Lire un COA de peptide : explication du certificat d'analyse
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Certificate of Analysis pour les peptides : comment lire et évaluer un COA ?
Pour les peptides destinés à la recherche, il est régulièrement fait référence à un Certificate of Analysis, généralement abrégé en COA. Ce certificat d’analyse contient des informations sur l’identité, la composition ou la qualité analytique d’un produit spécifique ou d’un lot de production spécifique.
Un COA peut contenir des données importantes, telles que :
-
le nom du peptide analysé ;
-
le numéro de lot ou de fabrication ;
-
la pureté HPLC mesurée ;
-
la masse moléculaire théorique et mesurée ;
-
les méthodes analytiques utilisées ;
-
la date à laquelle l’analyse a été effectuée.
Cependant, la présence d’un COA ne signifie pas automatiquement que tous les aspects de la qualité du peptide ont été examinés. Le contenu du certificat doit être évalué. Les méthodes analytiques utilisées, la traçabilité du lot, la date du test et l’origine du rapport sont notamment importantes.
Un chromatogramme présentant un pic principal élevé peut par exemple fournir des informations sur la pureté chromatographique, mais ne prouve pas automatiquement que la quantité de peptide dans le flacon est correcte. De même, un rapport standard de HPLC ou de spectrométrie de masse ne fournit aucune information sur la stérilité si aucun test distinct n’a été effectué à cet effet.
Dans cet article de blog, nous expliquons ce qu’est un COA de peptide, quelles informations il peut contenir et comment interpréter correctement les différents résultats d’analyse.
Qu’est-ce qu’un Certificate of Analysis ?
Un Certificate of Analysis est un document qui consigne les résultats analytiques d’un produit, d’un échantillon ou d’un lot de production.
Le document est généralement établi par :
-
le fabricant ;
-
un laboratoire interne de contrôle qualité ;
-
un laboratoire externe spécialisé ;
-
un organisme de test indépendant.
Un COA peut être utilisé pour évaluer si les propriétés mesurées correspondent aux spécifications du produit définies au préalable.
Selon l’objectif de la recherche, le certificat peut contenir des informations sur :
-
identité ;
-
pureté chromatographique ;
-
masse moléculaire ;
-
teneur en peptide ;
-
teneur en peptide ;
-
solvants résiduels ;
-
endotoxines ;
-
qualité microbiologique.
Tous les COA de peptides ne contiennent pas l’ensemble de ces analyses.
Il faut donc toujours vérifier ce qui a effectivement été testé.
Pourquoi un COA est-il important pour les peptides destinés à la recherche ?
Les peptides ne peuvent pas être évalués de manière fiable sur la seule base de leur apparence.
Une structure blanche lyophilisée ne permet pas de déterminer :
-
quel peptide est présent ;
-
quelle quantité de peptide est présente ;
-
quelle est la pureté chimique ;
-
si des produits de dégradation sont présents ;
-
si le matériau a été correctement identifié.
Les tests analytiques peuvent fournir des informations qui ne sont pas disponibles par inspection visuelle.
Un COA fournit notamment :
-
contrôle qualité ;
-
traçabilité des lots ;
-
comparaison entre les lots de production ;
-
documentation des données de recherche ;
-
l’évaluation des spécifications du produit ;
-
la reproductibilité des expériences.
La valeur d’un COA dépend de la qualité et de l’exhaustivité de l’analyse sous-jacente.
Quelles données de base doivent figurer sur un COA de peptide ?
Un certificat d’analyse utile contient idéalement suffisamment d’informations pour identifier l’échantillon analysé.
Les informations importantes sont :
Nom du produit
Le nom du peptide analysé doit être clairement indiqué.
Il est préférable d’inclure également des informations d’identification complémentaires, telles que :
-
séquence d’acides aminés ;
-
formule moléculaire ;
-
numéro CAS ;
-
masse moléculaire théorique.
Tous les peptides n’ont pas un nom de produit universellement utilisé. Des informations moléculaires complémentaires peuvent donc aider à éviter toute confusion.
Numéro de lot
Le numéro de lot relie le rapport d’analyse à un lot de production spécifique.
Le numéro figurant sur le COA doit correspondre au numéro indiqué sur :
-
le flacon ;
-
l’étiquette ;
-
l’emballage ;
-
la documentation interne du produit.
Si les numéros de lot ne correspondent pas, il est impossible d’établir de manière fiable que le certificat concerne le produit reçu.
Date d’analyse
La date d’analyse indique quand l’échantillon a été examiné.
Cette date est importante, car un résultat d’analyse décrit l’état de l’échantillon à un moment donné.
Après l’analyse, le stockage, la température, l’humidité, l’oxygène et le transport peuvent influencer la stabilité.
Méthode d’analyse utilisée
Un pourcentage sans méthode d’analyse fournit peu de contexte.
Le COA doit donc préciser clairement la technique utilisée, par exemple :
-
RP-HPLC ;
-
LC-MS ;
-
ESI-MS ;
-
MALDI-TOF ;
-
analyse des acides aminés ;
-
analyse de l’humidité par la méthode de Karl Fischer.
Chaque méthode examine d’autres caractéristiques de qualité.
Que signifie la pureté HPLC sur un COA ?
HPLC signifie High-Performance Liquid Chromatography.
Cette technique permet de séparer chromatographiquement les composants d’un échantillon dissous.
Le résultat est présenté sous la forme d’un chromatogramme.
Un chromatogramme contient généralement :
-
un axe horizontal du temps ;
-
une réponse verticale du détecteur ;
-
un pic principal ;
-
d’éventuels pics secondaires de faible intensité.
Lorsqu’un COA indique par exemple une pureté HPLC de 99 %, cela signifie généralement qu’environ 99 % du signal chromatographique intégré a été attribué au pic principal.
Cela ne signifie pas automatiquement que 99 % du poids total du flacon est constitué du peptide souhaité.
D’autres composants peuvent être présents, tels que :
-
eau ;
-
sels ;
-
contre-ions ;
-
excipients ;
-
composants qui ne sont pas mesurés par la méthode utilisée.
La pureté HPLC et la teneur réelle en peptide sont donc des paramètres de qualité différents.
Comment lire un chromatogramme HPLC ?
Lors de l’évaluation d’un chromatogramme, différents éléments peuvent être pertinents.
Temps de rétention
Le temps de rétention est le temps nécessaire à un composant pour atteindre le détecteur.
Ce temps est influencé par :
-
le type de colonne ;
-
la phase mobile ;
-
le débit ;
-
la température ;
-
les propriétés du peptide.
Un temps de rétention concordant peut contribuer à l’identification lorsqu’un étalon de référence approprié est utilisé.
Le temps de rétention seul ne prouve toutefois pas définitivement que le peptide correct est présent.
Pic principal
Le plus grand pic est généralement interprété comme le principal composant peptidique.
L’identité de ce pic doit de préférence être étayée par des données analytiques complémentaires.
Pics secondaires
Les pics plus petits peuvent avoir différentes causes.
Les explications possibles sont les suivantes :
-
variants liés à la synthèse ;
-
séquences peptidiques raccourcies ;
-
produits d’oxydation ;
-
produits de dégradation ;
-
autres composants détectés.
Tous les petits pics ne constituent pas automatiquement un problème de qualité pertinent. L’identité et la quantité doivent être examinées séparément.
Surface du pic
La surface sous un pic est utilisée pour le calcul relatif des composants chromatographiques.
Le résultat peut être influencé par :
-
paramètres d’intégration ;
-
longueur d’onde de détection ;
-
concentration de l’échantillon ;
-
méthode analytique.
C’est pourquoi un pourcentage doit toujours être interprété dans le contexte de la méthode utilisée.
Que signifie la spectrométrie de masse sur un COA ?
La spectrométrie de masse sert à mesurer le rapport masse/charge des molécules ionisées.
Lors de l’analyse d’un peptide, la masse moléculaire mesurée est comparée à la masse théorique attendue.
Un COA peut par exemple indiquer :
-
masse théorique : 3.250,7 Da ;
-
masse mesurée : 3.250,9 Da.
Une bonne concordance étaye l’identification moléculaire.
La spectrométrie de masse ne fournit toutefois pas automatiquement d’informations sur :
-
pureté chromatographique ;
-
quantité exacte de peptide ;
-
stérilité ;
-
endotoxines ;
-
activité biologique.
C’est pourquoi la HPLC et la spectrométrie de masse sont souvent combinées.
Pourquoi la HPLC et la spectrométrie de masse sont-elles complémentaires ?
La HPLC et la spectrométrie de masse répondent à des questions analytiques différentes.
La HPLC examine principalement :
-
combien de composants chromatographiques sont visibles ;
-
quelle proportion relative correspond au pic principal ;
-
si de petits pics secondaires sont présents.
La spectrométrie de masse examine principalement :
-
quelle masse moléculaire est mesurée ;
-
ou si cette masse correspond au peptide attendu ;
-
ou si certaines modifications chimiques sont détectables.
Une pureté HPLC élevée sans analyse de l’identité ne constitue pas une preuve complète que le pic principal correspond au peptide correct.
Une masse moléculaire concordante sans analyse de la pureté ne donne pas une image complète de la composition relative.
La combinaison fournit donc plus d’informations qu’une seule méthode prise isolément.
Qu’est-ce que la teneur en peptide ?
La teneur en peptide décrit la quantité de peptide véritablement présente par rapport à la quantité totale de matériau.
Cela est parfois désigné comme :
-
teneur en peptide ;
-
dosage du peptide ;
-
teneur nette en peptide.
La teneur en peptide peut différer de la pureté par HPLC.
Un produit lyophilisé peut contenir, en plus du peptide :
-
eau liée ;
-
humidité résiduelle ;
-
contre-ions ;
-
sels ;
-
excipients.
Un résultat HPLC de 99 % ne signifie donc pas automatiquement que 99 % de la masse sèche totale est constituée de peptide.
Pour une détermination quantitative, des méthodes complémentaires peuvent être nécessaires.
Qu’est-ce que l’analyse des acides aminés ?
L’analyse des acides aminés peut être utilisée pour obtenir des informations sur la composition en acides aminés ou la quantité de peptide.
Au cours de l’analyse, le peptide est généralement décomposé en acides aminés individuels.
Ceux-ci sont ensuite mesurés.
L’analyse des acides aminés peut contribuer à :
-
quantification ;
-
contrôle de la composition en acides aminés ;
-
comparaison avec la séquence théorique.
La méthode présente des limites.
Certains acides aminés peuvent se modifier ou être partiellement perdus pendant l’hydrolyse.
Les résultats doivent donc être interprétés par un spécialiste.
Que signifie la teneur en eau ?
Après la lyophilisation, une petite quantité d’humidité résiduelle peut subsister.
La teneur en eau peut avoir une influence sur :
-
stabilité ;
-
mobilité moléculaire ;
-
structure physique ;
-
vitesse de dégradation.
Une méthode couramment utilisée pour analyser l’humidité est le titrage Karl Fischer.
Cette technique peut être utilisée spécifiquement pour déterminer la teneur en eau.
Une faible teneur en humidité ne signifie pas automatiquement que la qualité globale est optimale. La quantité souhaitée d’humidité résiduelle peut varier selon la formulation peptidique.
Que sont les contre-ions ?
Lors de la production et de la purification, les peptides peuvent être présents sous forme de sel.
Les contre-ions courants sont :
-
acétate ;
-
trifluoroacétate ;
-
chlorure.
Ces ions peuvent contribuer à la masse totale du matériau lyophilisé.
La quantité de contre-ions peut dépendre de :
-
synthèse ;
-
méthode de purification ;
-
échange d’ions ;
-
formulation.
Les contre-ions ne sont pas toujours pris en compte dans un pourcentage standard de pureté par HPLC.
Que signifie un test de stérilité ?
Un test de stérilité vérifie si des micro-organismes viables sont détectés dans les conditions d’essai appliquées.
Il s’agit d’une analyse microbiologique distincte.
Un résultat HPLC ou MS ne prouve pas la stérilité.
Lorsque le certificat d’analyse (COA) mentionne uniquement :
-
pureté par HPLC ;
-
masse moléculaire ;
il n’est alors pas possible d’en tirer une conclusion sur la stérilité.
L’analyse de stérilité nécessite des méthodes spécifiques, des conditions contrôlées et un protocole d’essai approprié.
Qu’est-ce qu’un test d’endotoxines ?
Les endotoxines sont des constituants de la membrane externe de certaines bactéries à Gram négatif.
L’analyse des endotoxines constitue une analyse qualité distincte.
Les méthodes couramment utilisées sont les suivantes :
-
test LAL ;
-
test au facteur C recombinant.
Les résultats peuvent être exprimés en unités d’endotoxines, par exemple :
UE par flacon
ou :
UE par milligramme
Une faible teneur en endotoxines n’est pas synonyme de stérilité.
Un échantillon peut ne présenter aucune croissance microbiologique détectable tout en contenant des endotoxines. Inversement, un test d’endotoxines ne remplace pas une étude de stérilité.
Que signifie « pass » sur un COA ?
Certains certificats indiquent pour chaque test :
-
réussi ;
-
conforme ;
-
conforme ;
-
approuvé.
Ces termes signifient généralement que le résultat se situe dans les limites d’une spécification établie à l’avance.
Pour évaluer correctement la signification, il faut préciser :
-
quelle spécification a été utilisée ;
-
quelle valeur limite s’appliquait ;
-
quelle méthode a été appliquée ;
-
quel a été le résultat mesuré.
Le seul mot « pass » sans valeur mesurée ni spécification offre une transparence limitée.
Qu’est-ce qu’une spécification produit ?
Une spécification produit décrit des critères de qualité établis à l’avance.
Exemples :
-
pureté HPLC ≥98 % ;
-
masse moléculaire dans une tolérance donnée ;
-
teneur en humidité inférieure à une limite établie ;
-
aspect conforme à la description.
Un résultat d’analyse est comparé à ces critères.
Lorsqu’un résultat se situe dans les limites de la spécification, le lot peut être approuvé pour la caractéristique examinée.
Une spécification produit doit être adaptée aux éléments suivants :
-
le produit ;
-
la méthode d’analyse ;
-
l’objectif de l’analyse.
Quelle est la différence entre un COA interne et un COA indépendant ?
Un COA interne est établi sur la base d’analyses réalisées par le producteur ou par un laboratoire directement impliqué dans la production.
Un COA indépendant est établi par un laboratoire externe.
Une analyse indépendante peut fournir une vérification supplémentaire.
La valeur dépend des éléments suivants :
-
l’indépendance ;
-
la qualité du laboratoire ;
-
la méthode d’analyse utilisée ;
-
l’identification de l’échantillon ;
-
le lien avec le lot ;
-
l’exhaustivité du rapport.
Un logo externe à lui seul ne prouve pas que l’ensemble de la chaîne de traçabilité a été contrôlé de manière indépendante.
La sélection et l’expédition de l’échantillon sont également pertinentes.
Qu’est-ce que la chaîne de traçabilité ?
La chaîne de traçabilité décrit le parcours documenté d’un échantillon.
Les éléments suivants peuvent être consignés :
-
la personne qui a sélectionné l’échantillon ;
-
la date à laquelle il a été emballé ;
-
la personne qui l’a expédié ;
-
la date à laquelle le laboratoire l’a reçu ;
-
la manière dont il a été stocké ;
-
la date à laquelle l’analyse a été effectuée.
Une chaîne de traçabilité claire réduit l’incertitude concernant :
-
la confusion ;
-
la provenance ;
-
l’identité de l’échantillon.
Une analyse indépendante peut renforcer la traçabilité de cette documentation.
Comment reconnaître un COA limité ?
Un COA offre une moindre traçabilité lorsque des données importantes manquent.
Points d’attention :
-
absence de numéro de lot ;
-
absence de la date d’analyse ;
-
absence du nom du laboratoire ;
-
absence de la méthode analytique utilisée ;
-
uniquement un pourcentage de pureté ;
-
absence de chromatogramme ;
-
absence de spectre de masse ;
-
données illisibles ;
-
numéro de lot qui ne correspond pas au flacon.
L’absence d’un seul élément ne signifie pas automatiquement qu’une analyse n’est pas fiable.
L’exhaustivité détermine toutefois le nombre de conclusions pouvant être tirées du document.
Un COA peut-il être falsifié ?
Les documents numériques et les images peuvent être modifiés.
C’est pourquoi la vérifiabilité est importante.
Les méthodes de vérification possibles sont :
-
vérification des numéros de lot ;
-
comparaison avec le flacon physique ;
-
vérification auprès du laboratoire ;
-
vérification des numéros de rapport ;
-
utilisation d’un portail de laboratoire ;
-
vérification des codes de vérification numériques.
Une conception professionnelle ne constitue pas en soi une preuve de fiabilité analytique.
Les données d’essai sous-jacentes sont plus importantes que la présentation visuelle.
Pourquoi chaque lot doit-il être évalué séparément ?
Les processus de production peuvent présenter de petites différences d’un lot à l’autre.
Les variables possibles sont :
-
matières premières ;
-
efficacité de la synthèse ;
-
processus de purification ;
-
lyophilisation ;
-
humidité résiduelle ;
-
durée de stockage.
Une analyse d’un lot plus ancien ne peut donc pas automatiquement servir de preuve pour un nouveau lot.
L’analyse spécifique à un lot permet d’étayer :
-
traçabilité ;
-
contrôle qualité ;
-
comparaison entre les cycles de production ;
-
recherche des écarts.
Le numéro de lot indiqué sur le COA doit correspondre au produit auquel le certificat se rapporte.
Un COA peut-il prouver la durée de conservation ?
Pas de manière autonome.
Une analyse ponctuelle décrit l’état d’un échantillon à un moment précis.
Pour étayer la stabilité à long terme, des données supplémentaires sont nécessaires.
Une étude de stabilité peut comprendre :
-
plusieurs moments de mesure ;
-
températures de stockage contrôlées ;
-
analyse de l’humidité ;
-
suivi par HPLC ;
-
recherche de produits de dégradation ;
-
évaluation de l’emballage.
Une grande pureté à la date de production ne garantit pas automatiquement la même qualité après un stockage prolongé.
Limites scientifiques
Un COA est un document qualité important, mais ne constitue pas une garantie complète.
L’interprétation est limitée par :
-
les méthodes analytiques utilisées ;
-
la qualité de la préparation de l’échantillon ;
-
la représentativité de l’échantillon ;
-
la validation de la méthode ;
-
l’exhaustivité du rapport ;
-
le délai entre l’analyse et l’utilisation.
Un COA ne prouve que ce qui a effectivement été examiné au moyen de méthodes appropriées.
Les propriétés non testées ne peuvent pas être déduites d’autres résultats.
Par exemple, un test HPLC ne prouve pas la stérilité, et un résultat de spectrométrie de masse ne prouve pas le contenu exact du flacon.
Résumé
Un Certificate of Analysis contient des informations analytiques sur un produit de recherche ou un lot de production spécifique.
Les éléments importants sont :
-
l’identité du produit ;
-
le numéro de lot ou de série ;
-
la date d’analyse ;
-
les méthodes d’analyse utilisées ;
-
le résultat HPLC ;
-
le résultat de la spectrométrie de masse ;
-
les spécifications du produit.
Lors de l’évaluation, il est important de vérifier :
-
Le numéro de lot correspond-il à celui du flacon ?
-
Est-il clairement indiqué quel laboratoire a réalisé l’analyse ?
-
La date d’analyse est-elle indiquée ?
-
Les méthodes utilisées sont-elles décrites ?
-
Des chromatogrammes ou des spectres sont-ils disponibles ?
-
Les valeurs mesurées et les spécifications sont-elles présentées clairement ?
-
Les conclusions portent-elles uniquement sur les propriétés qui ont effectivement été testées ?
Un COA favorise la transparence et le contrôle qualité, mais doit toujours être interprété sur le fond et en lien avec les autres données du produit.
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