Pureté du peptide : que signifie 99 % HPLC ?
Pureté des peptides expliquée : que signifie réellement un pourcentage HPLC ?
Pour les peptides destinés à la recherche, un pourcentage de pureté est souvent indiqué. Des valeurs telles que 98 %, 99 % ou 99,5 % de pureté sont régulièrement utilisées pour décrire la qualité d’un peptide.
Un pourcentage élevé semble facile à interpréter : plus le chiffre est élevé, meilleur est le produit. En pratique, la pureté des peptides est plus complexe.
Un résultat HPLC fournit des informations sur la composition relative d’un échantillon analysé. Toutefois, le pourcentage ne prouve pas automatiquement :
- que le peptide approprié est présent ;
- que la séquence d’acides aminés est entièrement correcte ;
- que la quantité de peptide indiquée dans le flacon est exacte ;
- que le matériau est stérile ;
- qu’il est exempt d’endotoxines ;
- que toutes les impuretés possibles ont été mesurées.
Pour évaluer soigneusement la qualité d’un peptide, plusieurs données analytiques doivent être examinées conjointement.
Dans cet article, nous expliquons comment la pureté des peptides est mesurée, ce que signifie un pourcentage HPLC et pourquoi la pureté ne constitue qu’un élément du contrôle qualité global.
Que signifie la pureté d’un peptide ?
La pureté d’un peptide décrit la proportion des composants détectés liés au peptide qui correspond au composant principal de l’échantillon analysé.
Par exemple, lorsqu’un certificat d’analyse indique une pureté HPLC de 99% indique, cela signifie généralement qu’environ 99 % du signal chromatographique intégré a été attribué au pic principal.
Cela ne signifie pas automatiquement que 99 % du poids total du flacon est constitué du peptide souhaité.
Un flacon peut contenir, en plus du peptide, d’autres composants, tels que :
- eau ;
- contre-ions ;
- sels ;
- des excipients ;
- des résidus de production ;
- des composants non détectables.
Le pourcentage HPLC et la quantité réelle de peptide sont donc des paramètres de qualité différents.
Qu’est-ce que la HPLC ?
HPLC signifie chromatographie liquide haute performance.
Il s’agit d’une technique analytique qui permet de séparer les différents composants chimiques d’un échantillon.
Lors d’une analyse par HPLC, un échantillon dissous est injecté dans une colonne. Cette colonne contient une phase stationnaire.
Le liquide qui s’écoule dans la colonne est appelé phase mobile.
Les différentes molécules ne réagissent pas toutes de la même manière avec ces phases. Ainsi, certains composants se déplacent plus rapidement dans la colonne que d’autres.
Le résultat est présenté dans un chromatogramme.
Un chromatogramme se compose généralement de :
- un axe horizontal du temps ;
- un axe vertical des signaux ;
- un ou plusieurs pics.
Chaque pic représente un composant détecté ou un groupe de composants.
Qu’est-ce qu’un temps de rétention ?
Le temps nécessaire à un composant pour traverser la colonne HPLC et atteindre le détecteur est appelé le temps de rétention.
Le temps de rétention peut être influencé par les facteurs suivants :
- type de colonne HPLC ;
- composition de la phase mobile ;
- température ;
- débit ;
- propriétés du peptide ;
- méthode analytique utilisée.
Un temps de rétention correspondant peut aider à effectuer une comparaison avec un étalon de référence.
Cependant, un temps de rétention seul est généralement insuffisant pour confirmer définitivement l’identité d’un peptide.
Différentes molécules peuvent présenter des temps de rétention similaires dans certaines conditions.
C’est pourquoi la HPLC est souvent combinée à la spectrométrie de masse.
Comment le pourcentage de pureté est-il calculé ?
Dans de nombreuses analyses HPLC, l’aire sous chaque pic chromatographique est calculée.
C’est ce que l’on appelle l’intégration de l’aire des pics.
Un exemple simplifié :
- pic principal : 99 % ;
- pic secondaire A : 0,5 % ;
- pic secondaire B : 0,3 % ;
- autres pics détectés : 0,2 %.
La pureté chromatographique rapportée est alors d’environ 99 %.
Ce calcul dépend des éléments suivants :
- méthode de détection ;
- paramètres d’intégration ;
- longueur d’onde sélectionnée ;
- méthode analytique ;
- limite de détection ;
- concentration de l’échantillon.
Un pourcentage de pureté doit donc toujours être interprété dans le contexte de la méthode utilisée.
Que signifie « pic principal » ?
Le plus grand pic d’un chromatogramme est souvent appelé le pic principal.
Pour un peptide bien caractérisé, on s’attend à ce que ce pic corresponde au peptide souhaité.
Cela doit toutefois être confirmé analytiquement.
Un pic important ne prouve pas à lui seul que la structure moléculaire correcte est présente.
Pour étayer l’identité, des techniques complémentaires peuvent être utilisées, telles que :
- informations sur le lot ;
- analyse des acides aminés ;
- analyse de séquence ;
- résonance magnétique nucléaire ;
- comparaison avec un étalon de référence.
La HPLC décrit principalement la composition chromatographique de l’échantillon.
Quelles impuretés peuvent apparaître lors de la synthèse peptidique ?
De nombreux peptides synthétiques sont produits par synthèse peptidique en phase solide, généralement abrégée SPPS.
Au cours de ce procédé, des acides aminés sont ajoutés progressivement à une chaîne peptidique en croissance.
De légères variations du procédé peuvent survenir à chaque étape.
Les impuretés liées aux peptides possibles sont les suivantes :
Chaînes peptidiques raccourcies
Lorsqu’un acide aminé n’est pas correctement couplé, une chaîne peptidique incomplète peut se former.
Ce produit est également appelé produit de troncature.
Séquences de délétion
Dans une séquence de délétion, un ou plusieurs acides aminés manquent dans la chaîne prévue.
La masse moléculaire diffère donc de celle du peptide souhaité.
Variantes chimiquement modifiées
Des changements chimiques peuvent survenir pendant la production, la purification ou le stockage.
Exemples :
- oxydation ;
- désamidation ;
- hydrolyse ;
- isomérisation.
Résidus de groupes protecteurs
Lors de la synthèse peptidique, des groupes protecteurs temporaires sont utilisés pour empêcher les réactions indésirables.
Ceux-ci doivent ensuite être éliminés.
Une élimination incomplète peut contribuer à la présence de composants secondaires.
Agrégats
Les molécules peptidiques peuvent former des structures plus grandes dans certaines conditions.
Toutes les méthodes HPLC ne détectent ni ne caractérisent les agrégats de la même manière.
Une pureté HPLC de 99 % équivaut-elle à une teneur en peptide de 99 % ?
Non.
Il s’agit d’une distinction importante.
La pureté HPLC décrit généralement la proportion relative des composants chromatographiques détectés.
La teneur en peptide décrit la quantité de peptide réel présente par rapport à la matière totale.
Un flacon lyophilisé peut par exemple contenir :
- le peptide souhaité ;
- eau ;
- contre-ions ;
- sels ;
- excipients.
Ces composants ne sont pas nécessairement tous mesurés de la même manière lors d’une analyse HPLC standard.
Par conséquent, un échantillon peut présenter une grande pureté chromatographique alors que sa teneur totale en peptide est inférieure au pourcentage HPLC.
Des méthodes d’analyse complémentaires sont nécessaires pour une détermination quantitative.
Qu’est-ce que le dosage d’un peptide ?
Un dosage est utilisé pour déterminer la quantité ou la concentration d’un composant spécifique.
Selon l’objectif de l’étude, différentes méthodes peuvent être utilisées.
Exemples :
- HPLC quantitative avec un étalon de référence ;
- analyse des acides aminés ;
- analyse de l’azote ;
- techniques spectroscopiques ;
- calculs du bilan massique.
Un dosage répond à une question différente de celle d’une analyse standard de la pureté.
L’analyse de la pureté nécessite :
Quelle proportion des composants peptidiques détectés appartient au pic principal ?
Un dosage quantitatif nécessite :
Quelle quantité du peptide souhaité est effectivement présente ?
Ces deux données peuvent être pertinentes pour une caractérisation complète de la qualité.
Pourquoi la spectrométrie de masse est-elle importante ?
La spectrométrie de masse, souvent abrégée en MS, mesure le rapport masse/charge des molécules ionisées.
Lors de l’analyse d’un peptide, il est possible de vérifier si la masse moléculaire mesurée correspond à la masse théorique attendue.
La spectrométrie de masse peut contribuer à :
- confirmation de l’identité ;
- détection de certaines modifications ;
- analyse des produits de dégradation ;
- comparaison des variantes peptidiques.
Lorsque la masse mesurée correspond à la masse attendue, cela étaye l’identification.
Cependant, la spectrométrie de masse ne fournit pas automatiquement des informations complètes sur :
- pourcentage de pureté ;
- quantité exacte ;
- stérilité ;
- endotoxines ;
- activité biologique.
La HPLC et la spectrométrie de masse sont donc complémentaires.
Qu’est-ce que la LC-MS ?
La LC-MS combine la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse.
Les composants sont d’abord séparés par chromatographie. Les signaux individuels sont ensuite examinés plus en détail par spectrométrie de masse.
Cette combinaison peut fournir des informations sur :
- temps de rétention ;
- masse moléculaire ;
- impuretés éventuelles ;
- produits de dégradation ;
- modifications chimiques.
La LC-MS peut ainsi fournir davantage d’informations analytiques qu’une seule technique utilisée isolément.
La qualité des résultats reste tributaire des éléments suivants :
- préparation des échantillons ;
- paramètres de l’instrument ;
- validation de méthode ;
- matériaux de référence ;
- interprétation experte.
Pourquoi différents laboratoires peuvent-ils obtenir des résultats différents ?
Le même peptide peut produire des résultats légèrement différents selon les laboratoires.
Les causes possibles sont :
- des colonnes HPLC différentes ;
- d’autres phases mobiles ;
- des gradients différents ;
- d’autres longueurs d’onde de détection ;
- des différences dans la préparation des échantillons ;
- d’autres paramètres d’intégration ;
- variation instrumentale.
Une différence ne signifie pas automatiquement qu’une des analyses est incorrecte.
Pour comparer correctement les résultats, il faut également examiner la méthode analytique.
Un pourcentage sans informations sur la méthode ne fournit qu’un contexte limité.
Qu’est-ce que la validation de méthode ?
Une méthode analytique doit être démontrablement adaptée à l’objectif visé.
C’est ce que l’on appelle la validation de méthode.
Les caractéristiques de validation possibles sont :
- spécificité ;
- exactitude ;
- précision ;
- linéarité ;
- plage de mesure ;
- limite de détection ;
- limite de quantification ;
- robustesse.
Une méthode d’identification n’est pas automatiquement adaptée à une quantification exacte.
Il faut donc déterminer au préalable quelle question analytique est étudiée.
Qu’est-ce que la limite de détection ?
Toute méthode analytique possède une limite en dessous de laquelle un composant ne peut pas être détecté de manière fiable.
C’est ce que l’on appelle la limite de détection.
Un composant qui n’est pas visible sur un chromatogramme n’est donc pas automatiquement totalement absent.
La concentration peut être inférieure à la limite de détection.
En outre, certaines substances peuvent :
- ne pas réagir au détecteur utilisé ;
- se situer en dehors de la plage de mesure ;
- être perdus lors de la préparation des échantillons ;
- ne pas être suffisamment séparés.
L’énoncé « non détecté » ne signifie donc pas toujours « absent ».
Un chromatogramme peut-il être manipulé ?
Un chromatogramme doit contenir suffisamment d’informations pour pouvoir être évalué professionnellement.
Les données importantes sont :
- nom du produit ;
- numéro de lot ;
- date de l’analyse ;
- méthode utilisée ;
- paramètres du détecteur ;
- temps de rétention ;
- intégration des pics ;
- données du laboratoire.
Une simple image montrant un seul pic important et un pourcentage offre une traçabilité limitée.
Les paramètres d’intégration peuvent également influencer les signaux pris en compte dans le calcul.
Une communication transparente est donc importante.
Quelles informations doivent figurer sur un COA fiable ?
Un certificat d’analyse peut notamment contenir :
- nom du peptide ;
- séquence d’acides aminés ;
- numéro de lot ;
- date de production ;
- date du test ;
- résultat HPLC ;
- chromatogramme ;
- résultat de la spectrométrie de masse ;
- masse moléculaire théorique ;
- masse moléculaire mesurée ;
- méthodes d’analyse utilisées ;
- nom du laboratoire.
Tous les COA ne contiennent pas tous les éléments.
Les informations nécessaires dépendent du produit et de l’objectif de la recherche.
Un COA détaillé peut offrir davantage de transparence, mais sa fiabilité dépend également de la qualité de l’analyse.
Une pureté élevée est-elle toujours nécessaire ?
La pureté souhaitée dépend de l’objectif de la recherche.
Dans certaines applications analytiques, de très faibles quantités de composants secondaires peuvent influencer :
- résultats de mesure ;
- études des récepteurs ;
- études cellulaires ;
- reproductibilité.
Un niveau de pureté plus élevé peut alors être souhaitable.
Cependant, un pourcentage plus élevé ne signifie pas automatiquement que toutes les autres caractéristiques de qualité sont meilleures.
Par exemple, un peptide présentant une pureté HPLC de 99,5 % peut néanmoins :
- contenir une quantité différente ;
- avoir été mal stockés ;
- être insuffisamment identifiés ;
- contenir une quantité accrue d’humidité résiduelle ;
- avoir un emballage endommagé.
La qualité doit donc être évaluée de manière multidimensionnelle.
Pureté et différences entre les lots
Chaque lot de production possède son propre parcours de production et d’analyse.
Les résultats de pureté peuvent donc varier d’un lot à l’autre.
L’analyse d’un seul lot ne doit pas automatiquement servir de preuve pour tous les lots futurs.
L’analyse spécifique au lot permet :
- traçabilité ;
- comparaison ;
- contrôle qualité ;
- étude des écarts.
Le numéro de lot indiqué sur le flacon doit donc correspondre à celui figurant sur le certificat d’analyse.
Pureté et stabilité
Une pureté initiale élevée ne garantit pas qu’elle sera maintenue pendant un stockage prolongé.
Les processus de dégradation possibles sont :
- oxydation ;
- hydrolyse ;
- désamidation ;
- agrégation.
La vitesse est influencée par :
- température ;
- humidité ;
- lumière ;
- oxygène ;
- séquence d’acides aminés ;
- emballage.
L’étude de stabilité peut être utilisée pour suivre les changements du profil chromatographique au fil du temps.
Limites scientifiques
Aucune méthode analytique ne donne à elle seule une image complète de la qualité des peptides.
La HPLC peut fournir des informations importantes sur la pureté chromatographique, mais elle présente des limites.
Un pourcentage HPLC ne prouve pas automatiquement :
- identité ;
- quantité exacte de peptide ;
- séquence d’acides aminés ;
- stérilité ;
- teneur en endotoxines ;
- activité biologique ;
- stabilité à long terme.
C’est pourquoi plusieurs méthodes analytiques sont combinées.
Une évaluation complète de la qualité peut comprendre :
- HPLC ;
- informations sur le lot ;
- dosage quantitatif ;
- analyse de l’humidité ;
- étude de stabilité ;
- tests supplémentaires spécifiques au produit.
Résumé
La pureté des peptides est un paramètre de qualité important, mais un pourcentage HPLC doit être interprété correctement.
Une valeur de 99 % signifie généralement qu’environ 99 % du signal chromatographique intégré a été attribué au pic principal.
Cela ne signifie pas automatiquement que :
- 99 % du poids du flacon est constitué de peptide ;
- l’identité est entièrement confirmée ;
- la quantité indiquée est correcte ;
- le matériau est stérile ;
- tous les contaminants potentiels sont exclus.
Pour une évaluation plus complète de la qualité, les résultats HPLC doivent être associés à d’autres données, telles que :
- informations sur le lot ;
- spectrométrie de masse ;
- analyse quantitative ;
- données de stockage ;
- étude de stabilité.
La qualité des peptides se définit donc par bien plus qu’un seul pourcentage.
Avertissement concernant la recherche
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