus olisi alhainen.

Identiteetti, puhtaus, steriiliys ja endotoksiinit ovat erillisiä laatuparametreja.

---

Miksi laboratoriotulokset voivat poiketa toisistaan?

Eri laboratoriot voivat ilmoittaa hieman poikkeavia massa-arvoja.

Mahdollisia syitä ovat:

• laitetyyppi;
• kalibrointi;
• ionisaatiomenetelmä;
• näytteen valmistelu;
• suola-adduktit;
• käytetty ohjelmisto;
• resoluutio;
• tulkintamenetelmä.

Pienet erot eivät automaattisesti tarkoita, että tulos olisi virheellinen.

Mitattua arvoa on arvioitava seuraavien tekijöiden puitteissa:

• laitteen tarkkuus;
• odotettu molekyylimuoto;
• käytetty analyysimenetelmä.

---

Mitä adduktit ovat?

Massaspektrometrian aikana peptidi-ionit voivat sitoutua muihin varautuneisiin hiukkasiin.

Esimerkkejä ovat:

• natrium;
• kalium;
• ammonium.

Tämän seurauksena voi syntyä ylimääräisiä piikkejä.

Esimerkiksi natriumadduktin massa poikkeaa yksinkertaisesti protonoidun peptidi-ionin massasta.

Adduktit eivät automaattisesti tarkoita, että kyseessä olisi toinen peptidi.

Tulkinta edellyttää tietoa seuraavista:

• näytteen valmistelu;
• käytetyt puskurit;
• odotetut ionimuodot.

---

Mitä tietoja MS-raporttiin kuuluu?

Ammattimainen analyysiraportti voi sisältää muun muassa:

• peptidin nimi;
• erä- tai lot-numero;
• teoreettinen molekyylimassa;
• mitattu molekyylimassa;
• ionisaatiomenetelmä;
• massaspektrometrin tyyppi;
• massaspektri;
• analyysipäivä;
• laboratorion nimi.

Laajemmassa analyysissä voidaan ilmoittaa myös:

• mittausalue;
• resoluutio;
• massatarkkuus;
• fragmentaatiotiedot;
• käytetty ohjelmisto.

De benodigde rapportage hangt af van het onderzoeksdoel.

---

Tarvittava raportointi riippuu tutkimuksen tavoitteesta.

Massaspektrometria ja erävalvonta

Jokainen tuotantoerä voidaan tutkia erikseen.

• Eräkohtainen MS-analyysi tukee seuraavia:
• identiteetin varmistaminen;
• erien vertailu;
• jäljitettävyys;

poikkeamien tutkiminen.

Analyysiraportin eränumeron on vastattava vialissa olevaa tunnistetietoa.

---

Massaspektrometrinen tulos, jota ei ole selkeästi yhdistetty tiettyyn erään, on jäljitettävyyden kannalta rajoitetumman arvoinen.

Tieteelliset rajoitukset

Massaspektrometria on tehokas analyysitekniikka, mutta ei kattava laadunarviointi.

• Vastaava molekyylimassa ei automaattisesti todista seuraavia:
• täydellinen aminohapposekvenssi;
• korkea kromatografinen puhtaus;
• kromatografinen puhtaus;
• oikea peptidimäärä;
• alhainen endotoksiinipitoisuus;
• biologinen aktiivisuus;

pitkäaikainen stabiilisuus.

• Laajempi arviointi voi edellyttää useita menetelmiä:
• MALDI-TOF;
• HPLC;
• MS/MS;
• kvantitatiivinen määritys;
• stabiilisuustutkimus;
• kosteusanalyysi;

muita tuotekohtaisia testejä.

---

Tuloksia on tulkittava yhdessä.

Yhteenveto

Massaspektrometriaa käytetään tutkimuspeptidien molekyylimassan tutkimiseen.

Tekniikalla mitataan ionisoituneiden molekyylien massa–varaussuhdetta.

Peptidianalyysissä mitattua massaa voidaan verrata teoreettisesti odotettuun massaan.

Yhteensopivuus tukee molekyylin tunnistamista.

• Tärkeitä analyysitekniikoita ovat:
• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;

MS/MS.

• Massaspektrometria ei kuitenkaan automaattisesti anna tietoa seuraavista:
• tarkka määrä;
• kromatografinen puhtaus;
• endotoksiinit;
• biologinen aktiivisuus.

Siksi MS yhdistetään usein HPLC:hen ja täydentäviin laadunanalyyseihin.

---

Tutkimusvastuuvapauslauseke

Peptideran tutkimuspeptidejä tarjotaan ainoastaan Research Use Only (RUO) -käyttöön, ja ne on tarkoitettu laboratoriotutkimukseen ja analyyttisiin sovelluksiin.

Ei tarkoitettu ihmisille tai eläimille nautittavaksi, diagnostiseen käyttöön, terapeuttiseen käyttöön tai itse annettavaksi.

---

Luokka:
Peptiditietous ja laadunvalvonta

Aiheeseen liittyvät Peptidera-tuotteet:
Lyofilisoidut tutkimuspeptidit, joissa on erätunniste ja saatavilla olevat analyyttiset laatutiedot

Aiheeseen liittyvät sisäiset blogit:

• PB-0227 — Lyofilisoidut peptidit ja lyofilisaatio
• PB-0228 — Peptidipullot ja pakkauksen eheys
• PB-0229 — Eränumerot ja jäljitettävyys
• PB-0230 — Peptidien puhtaus ja HPLC
• Mikä on analyysisertifikaatti?

Sisäiset linkkiehdotukset:

• Linkki PB-0230:een HPLC:n ja MS:n eron yhteydessä
• Linkki PB-0229:ään eräkohtaisen analyysin yhteydessä
• Linkki COA-sivulle massaspektrometristen testitulosten yhteydessä
• Linkki tutkimuspeptidien kokoelmaan
• Linkki riippumattoman laboratorioanalyysin sivulle