Spectrométrie de masse appliquée aux peptides expliquée

Spectrométrie de masse des peptides : comment étudie-t-on l’identité moléculaire ?

Lors du contrôle qualité des peptides de recherche, plusieurs techniques analytiques sont souvent combinées. La HPLC peut fournir des informations sur la pureté chromatographique, mais un pic principal élevé ne prouve pas automatiquement que le peptide approprié est présent.

Pour approfondir l’étude de l’identité moléculaire, on utilise souvent la spectrométrie de masse.

La spectrométrie de masse, généralement abrégée en MS, est une technique analytique qui mesure le rapport masse/charge de molécules ionisées. Lors de l’analyse des peptides, la masse moléculaire mesurée peut être comparée à la masse théorique attendue de la séquence d’acides aminés.

Lorsque ces valeurs correspondent, cela étaye l’identification du peptide étudié. Toutefois, la spectrométrie de masse ne fournit pas non plus à elle seule une image complète de la qualité.

Dans cet article, nous expliquons comment fonctionne la spectrométrie de masse, pourquoi les peptides peuvent produire plusieurs signaux de masse et comment les résultats de MS sont interprétés avec la HPLC et d’autres méthodes d’analyse.

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Qu’est-ce que la spectrométrie de masse ?

La spectrométrie de masse est une technique analytique qui transforme les molécules en particules chargées, autrement dit des ions.

Ces ions sont ensuite séparés et mesurés en fonction de leur rapport masse/charge.

Ce rapport est exprimé comme suit :

m/z

Ici :

• m pour la masse ;
• z pour la charge électrique.

Un spectromètre de masse ne mesure donc pas toujours directement la masse moléculaire complète. L’instrument mesure le rapport entre la masse et la charge.

Pour les molécules plus grandes, notamment de nombreux peptides, plusieurs charges peuvent apparaître. Ainsi, un même peptide peut être visible à différents endroits du spectre de masse.

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Pourquoi utilise-t-on la spectrométrie de masse pour l’analyse des peptides ?

Un peptide est constitué d’une séquence spécifique d’acides aminés.

Chaque combinaison d’acides aminés possède une masse moléculaire théoriquement calculable.

La spectrométrie de masse peut être utilisée pour déterminer si la masse mesurée correspond à cette valeur théorique.

L’analyse MS peut contribuer à :

• confirmation de l’identité moléculaire ;
• comparaison avec la masse moléculaire théorique ;
• détection de certaines modifications chimiques ;
• analyse des produits de dégradation ;
• étude des variantes peptidiques ;
• comparaison entre les lots de production.

Une masse correspondante étaye l’identité d’un peptide.

Le résultat doit toutefois toujours être évalué en association avec la méthode d’analyse et d’autres données de qualité.

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Quelle est la masse moléculaire théorique ?

La masse moléculaire théorique est calculée sur la base de :

• la séquence d’acides aminés ;
• le nombre d’acides aminés ;
• d’éventuelles modifications chimiques ;
• la forme moléculaire ;
• groupes terminaux spécifiques.

Lorsque les acides aminés forment une chaîne peptidique, des liaisons peptidiques se forment.

Lors de la formation de chaque liaison peptidique, une molécule d’eau est éliminée. La masse d’un peptide complet n’est donc pas simplement la somme des masses de tous les acides aminés individuels.

Les modifications peuvent également influencer la masse.

Exemples :

• amidation ;
• acétylation ;
• phosphorylation ;
• oxydation ;
• ajout de chaînes d’acides gras ;
• formation de ponts disulfure.

La masse théorique doit donc être calculée pour la structure moléculaire exacte.

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Que signifie le poids moléculaire ?

Les termes masse moléculaire et poids moléculaire sont souvent employés indifféremment.

Dans les rapports de laboratoire, la valeur est généralement exprimée en :

• dalton, abrégé Da ;
• kilodalton, abrégé kDa.

Un dalton correspond approximativement à la masse d’un atome d’hydrogène.

Un peptide ayant une masse moléculaire de 3 000 Da a donc une masse d’environ 3 kDa.

La masse moléculaire des peptides peut varier considérablement en fonction de :

• longueur de la chaîne ;
• composition en acides aminés ;
• modifications chimiques.

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Comment fonctionne un spectromètre de masse ?

Un spectromètre de masse se compose généralement de plusieurs éléments.

1. Introduction de l’échantillon

Le peptide est d’abord préparé, puis introduit dans l’instrument.

La préparation de l’échantillon peut avoir une influence sur :

• intensité du signal ;
• détectabilité ;
• formation des ions ;
• signaux de fond.

2. Ionisation

Les molécules sont chargées électriquement.

Les techniques couramment utilisées pour l’analyse des peptides sont :

• ionisation par électronébulisation ;
• désorption-ionisation laser assistée par matrice.

3. Analyse de masse

Les ions formés sont séparés selon leur rapport masse/charge.

4. Détection

Le détecteur enregistre les ions.

5. Traitement des données

Les signaux mesurés sont convertis en un spectre de masse.

Ce spectre contient des pics correspondant aux ions détectés.

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Qu’est-ce que l’ionisation par électronébulisation ?

L’ionisation par électronébulisation, abrégée ESI, est une technique d’ionisation couramment utilisée pour les peptides.

Lors de l’ESI, un échantillon liquide est conduit à travers une fine ouverture tandis qu’une tension électrique est appliquée.

Des gouttelettes électriquement chargées se forment ainsi.

Lorsque le solvant s’évapore, des molécules chargées subsistent.

Une caractéristique importante de l’ESI est que les molécules plus grandes peuvent recevoir plusieurs charges électriques.

Un peptide peut par exemple se présenter sous la forme :

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Ici, M représente la masse moléculaire du peptide.

Plusieurs charges génèrent différents signaux m/z pour la même molécule.

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Pourquoi un peptide présente-t-il plusieurs pics ?

Lorsqu’un peptide capte plusieurs protons, différentes formes de charge apparaissent.

Supposons qu’un peptide ait une masse moléculaire d’environ 3 000 Da.

Les signaux possibles sont alors environ :

• une charge positive : m/z autour de 3.001 ;
• deux charges positives : m/z autour de 1.501 ;
• trois charges positives : m/z autour de 1.001.

Ces signaux peuvent tous appartenir au même peptide.

Le logiciel peut utiliser cette distribution de charges pour calculer la masse moléculaire d’origine.

Ce processus est appelé déconvolution.

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Qu’est-ce qu’un spectre de masse déconvolué ?

Une mesure ESI brute peut contenir plusieurs pics de charge.

Cela peut rendre l’interprétation complexe.

À l’aide d’un logiciel de déconvolution, les différentes formes chargées sont converties en une masse moléculaire estimée unique.

Le spectre déconvolué peut ainsi être comparé plus facilement à :

• la masse théorique ;
• un étalon de référence ;
• spécifications du produit.

La qualité du calcul dépend des éléments suivants :

• intensité du signal ;
• résolution ;
• bruit de fond ;
• réglages du logiciel ;
• présence de composants qui se chevauchent.

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Qu’est-ce que la MALDI ?

La désorption-ionisation laser assistée par matrice, abrégée MALDI, est une autre technique d’ionisation.

Le peptide est mélangé à un matériau matriciel et déposé sur une plaque d’analyse.

Un laser active la matrice, ce qui génère des ions peptidiques.

La MALDI produit souvent principalement des ions portant une seule charge.

Le spectre peut ainsi sembler plus simple qu’un spectre ESI.

La MALDI est régulièrement combinée à un analyseur de masse à temps de vol.

Cette combinaison est appelée :

MALDI-TOF

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Qu’est-ce que le temps de vol ?

Dans un analyseur de masse à temps de vol, les ions sont accélérés par un champ électrique.

Ils se déplacent ensuite dans un tube de mesure.

Les ions présentant un rapport masse/charge plus faible atteignent généralement le détecteur plus rapidement que ceux ayant un rapport plus élevé.

Le temps de vol est utilisé pour calculer la valeur m/z.

Les systèmes TOF peuvent être utilisés pour :

• identification des peptides ;
• détermination de la masse ;
• comparaison de variantes moléculaires.

La précision finale dépend de l’étalonnage, des réglages de l’instrument et de la préparation de l’échantillon.

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Qu’est-ce que la LC-MS ?

La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse, abrégée LC-MS, combine la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse.

Les composants sont d’abord séparés par chromatographie.

Les signaux individuels sont ensuite analysés par le spectromètre de masse.

La LC-MS peut combiner des informations sur :

• temps de rétention ;
• profil chromatographique ;
• masse moléculaire ;
• impuretés éventuelles ;
• produits de dégradation.

La LC-MS peut ainsi fournir davantage d’informations qu’une analyse HPLC ou MS distincte.

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Quelle est la différence entre la HPLC et la spectrométrie de masse ?

La HPLC et la spectrométrie de masse répondent à des questions analytiques différentes.

HPLC

La HPLC peut fournir des informations sur :

• pureté chromatographique ;
• quantité relative des composants détectés ;
• temps de rétention ;
• modifications du profil chromatographique.

Spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse peut fournir des informations sur :

• masse moléculaire ;
• identité possible ;
• modifications chimiques ;
• certains produits de dégradation.

Une comparaison simplifiée :

C’est pourquoi les deux techniques sont souvent combinées.

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La même masse moléculaire peut-elle être observée pour différents peptides ?

Oui.

Différentes séquences d’acides aminés peuvent avoir la même masse totale ou une masse totale presque identique.

On les appelle parfois des structures isobares.

Une masse correspondante ne prouve donc pas toujours que la séquence complète d’acides aminés est correcte.

Pour une identification plus approfondie, des techniques complémentaires peuvent être nécessaires, telles que :

• spectrométrie de masse en tandem ;
• analyse de fragmentation ;
• analyse des acides aminés ;
• analyse de séquence ;
• comparaison avec un étalon de référence.

La méthode d’analyse nécessaire dépend du niveau de certitude recherché.

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Qu’est-ce que la spectrométrie de masse en tandem ?

La spectrométrie de masse en tandem s’écrit généralement :

MS/MS

Pendant la MS/MS, un ion peptidique sélectionné est fragmenté davantage.

Les fragments formés sont ensuite mesurés à nouveau.

Le profil de fragmentation peut fournir des informations sur :

• séquence d’acides aminés ;
• localisation des modifications ;
• identité du peptide ;
• structure des produits de dégradation.

La MS/MS peut ainsi fournir davantage d’informations structurelles que la seule masse moléculaire intacte.

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Que sont les fragments peptidiques ?

Lorsqu’une chaîne peptidique se brise à des endroits précis pendant la MS/MS, des ions fragments se forment.

Les types de fragments couramment utilisés sont :

• ions b ;
• ions y.

Les masses de ces fragments peuvent être utilisées pour reconstituer certaines parties de la séquence d’acides aminés.

L’interprétation peut être complexe.

Tous les peptides ne se fragmentent pas de la même manière.

Les facteurs susceptibles d’avoir une influence sont :

• composition en acides aminés ;
• charge électrique ;
• taille du peptide ;
• méthode de fragmentation ;
• modifications chimiques.

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La spectrométrie de masse peut-elle détecter l’oxydation ?

Certaines modifications oxydatives provoquent une variation de masse mesurable.

Par exemple, l’ajout d’un atome d’oxygène entraîne souvent une augmentation de masse d’environ 16 Da.

La spectrométrie de masse peut ainsi aider à identifier certains produits d’oxydation.

La détection dépend de :

• concentration ;
• résolution de l’instrument ;
• méthode d’analyse ;
• séparation des composants.

Toute modification oxydative ne peut pas être entièrement localisée uniquement à partir d’un seul signal de masse.

Une analyse de fragmentation complémentaire peut être nécessaire à cette fin.

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La spectrométrie de masse peut-elle déterminer la quantité de peptide ?

Pas automatiquement.

L’intensité d’un signal de masse est influencée par :

• efficacité d’ionisation ;
• propriétés moléculaires ;
• solvant ;
• paramètres de l’instrument ;
• présence d’autres composants.

Par conséquent, un signal deux fois plus intense ne signifie pas automatiquement que la quantité de peptide est deux fois plus élevée.

Une quantification fiable nécessite des méthodes validées et des étalons appropriés.

Les techniques possibles sont les suivantes :

• LC-MS quantitative ;
• étalons internes ;
• références marquées isotopiquement ;
• dosages HPLC étalonnés.

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La spectrométrie de masse peut-elle démontrer la stérilité ?

Non.

La spectrométrie de masse destinée à identifier un peptide n’est pas un test de stérilité.

Le résultat ne fournit pas d’informations directes sur :

• bactéries ;
• champignons ;
• croissance microbiologique ;
• stérilité du produit.

La stérilité nécessite des méthodes d’analyse microbiologique spécifiques.

Les endotoxines ne sont pas non plus automatiquement déterminées lors d’une analyse standard de peptide par spectrométrie de masse.

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La spectrométrie de masse peut-elle mesurer les endotoxines ?

Pas au moyen d’une analyse d’identité standard.

Les endotoxines sont des composants bactériens complexes.

Des méthodes spécifiques sont utilisées pour la recherche d’endotoxines, telles que :

• test au lysat d’amébocytes de Limulus ;
• méthodes à facteur C recombinant.

Par conséquent, un spectre de masse correct d’un peptide ne prouve pas que le matériau présente une faible teneur en endotoxines.

L’identité, la pureté, la stérilité et les endotoxines sont des paramètres de qualité distincts.

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Pourquoi les résultats de laboratoire peuvent-ils différer ?

Différents laboratoires peuvent rapporter des valeurs de masse légèrement différentes.

Les causes possibles sont les suivantes :

• type d’instrument ;
• étalonnage ;
• méthode d’ionisation ;
• préparation de l’échantillon ;
• adduits salins ;
• logiciel utilisé ;
• résolution ;
• méthode d’interprétation.

De faibles écarts ne signifient pas automatiquement qu’un résultat est incorrect.

La valeur mesurée doit être évaluée dans le contexte de :

• exactitude de l’instrument ;
• forme moléculaire attendue ;
• méthode d’analyse utilisée.

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Que sont les adduits ?

Au cours de la spectrométrie de masse, les ions peptidiques peuvent se lier à d’autres particules chargées.

Exemples :

• sodium ;
• potassium ;
• ammonium.

Cela peut entraîner l’apparition de pics supplémentaires.

Par exemple, un adduit de sodium a une masse différente de celle d’un ion peptidique simplement protoné.

Les adduits ne signifient pas automatiquement qu’un autre peptide est présent.

L’interprétation nécessite de connaître :

• préparation de l’échantillon ;
• tampons utilisés ;
• formes ioniques attendues.

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Quelles informations doivent figurer dans un rapport de spectrométrie de masse ?

Un rapport d’analyse professionnel peut notamment contenir :

• nom du peptide ;
• numéro de lot ou de série ;
• masse moléculaire théorique ;
• masse moléculaire mesurée ;
• méthode d’ionisation ;
• type de spectromètre de masse ;
• spectre de masse ;
• date d’analyse ;
• nom du laboratoire.

Pour une analyse plus approfondie, les éléments suivants peuvent également être indiqués :

• plage de mesure ;
• résolution ;
• exactitude de masse ;
• données de fragmentation ;
• logiciel utilisé.

De benodigde rapportage hangt af van het onderzoeksdoel.

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Les informations à fournir dépendent de l’objectif de la recherche.

Spectrométrie de masse et contrôle des lots

Chaque lot de production peut être examiné séparément.

• L’analyse par spectrométrie de masse spécifique au lot permet de prendre en charge :
• contrôle de l’identité ;
• comparaison entre les lots ;
• traçabilité ;

recherche des écarts.

Le numéro de lot indiqué sur le rapport d’analyse doit correspondre à l’identification figurant sur le flacon.

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Un résultat de spectrométrie de masse sans lien clair avec un lot précis a une valeur limitée pour la traçabilité.

Limites scientifiques

La spectrométrie de masse est une technique analytique puissante, mais ne constitue pas une évaluation complète de la qualité.

• Une masse moléculaire concordante ne prouve pas automatiquement :
• séquence complète d’acides aminés ;
• pureté chromatographique élevée ;
• stérilité ;
• quantité correcte de peptide ;
• faible teneur en endotoxines ;
• activité biologique ;

stabilité à long terme.

• Pour une évaluation plus large, plusieurs méthodes peuvent être nécessaires :
• LC-MS ;
• HPLC ;
• MS/MS ;
• dosage quantitatif ;
• analyse de l’humidité ;
• des tests supplémentaires spécifiques au produit.

Les résultats doivent être interprétés conjointement.

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Résumé

La spectrométrie de masse est utilisée pour étudier la masse moléculaire des peptides de recherche.

La technique mesure le rapport masse/charge des molécules ionisées.

Lors de l’analyse des peptides, la masse mesurée peut être comparée à la masse théorique attendue.

Une concordance étaye l’identification moléculaire.

Les principales techniques analytiques sont :

• ESI-MS ;
• MALDI-TOF ;
• LC-MS ;
• MS/MS.

Cependant, la spectrométrie de masse ne fournit pas automatiquement d’informations sur :

• quantité exacte ;
• pureté chromatographique ;
• stérilité ;
• endotoxines ;
• activité biologique.

C’est pourquoi la spectrométrie de masse est souvent combinée à la HPLC et à des analyses de qualité complémentaires.

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Avertissement concernant la recherche

Les peptides de recherche de Peptidera sont proposés exclusivement pour Research Use Only (RUO) et sont destinés à la recherche en laboratoire et aux applications analytiques.

Non destiné à la consommation humaine ou animale, à un usage diagnostique, à une application thérapeutique ou à l’auto-administration.

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Catégorie :
Connaissances sur les peptides & contrôle qualité

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