Analyse des acides aminés dans les peptides expliquée
Analyse des acides aminés des peptides : composition et quantification expliquées
Les peptides sont constitués de chaînes d’acides aminés. La séquence de ces acides aminés détermine une grande partie des propriétés chimiques et structurelles d’un peptide.
Dans le cadre du contrôle qualité, des techniques telles que la HPLC et la spectrométrie de masse sont souvent utilisées pour évaluer la pureté et la masse moléculaire. Une méthode d’analyse complémentaire est l’analyse des acides aminés, souvent abrégée en AAA.
L’analyse des acides aminés peut être utilisée pour étudier :
- quels acides aminés sont présents dans un échantillon ;
- comment les rapports d’acides aminés mesurés correspondent à la composition attendue ;
- quelle quantité de peptide est présente ;
- si la composition en acides aminés correspond au peptide théorique ;
- comment la teneur nette en peptide peut être calculée.
La méthode fonctionne différemment de la HPLC et de la spectrométrie de masse. Dans l’analyse classique des acides aminés, la chaîne peptidique est d’abord décomposée en acides aminés individuels. Ceux-ci sont ensuite séparés, détectés et quantifiés.
L’analyse des acides aminés peut fournir des informations précieuses, mais elle présente également des limites. Au cours de la dégradation, certains acides aminés peuvent être partiellement modifiés ou perdus. Les résultats doivent donc toujours être interprétés dans le contexte de la méthode utilisée.
Qu’est-ce que l’analyse des acides aminés ?
L’analyse des acides aminés est une technique de laboratoire qui permet d’étudier la composition en acides aminés d’un échantillon.
Une analyse classique comporte généralement les étapes suivantes :
- préparation de l’échantillon ;
- hydrolyse de la chaîne peptidique ;
- libération des acides aminés individuels ;
- séparation des acides aminés ;
- détection et quantification ;
- comparaison avec la composition attendue.
Le résultat peut être exprimé sous forme de :
- quantité de chaque acide aminé ;
- rapport molaire ;
- concentration massique ;
- profil en acides aminés ;
- teneur calculée en peptide.
Qu’est-ce que l’hydrolyse ?
L’hydrolyse est un processus chimique au cours duquel les liaisons sont rompues à l’aide d’eau.
Lors de l’analyse des acides aminés, les liaisons peptidiques sont rompues afin de libérer les acides aminés individuels.
L’hydrolyse acide est une méthode couramment utilisée.
L’échantillon est alors exposé pendant une période contrôlée aux conditions suivantes :
- acide fort ;
- température élevée ;
- conditions contrôlées.
Après l’hydrolyse, la chaîne peptidique d’origine n’existe plus sous forme de molécule intacte.
Les acides aminés libérés peuvent ensuite être analysés individuellement.
Pourquoi la chaîne peptidique est-elle décomposée ?
Un peptide intact peut contenir des dizaines de résidus d’acides aminés différents.
En rompant la chaîne, il est possible de mesurer la quantité totale de chaque acide aminé.
Supposons qu’un peptide théorique contienne :
- quatre résidus d’alanine ;
- deux résidus de glycine ;
- trois résidus de leucine ;
- un résidu de tyrosine.
Après hydrolyse, il est possible de vérifier si les proportions mesurées correspondent approximativement à cette composition théorique.
Cela contribue à l’évaluation de la composition en acides aminés.
Quelle est la différence entre la composition en acides aminés et la séquence des acides aminés ?
L’analyse des acides aminés mesure principalement quels acides aminés sont présents et en quelle quantité.
La méthode ne détermine pas automatiquement l’ordre exact.
Deux peptides différents peuvent avoir la même composition en acides aminés, mais un ordre différent.
Par exemple :
- Ala-Gly-Leu ;
- Leu-Gly-Ala.
Les deux contiennent :
- une alanine ;
- une glycine ;
- une leucine.
Pourtant, la séquence est différente.
D’autres techniques sont nécessaires pour l’étude de la séquence, telles que :
- spectrométrie de masse en tandem ;
- analyse des fragments ;
- méthodes de séquençage spécifiques.
L’analyse des acides aminés peut-elle confirmer l’identité ?
L’analyse des acides aminés peut étayer la composition attendue.
Lorsque le profil d’acides aminés mesuré s’écarte fortement de la composition théorique, cela peut justifier des recherches supplémentaires.
Cependant, un profil concordant ne prouve pas à lui seul que la séquence exacte des acides aminés est correcte.
Pour une évaluation plus large de l’identité, les éléments suivants peuvent être combinés :
- masse moléculaire ;
- LC-MS ;
- MS/MS ;
- analyse des acides aminés ;
- données chromatographiques.
Comment les acides aminés sont-ils séparés ?
Après hydrolyse, l’échantillon contient un mélange d’acides aminés libres.
Ils doivent être séparés analytiquement les uns des autres.
Les techniques possibles sont les suivantes :
- chromatographie d’échange d’ions ;
- HPLC ;
- UPLC ;
- électrophorèse capillaire.
La technique choisie dépend des éléments suivants :
- sensibilité souhaitée ;
- méthode de laboratoire ;
- type d’échantillon ;
- précision requise.
Qu’est-ce que la dérivatisation ?
De nombreux acides aminés sont difficilement détectables sans traitement supplémentaire.
Ils peuvent donc être liés chimiquement à un groupe détectable.
C’est ce que l’on appelle la dérivatisation.
La dérivatisation peut avoir lieu :
- avant la séparation chromatographique ;
- après la séparation chromatographique.
Les dérivés formés peuvent être mieux mesurés, par exemple, avec :
- détection UV ;
- détection par fluorescence ;
- spectrométrie de masse.
Dérivatisation précolonne
Lors de la dérivatisation précolonne, les acides aminés sont marqués avant la séparation chromatographique.
Les dérivés formés sont ensuite séparés au moyen d’une colonne.
Les avantages possibles sont les suivants :
- sensibilité élevée ;
- détection par fluorescence adaptée ;
- analyse de plusieurs acides aminés.
La réaction doit être reproductible.
Une dérivatisation incomplète peut influencer la quantification.
Dérivatisation post-colonne
Lors de la dérivatisation post-colonne, les acides aminés sont d’abord séparés.
Après la colonne, ils réagissent avec un réactif de détection.
L’analyse à la ninhydrine en est un exemple connu.
Les produits de réaction formés peuvent ensuite être mesurés optiquement.
Comment la quantité d’acides aminés est-elle déterminée ?
Des étalons de référence sont utilisés pour la quantification.
Les solutions étalons contiennent des quantités connues d’acides aminés.
Ils sont mesurés afin d’établir une relation entre :
- concentration ;
- signal du détecteur.
L’échantillon inconnu est ensuite mesuré.
Les données d’étalonnage permettent de calculer la quantité de chaque acide aminé.
Qu’est-ce qu’un étalon interne ?
Un étalon interne est une substance connue ajoutée aux échantillons et aux solutions d’étalonnage.
Il peut aider à corriger les variations lors de :
- préparation de l’échantillon ;
- injection ;
- dérivatisation ;
- analyse.
L’étalon interne doit pouvoir être bien distingué analytiquement des acides aminés étudiés.
Comment l’analyse des acides aminés permet-elle de déterminer la teneur en peptides ?
Lorsque la composition en acides aminés d’un peptide est connue, certains acides aminés peuvent être utilisés pour calculer la quantité de peptide.
Supposons que chaque chaîne peptidique contienne exactement quatre résidus d’alanine.
Lorsque la quantité totale d’alanine est mesurée, il est possible d’en estimer le nombre de chaînes peptidiques présentes.
Le calcul tient compte des éléments suivants :
- nombre de résidus par peptide ;
- masse moléculaire ;
- quantité mesurée d’acides aminés ;
- méthode d’analyse.
Cela peut être utilisé pour un dosage quantitatif des peptides.
Pourquoi n’utilise-t-on pas toujours tous les acides aminés ?
Tous les acides aminés ne conviennent pas aussi bien à la quantification.
Certains acides aminés peuvent, au cours de l’hydrolyse :
- être partiellement dégradés ;
- subir des modifications chimiques ;
- être libérés de manière incomplète ;
- être mesurés de manière fiable.
C’est pourquoi on sélectionne souvent des acides aminés stables.
Le choix dépend de la séquence peptidique et de la méthode d’analyse.
Quels acides aminés peuvent changer au cours de l’hydrolyse ?
L’hydrolyse acide peut avoir différents effets.
Tryptophane
Le tryptophane peut être largement dégradé lors d’une hydrolyse acide standard.
Des méthodes adaptées sont donc nécessaires lorsque le tryptophane doit être mesuré spécifiquement.
Asparagine
L’asparagine peut être convertie en aspartate pendant l’hydrolyse.
Ainsi, l’asparagine et l’aspartate ne sont pas toujours rapportés séparément lors d’une analyse classique.
Glutamine
La glutamine peut être convertie en glutamate.
Cela permet de représenter conjointement la glutamine et le glutamate.
Sérine
La sérine peut être partiellement perdue lors d’une hydrolyse prolongée.
Thréonine
La thréonine peut également se dégrader partiellement.
Cystéine
La cystéine peut subir des modifications oxydatives.
Pour une analyse fiable, une oxydation préalable ou une méthode adaptée peut être nécessaire.
Pourquoi la durée d’hydrolyse est-elle importante ?
Les liaisons peptidiques doivent être suffisamment hydrolysées.
Une hydrolyse trop courte peut entraîner :
- dégradation incomplète ;
- des valeurs mesurées d’acides aminés trop faibles.
Une hydrolyse trop longue peut entraîner :
- dégradation supplémentaire des acides aminés sensibles ;
- perte lors de la mesure.
La durée et la température d’hydrolyse sont donc contrôlées.
Plusieurs durées d’hydrolyse sont parfois utilisées pour étudier les pertes ou la dégradation incomplète.
Qu’est-ce qu’un rapport molaire ?
Un rapport molaire décrit les nombres relatifs d’acides aminés.
Supposons qu’un peptide contienne théoriquement :
- deux alanines ;
- une glycine ;
- trois leucines.
Le rapport molaire théorique est :
2 : 1 : 3
Après l’analyse, les valeurs mesurées peuvent être normalisées.
Lorsque la proportion est proche de la valeur théorique, cela confirme la composition attendue en acides aminés.
De faibles écarts peuvent être dus à :
- incertitude de mesure ;
- perte lors de l’hydrolyse ;
- dérivatisation ;
- intégration des pics chromatographiques.
Que signifie la normalisation ?
Lors de la normalisation, les valeurs mesurées des acides aminés sont converties en proportions relatives.
Un acide aminé approprié peut être utilisé comme référence.
Cela permet de comparer le profil mesuré à la composition théorique.
La normalisation est utile pour l’étude de la composition, mais ne fournit pas automatiquement la quantité absolue de peptides.
Analyse des acides aminés versus pureté HPLC
La pureté HPLC et l’analyse des acides aminés mesurent des propriétés différentes.
La pureté HPLC examine généralement :
- pic chromatographique principal ;
- quantité relative des pics secondaires.
L’analyse des acides aminés examine :
- composition en acides aminés ;
- quantité d’acides aminés sélectionnés ;
- quantification éventuelle des peptides.
Une pureté HPLC élevée ne prouve pas automatiquement que la composition en acides aminés est correcte.
Une composition en acides aminés conforme ne prouve pas automatiquement l’absence d’impuretés liées aux peptides.
Les techniques sont complémentaires.
Analyse des acides aminés versus spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse examine le rapport masse/charge des molécules.
Une mesure de la masse intacte peut confirmer que la masse moléculaire correspond à la valeur théorique.
L’analyse des acides aminés examine la quantité et la proportion des acides aminés après hydrolyse.
Les deux techniques présentent des points forts différents.
Une combinaison peut fournir davantage d’informations sur :
- identité ;
- composition ;
- teneur en peptide.
Analyse des acides aminés versus dosage du peptide
L’analyse des acides aminés peut elle-même être utilisée comme méthode de dosage.
Un dosage du peptide décrit l’objectif suivant :
déterminer la quantité de peptide.
L’analyse des acides aminés est l’une des techniques permettant d’atteindre cet objectif.
D’autres méthodes d’analyse possibles sont :
- HPLC quantitative ;
- spectrophotométrie UV ;
- quantification par LC-MS ;
- bilan massique.
Quelle est l’influence des contre-ions ?
Les contre-ions tels que :
- acétate ;
- chlorure ;
- TFA ;
contribuent à la masse totale du matériau lyophilisé.
Lors de l’analyse des acides aminés, ce sont principalement les composants en acides aminés du peptide qui sont examinés.
La méthode peut ainsi aider à distinguer :
- masse totale de matière ;
- quantité réelle de peptide.
Des analyses complémentaires peuvent être nécessaires pour établir un bilan massique complet.
Quelle est l’influence de l’humidité résiduelle ?
L’humidité résiduelle contribue au poids total, mais pas à la composition en acides aminés.
Lors du calcul de la teneur nette en peptide, l’analyse de l’humidité peut fournir des informations complémentaires.
Un bilan massique détaillé peut comprendre :
- teneur en peptide ;
- teneur en eau ;
- teneur en contre-ions ;
- autres composants.
L’analyse des acides aminés peut-elle révéler des contaminations ?
Certains signaux d’acides aminés atypiques peuvent indiquer la présence de composants inattendus.
Cependant, la méthode n’est pas conçue pour détecter chaque contamination possible.
D’autres techniques peuvent être nécessaires pour :
- impuretés organiques ;
- solvants résiduels ;
- métaux ;
- contamination microbiologique ;
- endotoxines.
Que peut contenir un COA ?
Un certificat d’analyse peut contenir des informations telles que :
- test : analyse des acides aminés ;
- méthode d’analyse ;
- rapports d’acides aminés mesurés ;
- rapports théoriques ;
- teneur en peptide calculée ;
- date du test ;
- numéro de lot.
Tous les COA ne contiennent pas d’analyse des acides aminés.
Lorsque seuls la HPLC et la MS ont été réalisées, il n’est pas possible d’en déduire une quantification complète des acides aminés.
Pourquoi le lien avec le lot est-il important ?
Une analyse des acides aminés doit être associée au lot examiné.
Les données importantes sont :
- numéro de lot ;
- nom du produit ;
- date d’analyse ;
- laboratoire ;
- méthode d’analyse.
Un rapport d’analyse sans lien clair avec un lot a une valeur moindre pour la traçabilité.
Que signifie l’incertitude de mesure ?
Toute analyse quantitative comporte une incertitude de mesure.
Lors de l’analyse des acides aminés, les sources de variation peuvent être :
- préparation de l’échantillon ;
- hydrolyse ;
- perte d’acides aminés ;
- dérivatisation ;
- étalonnage ;
- séparation chromatographique ;
- intégration des pics.
Les résultats ne doivent donc pas être considérés comme absolument exempts d’erreurs.
Pourquoi la validation de la méthode est-elle importante ?
Une méthode doit être adaptée à l’objectif visé.
En analyse quantitative des acides aminés, les caractéristiques de validation pertinentes peuvent inclure :
- exactitude ;
- précision ;
- linéarité ;
- spécificité ;
- plage de mesure ;
- robustesse ;
- reproductibilité.
Une méthode adaptée à l’établissement d’un profil qualitatif des acides aminés ne suffit pas automatiquement à quantifier précisément un peptide.
Limites scientifiques
L’analyse des acides aminés présente des limites importantes.
La méthode ne détermine pas à elle seule :
- séquence exacte des acides aminés ;
- masse moléculaire ;
- pureté HPLC ;
- structure tridimensionnelle ;
- activité biologique ;
- stérilité ;
- teneur en endotoxines.
En outre, certains acides aminés peuvent se modifier pendant l’hydrolyse.
Pour une évaluation globale de la qualité, plusieurs techniques analytiques doivent être combinées.
Résumé
L’analyse des acides aminés examine la composition et la quantité des acides aminés dans un peptide.
Dans l’analyse classique, la chaîne peptidique est d’abord décomposée par hydrolyse.
Ensuite, les acides aminés sont :
- séparés ;
- détectés ;
- quantifiés ;
- comparée à la composition théorique.
L’analyse des acides aminés peut être utilisée pour :
- contrôle de la composition en acides aminés ;
- évaluation des rapports molaires ;
- quantification de la teneur en peptide ;
- confirmation de l’identité.
La méthode présente des limites, car certains acides aminés peuvent se modifier pendant l’hydrolyse.
C’est pourquoi l’analyse des acides aminés est de préférence combinée avec :
- HPLC ;
- LC-MS ;
- MS/MS ;
- dosage du peptide ;
- analyse de l’humidité résiduelle ;
- analyse des contre-ions.
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