Peptidi-analyysi: puhtaus vs. peptidipitoisuus
Peptidi-assay: ero puhtauden ja todellisen peptidipitoisuuden välillä
Tutkimuspeptidien laadunarvioinnissa ensimmäisenä tarkastellaan usein puhtausprosenttia. Analyysisertifikaateissa esiintyy usein arvoja kuten 98 %, 99 % tai 99,5 % HPLC-puhdasta.
Korkea prosenttiosuus voi antaa tärkeää tietoa näytteen kromatografisesta koostumuksesta. Se ei kuitenkaan automaattisesti vastaa toiseen tärkeään kysymykseen:
Kuinka paljon todellista peptidiä on vialissa?
HPLC-puhdas ja peptidipitoisuus sekoitetaan usein keskenään. Esimerkiksi tutkimuspeptidillä voi olla 99 % kromatografinen puhtaus, vaikka todellinen peptidiosuus koko kuivajauheessa on alhaisempi.
Se ei välttämättä viittaa suoraan laatuongelmaan. Kuivajauhettu tuote voi sisältää peptidin lisäksi vettä, vastainteja, suoloja tai formulointikomponentteja.
Todellisen peptidimäärän tutkimiseksi voidaan tehdä kvantitatiivinen analyysi. Tätä kutsutaan usein peptidi-assayksi.
Tässä blogissa käsittelemme, mitä peptidi-assay on, miten se eroaa HPLC-puhdasta ja miksi täydelliseen laadunarviointiin tarvitaan useita analyysimenetelmiä.
Mikä on peptidi-assay?
Peptidi-assay on analyyttinen määritys, jolla tutkitaan tietyn peptidin määrä näytteessä.
Käytetystä menetelmästä riippuen tulos voidaan esittää seuraavasti:
- milligrammaa peptidiä per vial;
- milligrammaa peptidiä per gramma materiaalia;
- peptidipitoisuuden prosenttiosuus;
- konsentraatio liuoksessa;
- määrä suhteessa vertailustandardiin.
Assay keskittyy siis määrään.
Keskeinen kysymys on:
Kuinka paljon haluttua peptidiä on todellisuudessa läsnä?
Tämä eroaa tavallisesta HPLC-puhdasanalyysistä.
Kromatografisen puhtauden keskeinen kysymys on:
Mikä osa mitatusta kromatografisesta signaalista kuuluu pääkomponenttiin?
Molemmat analyysit voivat olla arvokkaita, mutta kuvaavat eri ominaisuuksia.
Mitä HPLC-puhdas tarkoittaa?
HPLC tarkoittaa High-Performance Liquid Chromatography.
HPLC-analyysin aikana liuotettu näyte johdetaan kromatografisen kolonnin läpi. Eri molekyylikomponentit liikkuvat kolonnin läpi eri nopeuksilla.
Tämän avulla ne voidaan erottaa toisistaan.
Tulos esitetään kromatogrammina.
Kromatogrammi sisältää yleensä:
- vaakasuora aikajana;
- pystysuora detektorin vaste;
- päähuippu;
- mahdolliset pienemmät sivuhuiput.
Kun analyysitodistus esimerkiksi ilmoittaa 99 % HPLC-puhdistusasteen, se tarkoittaa yleensä, että noin 99 % integroidusta kromatografisesta signaalista on kohdistettu päähuipulle.
Se ei automaattisesti tarkoita, että 99 % vialin kokonaismassasta olisi haluttua peptidiä.
Miksi HPLC-puhdistusaste ei ole sama kuin peptidipitoisuus?
Tavallinen HPLC-puhdistusanalyysi vertaa yleensä havaittujen kromatografisten huippujen suhteellisia pinta-aloja.
Kaikkia jääkuivattuja näytteitä ei välttämättä mitata samalla tavalla.
Kokonaispitoisuus voi esimerkiksi koostua:
- haluttu peptidi;
- jäännösneste;
- sidottu vesi;
- etsaatti-ionit;
- trifluorietsaatti-ionit;
- kloridi-ionit;
- suolat;
- apuaineet.
Jotkut näistä komponenteista tuottavat käytetyissä HPLC-olosuhteissa vähän tai ei lainkaan vastaavaa detektorisignaalia.
Tästä syystä näyte voi olla kromatografialtaan puhdas, vaikka todellinen peptidipitoisuus olisi alhaisempi.
Tämä ei ole ristiriita. Analyysit mittaavat eri ominaisuuksia.
Yksinkertaistettu laskuesimerkki
Oletetaan, että jääkuivattu näyte painaa yhteensä 10 milligrammaa.
Koostumus on hypoteettinen:
- 8,5 mg haluttua peptidiä;
- 0,8 mg vastakkaisioneja;
- 0,5 mg vettä;
- 0,2 mg muita komponentteja.
HPLC-analyysi voi osoittaa, että 99 % havaituista peptidiin liittyvistä signaaleista kuuluu päähuipulle.
Kuitenkaan 99 % kokonaiskuivamassasta ei ole pelkkää peptidiä.
Todellinen peptidipitoisuus tässä yksinkertaistetussa esimerkissä on:
8,5 mg 10 mg:sta = 85 %
HPLC-tulos ja analyysi voivat molemmat olla oikein.
Ne kuvaavat vain erilaisia laatuominaisuuksia.
Mitä puhdas peptidipitoisuus tarkoittaa?
Termi puhdas peptidipitoisuus tarkoittaa todellista peptidimäärää sen jälkeen, kun tietyt ei-peptidikomponentit on otettu huomioon.
Esimerkkejä tällaisista komponenteista ovat:
- vesi;
- vastaiot;
- jäännössuolat;
- formulointikomponentit.
Puhdas peptidipitoisuus voidaan ilmaista prosentteina.
Kun esimerkiksi jääkuivattu materiaali sisältää 85 % puhdasta peptidiä, se tarkoittaa, että noin 85 % tutkittavasta massasta on peptidiä.
Tarkka laskenta riippuu:
- käytetyt analyysimenetelmät;
- tuotekoostumus;
- korjauskertoimet;
- määrittelyt.
Termi on siksi tulkittava analyysiraportin yhteydessä.
Mitkä tekijät vaikuttavat peptidipitoisuuteen?
Todellinen peptidipitoisuus voi vaihdella eri tekijöiden mukaan.
Jäännösneste
Lyofilisoinnin jälkeen pieni määrä vettä jää usein jäljelle.
Tätä kutsutaan jäännösnesteeksi.
Määrä voi riippua:
- jäädytysprosessi;
- ensisijainen kuivausvaihe;
- toissijainen kuivausvaihe;
- formulointi;
- varastointiehdot;
- pakkauksen eheys.
Jäännösneste vaikuttaa kokonaismassaan, mutta ei ole peptidi.
Vastakkaisionit
Peptidit voivat olla suolamuodossa tuotannon ja puhdistuksen aikana.
Yleisiä vastasuoloja ovat:
- etanoaatti;
- trifluorietanoaatti;
- kloridi.
Nämä ionit lisäävät materiaalin kokonaismassaa.
Vastasuolojen määrä voi vaihdella tuotantoerien ja puhdistusmenetelmien mukaan.
Suolat
Jäämäsuolat voivat olla peräisin:
- puskurit;
- puhdistusprosessit;
- ioninvaihto;
- formulointivaiheet.
Apuaineet
Joissakin lyofilisaatioprosesseissa käytetään apuaineita tukemaan fysikaalista rakennetta tai stabiilisuutta.
Nämä aineet voivat olla osa kokonaiskuivajauhetta.
Miten peptidipitoisuus voidaan määrittää?
Ei ole olemassa yhtä yleistä analyysimenetelmää, joka olisi optimaalinen kaikille peptideille.
Sopiva menetelmä riippuu:
- aminohapposekvenssi;
- molekyylirakenne;
- materiaalin määrä;
- haluttu tarkkuus;
- tutkimustavoite.
Mahdollisia tekniikoita ovat:
- kvantitatiivinen HPLC;
- aminohappoanalyysi;
- LC-MS-kvantifiointi;
- ultraviolettispektrofotometria;
- massatasapainolaskenta.
Jokaisella menetelmällä on omat etunsa ja rajoituksensa.
Kvantitatiivinen HPLC
HPLC:tä ei voi käyttää vain suhteellisen puhtauden analysointiin.
Sopivan referenssistandardin avulla HPLC:tä voidaan käyttää myös kvantitatiivisesti.
Siinä näytteen detektorisignaali verrataan tunnettujen pitoisuuksien signaaleihin.
Tähän tehdään yleensä kalibraatiokäyrä.
Yksinkertaistettu menettely sisältää:
- referenssiliuosten valmistelu;
- tunnettujen pitoisuuksien mittaaminen;
- kalibraatiokäyrän laatiminen;
- tuntemattoman näytteen mittaaminen;
- peptidipitoisuuden laskeminen.
Luotettavien tulosten saamiseksi menetelmä on validoitava riittävästi.
Miksi referenssistandardi on tärkeä?
Referenssistandardi on hyvin määritelty materiaali, jonka olennaiset ominaisuudet ovat tiedossa.
Kvantitatiivisessa HPLC:ssä standardia käytetään mitatun signaalin vertaamiseen tunnettuun määrään.
Standardin laatu vaikuttaa analyysin luotettavuuteen.
Tärkeitä ominaisuuksia ovat:
- vahvistettu identiteetti;
- tunnettu puhtaus;
- tunnettu peptidipitoisuus;
- sopiva säilytys;
- jäljittävyys.
Väärin määritelty standardi voi johtaa systemaattisiin mittausvirheisiin.
Mikä on kalibraatiokäyrä?
Kalibraatiokäyrä kuvaa suhdetta:
- tunnettu pitoisuus;
- mitattu detektorisignaali.
Useita standardiliuoksia analysoidaan.
Mitattuja signaaleja verrataan sitten tunnettuun pitoisuuteen.
Kun menetelmä on käytetyllä mittausalueella lineaarinen, tuntemattoman näytteen pitoisuus voidaan laskea.
Luotettavuus riippuu muun muassa:
- lineaarisuus;
- tarkkuus;
- toistettavuus;
- standardin laatu;
- näytteen valmistelu.
Aminohappoanalyysi
Aminohappoanalyysiä voidaan käyttää aminohappokoostumuksen tai peptidimäärän tutkimiseen.
Klassisessa analyysissä peptidiketju hajotetaan yksittäisiksi aminohapoiksi.
Tämä tapahtuu usein hydrolyysin avulla.
Vapautuneet aminohapot erotetaan ja mitataan.
Aminohappoanalyysi voi antaa tietoa:
- aminohappokoostumus;
- aminohappojen suhde;
- arvioitu peptidimäärä.
Menetelmä voi olla hyödyllinen kvantifioinnissa, mutta sillä on rajoituksia.
Aminohappoanalyysin rajoitukset
Kaikki aminohapot eivät pysy täysin stabiileina hydrolyysin aikana.
Mahdollisia haasteita ovat:
- osittainen hajoaminen;
- epätäydellinen hydrolyysi;
- tiettyjen aminohappojen muuntuminen;
- häviöt näytteen valmistuksen aikana.
Siksi usein valitaan tietyt aminohapot kvantitatiivisiin laskelmiin.
Menetelmä on sovitettava tutkittavaan peptidiin.
LC-MS kvantitatiiviseen analyysiin
Nestekromatografia-massaspektrometria yhdistää kromatografisen erotuksen massaspektrometriaan.
LC-MS:ää voidaan käyttää:
- tunnistus;
- muutosten analysointi;
- hajoamistuotteiden havaitseminen;
- kvantifiointi.
Luotettavaan kvantifiointiin tarvitaan yleensä:
- sopivat kalibrointistandardit;
- validoidut mittausolosuhteet;
- sisäiset standardit;
- kontrolloitu näytteen valmistus.
Massasignaalin intensiteettiä ei voi ilman kalibrointia suoraan muuntaa tarkaksi määräksi.
Miksi signaalin voimakkuus ei ole automaattisesti määrän mitta?
Eri molekyylit ionisoituvat eri tehokkuudella.
Massaspektrometrian signaalin voimakkuuteen vaikuttavat:
- molekyylirakenne;
- sähkövaraus;
- liuotin;
- suolapitoisuus;
- laitteiston asetukset;
- muiden komponenttien läsnäolo.
Kaksinkertainen massasignaali ei siis automaattisesti tarkoita kaksinkertaista peptidimäärää.
Kvantitatiivinen LC-MS vaatii kontrolloidun analyysimenetelmän.
Ultraviolettispektrofotometria
Jotkut peptidit absorboivat ultraviolettivaloa.
Tätä absorptiota voidaan tietyissä olosuhteissa käyttää pitoisuuden määritykseen.
Sopivuus riippuu aminohappokoostumuksesta.
Erityisesti aromaattiset aminohapot voivat vaikuttaa UV-absorptioon, mukaan lukien:
- tryptofaani;
- tyrosiini;
- fenyylialaniini.
Kaikissa peptideissä ei ole riittävästi näitä aminohappoja luotettavaan kvantifiointiin.
Myös muut komponentit voivat vaikuttaa UV-signaaliin.
Mitä massatasapaino tarkoittaa?
Massatasapainossa yhdistetään eri mitatut komponentit.
Yksinkertaistettu laskelma voi ottaa huomioon:
- HPLC-puhdasaste;
- vesipitoisuus;
- vastionipitoisuus;
- epäorgaaniset komponentit;
- muut mitatut aineet.
Tällä voidaan arvioida puhtaan peptidipitoisuuden määrää.
Luotettavuus riippuu analyysien täydellisyydestä.
Mittamattomat komponentit voivat vaikuttaa tulokseen.
Mitä pullon sisältö tarkoittaa?
Pullossa ilmoitettu määrä ilmaistaan usein milligrammoina.
Esimerkiksi:
10 mg tutkimuspeptidiä
Luotettavaa kvantitatiivista arviointia varten on oltava selvää, mitä tämä arvo kuvaa.
Mahdollisia tulkintoja ovat:
- nimellismäärä;
- punnittu materiaalimäärä;
- laskettu nettomäärä peptidejä;
- mitattu peptidepitoisuus.
Nämä arvot eivät ole automaattisesti samoja.
Läpinäkyvät tuotespesifikaatiot selventävät, miten määrä on määritetty.
Mikä on täyttöpainon tarkastus?
Tuotannon aikana voidaan tarkistaa, kuinka paljon materiaalia jaetaan jokaiseen pulloon.
Tätä kutsutaan joskus täyttöpainon tarkastukseksi.
Menetelmä voi antaa tietoa:
- yhtenäisyys pullojen välillä;
- kokonaismäärä kuivajauhetta;
- vaihtelu täyttöprosessin aikana.
Pelkkä painonmääritys ei kuitenkaan näytä, kuinka paljon materiaalista koostuu halutusta peptidistä.
Sitä varten tarvitaan lisäanalyysitietoa.
Miksi pullot voivat vaihdella erän sisällä?
Tuotantoprosessit suunnitellaan pitämään vaihtelu mahdollisimman pienenä.
Silti jonkin verran vaihtelua voi esiintyä.
Mahdollisia syitä ovat:
- täyttövaihtelut;
- erot lyofilisoinnissa;
- jäännösneste;
- mittausepävarmuus;
- materiaalihävikki.
Siksi laadunvalvonta voi tutkia useita näytteitä erästä.
Yksi testattu pullo ei automaattisesti kuvaa täydellisesti jokaista yksittäistä pulloa.
Mitä mittausepävarmuus tarkoittaa?
Jokainen analyyttinen mittaus sisältää tietyn määrän epävarmuutta.
Mahdollisia lähteitä ovat:
- laitteiston vaihtelu;
- näytteen valmistelu;
- pipetointivirheet;
- kalibrointi;
- referenssistandardi;
- datankäsittely.
Mitattua määrää ei siksi tule pitää absoluuttisesti virheettömänä.
Ammattilaboratoriot arvioivat:
- tarkkuus;
- toistettavuus;
- toistettavuus;
- toistettavuus.
Mikä on tarkkuus?
Tarkkuus kuvaa, kuinka lähellä mitattu arvo on todellista tai hyväksyttyä referenssiarvoa.
Menetelmää voidaan esimerkiksi testata näytteillä, joiden määrä on tiedossa.
Kun mitatut tulokset ovat lähellä odotettuja arvoja, se tukee tarkkuutta.
Mikä on toistettavuus?
Toistettavuus kuvaa, kuinka lähellä toistuvat mittaukset ovat toisiaan.
Menetelmä voi antaa hyvin toistettavia tuloksia, jotka kuitenkin poikkeavat systemaattisesti todellisesta arvosta.
Siksi sekä tarkkuus että toistettavuus ovat tärkeitä.
Miksi menetelmän validointi on välttämätöntä?
Analyysimenetelmän on oltava osoitettavasti sopiva tarkoitukseensa.
Kvantiittisessa peptidepitoisuuden määrityksessä relevantteja validointiominaisuuksia voivat olla:
- spesifisyys;
- tarkkuus;
- toistettavuus;
- lineaarisuus;
- mittausalue;
- kestävyys;
- kvantifiointiraja.
Menetelmä, joka sopii identiteettitutkimukseen, ei automaattisesti sovi tarkkaan kvantifiointiin.
Miten luet määritystietoja COA:sta?
Tarkista peptidepitoisuuden määrityksessä vähintään:
- Mitä analyysimenetelmää on käytetty?
- Näytetäänkö tulos milligrammoina vai prosentteina?
- Onko käytetty referenssistandardia?
- Onko selvää, mitä mitattu arvo kuvaa?
- Onko tulos eräkohtainen?
- Onko analyysipäivämäärä mainittu?
- Onko menetelmä sopiva kvantifiointiin?
Pelkkä prosenttiosuus ilman menetelmää tai kontekstia antaa rajallista tietoa.
Miksi puhtaus ja analyysi tulee arvioida yhdessä?
Puhtaus ja analyysi täydentävät toisiaan.
Korkea HPLC-puhdistus voi osoittaa, että vähän peptidiin liittyviä sivukomponentteja on havaittu.
Kvantitatiivinen analyysi voi osoittaa, kuinka paljon haluttua peptidiä on.
Ne antavat yhdessä enemmän tietoa:
- suhteellinen koostumus;
- todellinen määrä;
- erän yhdenmukaisuus;
- tuotespesifikaatiot.
Kumpikaan parametri ei yksin anna täydellistä laatukuvaa.
Tieteelliset rajoitukset
Peptidianalyysillä on aina menetelmäkohtaisia rajoituksia.
Tuloksiin voivat vaikuttaa:
- näytteen valmistelu;
- referenssistandardi;
- laitteiston asetukset;
- häiritsevät komponentit;
- mittausepävarmuus;
- näytteen stabiilisuudesta.
Myös tarkka analyysi ei automaattisesti kerro:
- steriiliys;
- endotoksiinit;
- biologinen aktiivisuus;
- pitkäaikainen stabiilisuus;
- täydellinen aminohapposekvenssi.
Niihin tarvitaan erilliset analyysit.
Yhteenveto
HPLC-puhdistus ja peptidipitoisuus ovat eri laatumittareita.
HPLC-puhdistus kuvaa yleensä päähuipun suhteellista osuutta havaituissa kromatografisissa signaaleissa.
Peptidianalyysi tutkii, kuinka paljon haluttua peptidiä todellisuudessa on läsnä.
Kuivajäädytetty kokonaismateriaali voi lisäksi sisältää:
- vesi;
- vastaiot;
- suolat;
- apuaineet.
Siksi 99 % HPLC-puhdistus ei automaattisesti tarkoita, että 99 % koko vialin massasta on peptidiä.
Mahdollisia kvantifiointimenetelmiä ovat:
- kvantitatiivinen HPLC;
- aminohappoanalyysi;
- LC-MS;
- UV-spektrofotometria;
- massatasapaino.
Laajaan laatuarvioon tulee yhdistää puhtaus, identiteetti, peptidipitoisuus, erätiedot ja lisäanalyysitestit.
Tutkimusvakuutus
Peptideran tutkimuspeptidit on tarkoitettu ainoastaan vain tutkimuskäyttöön (RUO) ja ne on suunnattu laboratoriotutkimuksiin ja analyyttisiin sovelluksiin.
Ei tarkoitettu ihmis- tai eläinkäyttöön, diagnostiseen käyttöön, terapeuttiseen sovellukseen tai itsehoitoon.
Aiheeseen liittyvät Peptidera-tuotteet:
Kuivajäädytetyt tutkimuspeptidit erätunnuksella ja saatavilla olevilla analyyttisillä laatuarvoilla
Aiheeseen liittyvät sisäiset blogit:
- PB-0229 — Eränumerot ja jäljitettävyys
- PB-0230 — Peptidipuhdistus ja HPLC
- PB-0231 — Massaspektrometria peptideille
- PB-0232 — Analyysisertifikaatti peptideille
- PB-0227 — Kuivajäädytetyt peptidit ja lyofilisaatio
Sisälinkkiehdotukset:
- Linkki PB-0230 HPLC-puhdistuksessa
- Linkki PB-0231 LC-MS:ssä ja molekyylisessä identiteetissä
- Linkki PB-0232 analyysitietoihin COA:ssa
- Linkki PB-0229 eräkohtaisessa laadunvalvonnassa
- Linkki Peptidera-sivulle, jossa analyysisertifikaatit
- Linkki tutkimuspeptidien kokoelmaan