Peptidipuhdas: mitä tarkoittaa 99 % HPLC?
Peptidin puhtaus selitettynä: mitä HPLC-prosenttiosuus todella kertoo?
Tutkimuspeptideistä ilmoitetaan usein puhtausprosentti. Arvoja, kuten 98 %, 99 % tai 99,5 % puhtaus, käytetään säännöllisesti kuvaamaan peptidin laatua.
Suuri prosenttiosuus vaikuttaa helpolta tulkita: mitä suurempi luku, sitä parempi tuote. Käytännössä peptidin puhtaus on monimutkaisempi asia.
HPLC-tulos antaa tietoa analysoidun näytteen suhteellisesta koostumuksesta. Prosenttiosuus ei kuitenkaan automaattisesti todista:
- että kyseessä on oikea peptidi;
- että aminohapposekvenssi on täysin oikea;
- että vialiin ilmoitettu peptidin määrä pitää paikkansa;
- että materiaali on steriiliä;
- että se on endotoksiiniton;
- että kaikki mahdolliset epäpuhtaudet on mitattu.
Peptidin laadun huolellinen arviointi edellyttää useiden analyyttisten tietojen tarkastelua yhdessä.
Tässä blogissa käsittelemme, miten peptidin puhtaus mitataan, mitä HPLC-prosenttiosuus tarkoittaa ja miksi puhtaus on vain yksi osa kattavaa laadunvalvontaa.
Mitä peptidin puhtaus tarkoittaa?
Peptidin puhtaus kuvaa sitä, kuinka suuri osa havaituista peptidiin liittyvistä komponenteista vastaa analysoidun näytteen pääkomponenttia.
Kun analyysitodistuksessa ilmoitetaan esimerkiksi HPLC-puhtaudeksi 99% kun analyysitodistuksessa ilmoitetaan, tämä tarkoittaa yleensä, että noin 99 % integroidusta kromatografisesta signaalista on määritetty pääpiikille.
Tämä ei automaattisesti tarkoita, että 99 % vialin kokonaispainosta koostuisi halutusta peptidistä.
Viali voi sisältää peptidin lisäksi myös muita komponentteja, kuten:
- vettä;
- vastaioneja;
- suoloja;
- apuaineita;
- tuotannosta peräisin olevia jäämiä;
- ei havaittavia komponentteja.
HPLC-prosenttiosuus ja peptidin todellinen määrä ovat siksi eri laatumuuttujia.
Mitä HPLC tarkoittaa?
HPLC on lyhenne sanoista High-Performance Liquid Chromatography.
Se on analyyttinen tekniikka, jonka avulla näytteen eri kemialliset komponentit voidaan erottaa toisistaan.
HPLC-analyysissä liuotettu näyte johdetaan kolonniin. Kolonni sisältää stationaarisen faasin.
Kolonnin läpi virtaavaa nestettä kutsutaan liikkuvaksi faasiksi.
Eri molekyylit eivät reagoi näiden faasien kanssa samalla tavalla. Tämän vuoksi jotkin komponentit kulkevat kolonnin läpi nopeammin kuin toiset.
Tulos esitetään kromatogrammina.
Kromatogrammi koostuu yleensä seuraavista:
- vaakasuora aika-akseli;
- pystysuora signaaliakseli;
- één of meerdere pieken.
Iedere piek vertegenwoordigt een gedetecteerde component of groep componenten.
Wat is een retentietijd?
De tijd die een component nodig heeft om door de HPLC-kolom te bewegen en de detector te bereiken, wordt de retentietijd genoemd.
De retentietijd kan worden beïnvloed door:
- type HPLC-kolom;
- samenstelling van de mobiele fase;
- temperatuur;
- stroomsnelheid;
- eigenschappen van de peptide;
- gebruikte analysemethode.
Een overeenkomstige retentietijd kan helpen bij vergelijking met een referentiestandaard.
Een retentietijd alleen is echter meestal onvoldoende om de identiteit van een peptide definitief te bevestigen.
Verschillende moleculen kunnen onder bepaalde omstandigheden vergelijkbare retentietijden hebben.
Daarom wordt HPLC vaak gecombineerd met massaspectrometrie.
Hoe wordt het zuiverheidspercentage berekend?
Bij veel HPLC-analyses wordt het oppervlak onder iedere chromatografische piek berekend.
Dit wordt peak-area integration genoemd.
Een vereenvoudigd voorbeeld:
- hoofdpiek: 99%;
- nevenpiek A: 0,5%;
- nevenpiek B: 0,3%;
- overige gedetecteerde pieken: 0,2%.
De gerapporteerde chromatografische zuiverheid is dan ongeveer 99%.
Deze berekening is afhankelijk van:
- detectiemethode;
- integratie-instellingen;
- gekozen golflengte;
- analysemethode;
- havaitsemisraja;
- monsterconcentratie.
Een zuiverheidspercentage moet daarom altijd in de context van de gebruikte methode worden geïnterpreteerd.
Wat betekent een hoofdpiek?
De grootste piek in een chromatogram wordt vaak de hoofdpiek genoemd.
Bij een goed gekarakteriseerd peptide wordt verwacht dat deze piek overeenkomt met het gewenste peptide.
Dat moet echter analytisch worden bevestigd.
Een grote piek bewijst op zichzelf niet dat de juiste moleculaire structuur aanwezig is.
Om de identiteit te ondersteunen, kunnen aanvullende technieken worden gebruikt, zoals:
- Laajemman laatunäkemyksen saamiseksi HPLC-tulokset on yhdistettävä muihin tietoihin, kuten:
- aminohappoanalyysi;
- sequentieanalyse;
- nucleaire magnetische resonantie;
- vergelijking met een referentiestandaard.
HPLC beschrijft voornamelijk de chromatografische samenstelling van het monster.
Welke onzuiverheden kunnen tijdens peptidesynthese ontstaan?
Veel synthetische peptiden worden geproduceerd via solid-phase peptide synthesis, meestal afgekort tot SPPS.
Tijdens dit proces worden aminozuren stapsgewijs aan een groeiende peptideketen gekoppeld.
Bij iedere stap kunnen kleine procesafwijkingen ontstaan.
Mogelijke peptidegerelateerde onzuiverheden zijn:
Verkorte peptideketens
Wanneer een aminozuur niet correct wordt gekoppeld, kan een onvolledige peptideketen ontstaan.
Dit wordt ook een truncatieproduct genoemd.
Deletiesequenties
Deleetiosekvenssistä puuttuu yksi tai useampi aminohappo tarkoitetusta ketjusta.
Tämän seurauksena molekyylimassa poikkeaa halutun peptidin massasta.
Kemiallisesti muuntuneet variantit
Tuotannon, puhdistuksen tai varastoinnin aikana voi tapahtua kemiallisia muutoksia.
Esimerkkejä ovat:
- hapettuminen;
- deamidaatio;
- hydrolyysi;
- isomeroituminen.
Suojaryhmien jäämät
Peptidisynteesissä käytetään tilapäisiä suojaryhmiä ei-toivottujen reaktioiden estämiseksi.
Ne on poistettava myöhemmin.
Epätäydellinen poisto voi edistää sivukomponenttien muodostumista.
Aggregaatit
Peptidimolekyylit voivat tietyissä olosuhteissa muodostaa suurempia rakenteita.
Kaikilla HPLC-menetelmillä aggregaatiota ei havaita tai luonnehdita samalla tavalla.
Onko 99 prosentin HPLC-puhtaus sama asia kuin 99 prosentin peptidipitoisuus?
Ei.
Tämä on tärkeä ero.
HPLC-puhtaus kuvaa yleensä havaittujen kromatografisten komponenttien suhteellista osuutta.
Peptidipitoisuus kuvaa todellisen peptidin määrää suhteessa koko materiaalin määrään.
Pakastekuivattu injektiopullo voi esimerkiksi sisältää:
- haluttua peptidiä;
- vettä;
- vastaioneja;
- suoloja;
- apuaineita.
Näitä komponentteja ei välttämättä kaikkia mitata samalla tavalla tavanomaisessa HPLC-analyysissä.
Siksi näytteellä voi olla korkea kromatografinen puhtaus, vaikka peptidin kokonaispitoisuus olisi HPLC-prosenttiosuutta pienempi.
Kvantitatiiviseen määritykseen tarvitaan täydentäviä analyysimenetelmiä.
Mikä on peptidin assay?
Assay-menetelmää käytetään tietyn komponentin määrän tai pitoisuuden määrittämiseen.
Tutkimustavoitteesta riippuen voidaan käyttää erilaisia menetelmiä.
Esimerkkejä ovat:
- kvantitatiivinen HPLC referenssistandardin avulla;
- aminohappoanalyysi;
- typpianalyysi;
- spektroskooppiset tekniikat;
- massataseen laskelmat.
Assay vastaa eri kysymykseen kuin tavanomainen puhtausanalyysi.
Puhtausanalyysissä kysytään:
Mikä osuus havaituista peptidikomponenteista kuuluu pääpiikkiin?
Kvantitatiivinen assay edellyttää:
Kuinka paljon haluttua peptidiä on todellisuudessa läsnä?
Molemmat tiedot voivat olla merkityksellisiä kattavan laadunmäärityksen kannalta.
Miksi massaspektrometria on tärkeää?
Massaspektrometria, josta käytetään usein lyhennettä MS, mittaa ionisoitujen molekyylien massa-varaussuhdetta.
Peptidianalyysissä voidaan tutkia, vastaako mitattu molekyylimassa teoreettisesti odotettua massaa.
Massaspektrometria voi auttaa:
- identiteetin varmistaminen;
- tiettyjen modifikaatioiden havaitseminen;
- hajoamistuotteiden analyysi;
- peptidivarianttien vertailu.
Kun mitattu massa vastaa odotettua massaa, se tukee tunnistamista.
Massaspektrometria ei kuitenkaan automaattisesti anna täydellisiä tietoja seuraavista:
- puhtausprosentti;
- tarkka määrä;
- aminohapposekvenssi;
- endotoksiinit;
- biologinen aktiivisuus.
Siksi HPLC ja massaspektrometria täydentävät toisiaan.
Mitä LC-MS on?
LC-MS yhdistää nestekromatografian ja massaspektrometrian.
Ensin komponentit erotetaan kromatografisesti. Sen jälkeen yksittäisiä signaaleja tutkitaan tarkemmin massaspektrometrialla.
Tämä yhdistelmä voi antaa tietoa seuraavista:
- retentioaika;
- molekyylimassa;
- mahdolliset epäpuhtaudet;
- hajoamistuotteet;
- kemialliset modifikaatiot.
LC-MS voi siksi tarjota enemmän analyyttista tietoa kuin yksi yksittäinen tekniikka.
Tulosten laatu riippuu edelleen seuraavista:
- näytteen valmistelu;
- laitteistoasetukset;
- menetelmävalidointi;
- vertailumateriaalit;
- asiantuntijan tulkinta.
Miksi eri laboratoriot voivat mitata erilaisia tuloksia?
Sama peptidi voi tuottaa eri laboratorioissa hieman toisistaan poikkeavia tuloksia.
Mahdollisia syitä ovat:
- erilaiset HPLC-kolonnit;
- muut liikkuvat faasit;
- poikkeavat gradientit;
- muut detektorin aallonpituudet;
- erot näytteen valmistelussa;
- erilaiset integrointiasetukset;
- laitteistovaihtelu.
Ero ei automaattisesti tarkoita, että toinen analyyseistä olisi virheellinen.
Tulosten asianmukaiseksi vertailemiseksi on tarkasteltava myös analyysimenetelmää.
Prosenttiluku ilman tietoa menetelmästä antaa vain rajallisen kontekstin.
Mitä on menetelmävalidointi?
Analyyttisen menetelmän soveltuvuus aiottuun tarkoitukseen on pystyttävä osoittamaan.
Tätä kutsutaan menetelmävalidoinniksi.
Mahdollisia validointiominaisuuksia ovat:
- spesifisyys;
- oikeellisuus;
- täsmällisyys;
- lineaarisuus;
- mittausalue;
- havaitsemisraja;
- kvantifiointiraja;
- robustisuus.
Identiteetin määrittämiseen tarkoitettu menetelmä ei automaattisesti sovellu tarkkaan kvantifiointiin.
Siksi on etukäteen määriteltävä selkeästi, mitä analyyttistä kysymystä tutkitaan.
Mikä on havaitsemisraja?
Jokaisella analyysimenetelmällä on raja, jonka alapuolella komponenttia ei voida havaita luotettavasti.
Tätä kutsutaan havaitsemisrajaksi.
Komponentti, joka ei näy kromatogrammissa, ei siksi automaattisesti ole täysin poissa.
Pitoisuus voi olla pienempi kuin havaitsemisraja.
Lisäksi tietyt aineet voivat:
- eivät reagoi käytetyn detektorin kanssa;
- jäävät mittausalueen ulkopuolelle;
- häviävät näytteen valmistelun aikana;
- eivät erotu riittävästi.
Ilmaus ”ei havaittu” ei siksi aina tarkoita samaa kuin ”ei läsnä”.
Voidaanko kromatogrammia manipuloida?
Kromatogrammin on sisällettävä riittävästi tietoa, jotta se voidaan arvioida ammattimaisesti.
Tärkeitä tietoja ovat:
- tuotteen nimi;
- eränumero;
- analyysipäivä;
- käytetty menetelmä;
- ilmaisinasetukset;
- retentioajat;
- piikkien integrointi;
- laboratoriotiedot.
Pelkkä kuva, jossa näkyy yksi suuri piikki ja prosenttiosuus, tarjoaa vain rajalliset mahdollisuudet tulosten tarkistamiseen.
Myös integrointiasetukset voivat vaikuttaa siihen, mitkä signaalit otetaan mukaan laskelmaan.
Läpinäkyvä raportointi on siksi tärkeää.
Mitä tietoja luotettavassa COA:ssa pitäisi olla?
Certificate of Analysis voi sisältää muun muassa seuraavat tiedot:
- peptidin nimi;
- aminohapposekvenssi;
- erä- tai lot-numero;
- tuotantopäivämäärä;
- testipäivämäärä;
- HPLC-tulos;
- kromatogrammi;
- massaspektrometrinen tulos;
- teoreettinen molekyylimassa;
- mitattu molekyylimassa;
- käytetyt analyysimenetelmät;
- laboratorion nimi.
Kaikki COA:t eivät sisällä kaikkia osia.
Tarvittavat tiedot riippuvat tuotteesta ja tutkimuksen tavoitteesta.
Kattava COA voi lisätä läpinäkyvyyttä, mutta luotettavuus riippuu myös analyysin laadusta.
Onko korkea puhtaus aina välttämätön?
Tarvittava puhtaus riippuu tutkimuksen tavoitteesta.
Joissakin analyyttisissä sovelluksissa erittäin pienet sivukomponenttien määrät voivat vaikuttaa seuraaviin:
- mittaustuloksiin;
- reseptoritutkimukseen;
- solututkimukseen;
- toistettavuuteen.
Tällöin korkeampi puhtaustaso voi olla toivottava.
Suurempi prosenttiosuus ei kuitenkaan automaattisesti tarkoita, että kaikki muut laatuominaisuudet olisivat parempia.
Esimerkiksi peptidillä, jonka HPLC-puhtaus on 99,5 %, voi silti olla:
- sisältää poikkeavan määrän;
- olla varastoitu väärin;
- olla puutteellisesti tunnistettu;
- sisältää tavallista enemmän jäännöskosteutta;
- pakkaus voi olla vaurioitunut.
Laatua on siksi arvioitava moniulotteisesti.
Puhtaus ja erien väliset erot
Jokaisella tuotantoerällä on oma tuotanto- ja analyysipolkunsa.
Siksi puhtaustulokset voivat vaihdella erien välillä.
Yhden erän analyysia ei saa automaattisesti käyttää todisteena kaikista tulevista eristä.
Eräkohtainen analyysi tukee seuraavia:
- jäljitettävyys;
- vertailu;
- laadunvalvonta;
- poikkeamien tutkiminen.
Viaalissa olevan eränumeron on siksi vastattava analyysitodistuksessa olevaa numeroa.
Puhtaus ja stabiilius
Korkea alkupuhtaus ei takaa, että se säilyy pitkäaikaisen varastoinnin aikana.
Mahdollisia hajoamisprosesseja ovat:
- hapettuminen;
- hydrolyysi;
- deamidaatio;
- aggregaatio.
Nopeuteen vaikuttavat:
- temperatuur;
- lämpötila;
- kosteus;
- valo;
- peptidin tarkka määrä;
- happi;
pakkaus.
Stabiilisuustutkimusta voidaan käyttää kromatografisen profiilin muutosten seuraamiseen ajan kuluessa.
Tieteelliset rajoitukset
Mikään yksittäinen analyysimenetelmä ei anna itsenäisesti täydellistä kuvaa peptidien laadusta.
HPLC voi antaa tärkeää tietoa kromatografisesta puhtaudesta, mutta sillä on rajoituksensa.
- HPLC-prosenttiluku ei automaattisesti todista:
- identiteetti;
- peptidin tarkka määrä;
- aminohapposekvenssi;
- steriiliys;
- endotoksiinipitoisuus;
- biologinen aktiivisuus;
pitkäaikainen stabiilisuus.
Siksi käytetään useita analyysimenetelmiä yhdessä.
- Täydellinen laadunarviointi voi koostua seuraavista:
- Laajemman laatunäkemyksen saamiseksi HPLC-tulokset on yhdistettävä muihin tietoihin, kuten:
- HPLC;
- kvantitatiivinen analyysi;
- kosteusanalyysi;
- stabiilisuustutkimus;
lisää tuotekohtaisia testejä.
Yhteenveto
Peptidien puhtaus on tärkeä laatumuuttuja, mutta HPLC-prosenttiluku on tulkittava oikein.
99 %:n arvo tarkoittaa yleensä, että noin 99 % integroidusta kromatografisesta signaalista on kohdistettu pääpiikille.
- Se ei automaattisesti tarkoita, että:
- 99 % injektiopullon painosta koostuu peptidistä;
- identiteetti on täysin vahvistettu;
- ilmoitettu määrä on oikea;
- materiaali on steriili;
kaikki mahdolliset epäpuhtaudet on suljettu pois.
- Laajemman laatunäkemyksen saamiseksi HPLC-tulokset on yhdistettävä muihin tietoihin, kuten:
- massaspektrometria;
- kvantitatiivinen analyysi;
- säilytystiedot;
- stabiilisuustutkimus.
Peptidien laatu koostuu siksi useammasta kuin yhdestä prosenttiluvusta.
Tutkimusvastuuvapauslauseke
Peptideran tutkimuspeptidejä tarjotaan yksinomaan Research Use Only (RUO) -käyttöön, ja ne on tarkoitettu laboratoriotutkimukseen ja analyyttisiin sovelluksiin.
Ei tarkoitettu ihmisille tai eläimille nautittavaksi, diagnostiseen käyttöön, terapeuttiseen käyttöön tai itse annosteltavaksi.
Luokka:
Peptiditieto ja laadunvalvonta
Aiheeseen liittyvät Peptidera-tuotteet:
Lyofilisoidut tutkimuspeptidit, joissa on erätunniste ja saatavilla olevat analyyttiset laatutiedot
Aiheeseen liittyvät sisäiset blogit:
- PB-0227 — Lyofilisoidut peptidit ja lyofilisaatio
- PB-0228 — Peptidipullot ja pakkausten eheys
- PB-0229 — Eränumerot ja jäljitettävyys
- Mikä on Certificate of Analysis?
- Miten tutkimuspeptidejä testataan analyyttisesti?
Sisäiset linkkiehdotukset:
- Linkki PB-0229-sivulle eräkohtaisesta analyysistä
- Linkki analyysitodistuksia käsittelevälle COA-sivulle
- Linkki PB-0227-sivulle stabiilisuudesta ja hajoamisesta
- Linkki tutkimuspeptidien kokoelmaan
- Linkki riippumattomia laboratoriotestejä käsittelevälle sivulle
Kuvatiedoston nimi:PB-0230-peptidezuiverheid-hplc-analyse.jpg