Analisi degli amminoacidi nei peptidi spiegata
Analisi degli amminoacidi nei peptidi: composizione e quantificazione spiegate
I peptidi sono costituiti da catene di amminoacidi. La sequenza di questi amminoacidi determina gran parte delle proprietà chimiche e strutturali di un peptide.
Nell'analisi della qualità, tecniche come la HPLC e la spettrometria di massa vengono spesso utilizzate per valutare la purezza e la massa molecolare. Un metodo analitico complementare è l'analisi degli amminoacidi, spesso abbreviata in AAA.
L'analisi degli amminoacidi può essere utilizzata per esaminare:
- quali amminoacidi sono presenti in un campione;
- in che modo i rapporti amminoacidici misurati corrispondono alla composizione attesa;
- quanto peptide è presente;
- se la composizione amminoacidica corrisponde a quella del peptide teorico;
- come può essere calcolato il contenuto peptidico netto.
Il metodo funziona in modo diverso dalla HPLC e dalla spettrometria di massa. Nell'analisi classica degli amminoacidi, la catena peptidica viene prima scissa nei singoli amminoacidi. Successivamente, questi amminoacidi vengono separati, rilevati e quantificati.
L'analisi degli amminoacidi può fornire informazioni preziose, ma presenta anche dei limiti. Durante la degradazione, alcuni amminoacidi possono alterarsi parzialmente o andare perduti. Pertanto, i risultati devono essere sempre interpretati nel contesto del metodo utilizzato.
Che cos'è l'analisi degli amminoacidi?
L'analisi degli amminoacidi è una tecnica di laboratorio utilizzata per esaminare la composizione amminoacidica di un campione.
In un'analisi classica vengono generalmente eseguite le seguenti fasi:
- preparazione del campione;
- idrolisi della catena peptidica;
- liberazione dei singoli amminoacidi;
- separazione degli amminoacidi;
- rilevazione e quantificazione;
- confronto con la composizione attesa.
Il risultato può essere espresso come:
- quantità per amminoacido;
- rapporto molare;
- concentrazione di massa;
- profilo amminoacidico;
- contenuto peptidico calcolato.
Che cos'è l'idrolisi?
L'idrolisi è un processo chimico mediante il quale i legami vengono scissi con l'ausilio dell'acqua.
Nell'analisi degli amminoacidi, i legami peptidici vengono scissi, liberando i singoli amminoacidi.
Un metodo ampiamente utilizzato è l'idrolisi acida.
Il campione viene quindi sottoposto a:
- acido forte;
- temperatura elevata;
- condizioni controllate.
Dopo l'idrolisi, la catena peptidica originale non esiste più come molecola intatta.
Gli amminoacidi liberati possono quindi essere analizzati singolarmente.
Perché la catena peptidica viene scissa?
Un peptide intatto può contenere decine di residui amminoacidici diversi.
Scomponendo la catena, è possibile misurare la quantità totale di ciascun aminoacido.
Supponiamo che un peptide teorico contenga:
- quattro residui di alanina;
- due residui di glicina;
- tre residui di leucina;
- un residuo di tirosina.
Dopo l'idrolisi, si può verificare se i rapporti misurati corrispondono approssimativamente a questa composizione teorica.
Ciò supporta la valutazione della composizione aminoacidica.
Qual è la differenza tra composizione aminoacidica e sequenza aminoacidica?
L'analisi degli aminoacidi misura soprattutto quali aminoacidi sono presenti e in quale quantità.
Il metodo non determina automaticamente l'ordine esatto.
Due peptidi diversi possono avere la stessa composizione aminoacidica, ma un ordine diverso.
Ad esempio:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Entrambi contengono:
- un'alanina;
- una glicina;
- una leucina.
Tuttavia, la sequenza è diversa.
Per lo studio della sequenza sono necessarie altre tecniche, come:
- spettrometria di massa tandem;
- analisi dei frammenti;
- metodi di sequenziamento specifici.
L'analisi degli aminoacidi può confermare l'identità?
L'analisi degli aminoacidi può supportare la composizione attesa.
Quando il profilo aminoacidico misurato si discosta notevolmente dalla composizione teorica, ciò può costituire un motivo per ulteriori indagini.
Tuttavia, un profilo corrispondente non dimostra da solo che l'esatta sequenza di aminoacidi sia corretta.
Per una valutazione più ampia dell'identità, possono essere combinati:
- massa molecolare;
- LC-MS;
- MS/MS;
- analisi degli aminoacidi;
- dati cromatografici.
Come vengono separati gli aminoacidi?
Dopo l'idrolisi, il campione contiene una miscela di aminoacidi liberi.
Questi devono essere separati analiticamente gli uni dagli altri.
Le tecniche possibili sono:
- cromatografia a scambio ionico;
- HPLC;
- UPLC;
- elettroforesi capillare.
La tecnica scelta dipende da:
- sensibilità desiderata;
- metodo di laboratorio;
- tipo di campione;
- precisione richiesta.
Che cos'è la derivatizzazione?
Molti aminoacidi hanno una rilevabilità limitata senza un trattamento aggiuntivo.
Pertanto, possono essere legati chimicamente a un gruppo rilevabile.
Questo processo è chiamato derivatizzazione.
La derivatizzazione può avvenire:
- prima della separazione cromatografica;
- dopo la separazione cromatografica.
I derivati formati possono essere misurati meglio, ad esempio, con:
- rilevamento UV;
- rilevamento a fluorescenza;
- spettrometria di massa.
Derivatizzazione pre-colonna
Nella derivatizzazione pre-colonna, gli aminoacidi vengono marcati prima della separazione cromatografica.
Successivamente, i derivati formati vengono separati tramite una colonna.
I possibili vantaggi sono:
- elevata sensibilità;
- rilevamento a fluorescenza adeguato;
- analisi di più aminoacidi.
La reazione deve avvenire in modo riproducibile.
Una derivatizzazione incompleta può influire sulla quantificazione.
Derivatizzazione post-colonna
Nella derivatizzazione post-colonna, gli amminoacidi vengono prima separati.
Dopo la colonna, reagiscono con un reagente di rivelazione.
Un esempio noto è l'analisi con ninidrina.
I prodotti di reazione formati possono quindi essere misurati otticamente.
Come viene determinata la quantità di amminoacido?
Per la quantificazione vengono utilizzati standard di riferimento.
Le soluzioni standard contengono quantità note di amminoacidi.
Questi vengono misurati per stabilire una relazione tra:
- concentrazione;
- segnale del rivelatore.
Successivamente viene misurato il campione sconosciuto.
Utilizzando i dati di calibrazione, è possibile calcolare la quantità di ciascun amminoacido.
Che cos'è uno standard interno?
Uno standard interno è una sostanza nota che viene aggiunta ai campioni e alle soluzioni di calibrazione.
Può contribuire a correggere le variazioni durante:
- preparazione del campione;
- iniezione;
- derivatizzazione;
- analisi.
Lo standard interno deve essere analiticamente ben distinguibile dagli amminoacidi analizzati.
Come può l'analisi degli amminoacidi determinare il contenuto peptidico?
Quando la composizione amminoacidica di un peptide è nota, è possibile utilizzare amminoacidi selezionati per calcolare la quantità di peptide.
Supponiamo che ogni catena peptidica contenga esattamente quattro residui di alanina.
Quando viene misurata la quantità totale di alanina, si può stimare da essa quante catene peptidiche erano presenti.
Il calcolo tiene conto di:
- numero di residui per peptide;
- massa molecolare;
- quantità misurata di amminoacido;
- metodo analitico.
Questo può essere utilizzato per un saggio peptidico quantitativo.
Perché non vengono utilizzati sempre tutti gli amminoacidi?
Non tutti gli amminoacidi sono ugualmente adatti alla quantificazione.
Alcuni amminoacidi possono, durante l'idrolisi:
- degradarsi parzialmente;
- cambiare chimicamente;
- rilasciarsi in modo incompleto;
- essere misurati in modo affidabile.
Per questo vengono spesso selezionati amminoacidi stabili.
La scelta dipende dalla sequenza peptidica e dal metodo analitico.
Quali amminoacidi possono cambiare durante l'idrolisi?
L'idrolisi acida può avere effetti diversi.
Triptofano
Durante l'idrolisi acida standard, il triptofano può essere in gran parte degradato.
Per questo sono necessari metodi adattati quando si deve misurare specificamente il triptofano.
Asparagina
Durante l'idrolisi, l'asparagina può essere convertita in aspartato.
Per questo motivo, nell'analisi classica, asparagina e aspartato non vengono sempre riportati separatamente.
Glutammina
La glutammina può essere convertita in glutammato.
In questo modo glutammina e glutammato possono essere visualizzati insieme.
Serina
La serina può andare parzialmente perduta durante un’idrolisi prolungata.
Treonina
Anche la treonina può degradarsi parzialmente.
Cisteina
La cisteina può subire alterazioni ossidative.
Per un’analisi affidabile può essere necessaria un’ossidazione preliminare o un metodo modificato.
Perché è importante il tempo di idrolisi?
I legami peptidici devono essere sufficientemente degradati.
Un’idrolisi troppo breve può causare:
- degradazione incompleta;
- valori misurati degli amminoacidi troppo bassi.
Un’idrolisi troppo lunga può causare:
- ulteriore degradazione degli amminoacidi sensibili;
- perdita durante la misurazione.
Pertanto, il tempo e la temperatura di idrolisi vengono controllati.
Talvolta vengono utilizzati più tempi di idrolisi per esaminare la perdita o la degradazione incompleta.
Che cos’è un rapporto molare?
Un rapporto molare descrive le quantità relative di amminoacidi.
Supponiamo che un peptide contenga teoricamente:
- due alanine;
- una glicina;
- tre leucine.
Il rapporto molare teorico è:
2 : 1 : 3
Dopo l’analisi, i valori misurati possono essere normalizzati.
Quando il rapporto è vicino al valore teorico, ciò supporta la composizione amminoacidica attesa.
Piccole deviazioni possono derivare da:
- incertezza di misura;
- perdita durante l’idrolisi;
- derivatizzazione;
- integrazione dei picchi cromatografici.
Che cosa significa normalizzazione?
Con la normalizzazione, i valori misurati degli amminoacidi vengono convertiti in rapporti relativi.
Un amminoacido appropriato può essere utilizzato come riferimento.
Ciò consente di confrontare il profilo misurato con la composizione teorica.
La normalizzazione è utile per analizzare la composizione, ma non fornisce automaticamente la quantità assoluta di peptidi.
Analisi degli amminoacidi rispetto alla purezza HPLC
La purezza HPLC e l’analisi degli amminoacidi misurano proprietà diverse.
La purezza HPLC esamina solitamente:
- picco cromatografico principale;
- quantità relativa dei picchi secondari.
L’analisi degli amminoacidi esamina:
- composizione amminoacidica;
- quantità di amminoacidi selezionati;
- possibile quantificazione dei peptidi.
Un’elevata purezza HPLC non dimostra automaticamente che la composizione amminoacidica sia corretta.
Una composizione amminoacidica appropriata non dimostra automaticamente l’assenza di impurità correlate ai peptidi.
Le tecniche si completano a vicenda.
Analisi degli amminoacidi rispetto alla spettrometria di massa
La spettrometria di massa esamina il rapporto massa-carica delle molecole.
Una misurazione della massa intatta può confermare che la massa molecolare corrisponde al valore teorico.
L’analisi degli amminoacidi esamina la quantità e il rapporto degli amminoacidi dopo l’idrolisi.
Entrambe le tecniche presentano diversi punti di forza.
Una combinazione può fornire maggiori informazioni su:
- identità;
- composizione;
- contenuto peptidico.
Analisi degli amminoacidi e saggio peptidico a confronto
L’analisi degli amminoacidi può essere utilizzata di per sé come metodo di saggio.
Un saggio peptidico descrive l’obiettivo:
determinare la quantità di peptide.
L’analisi degli amminoacidi è una delle tecniche con cui è possibile raggiungere questo obiettivo.
Altri possibili metodi di saggio sono:
- HPLC quantitativa;
- spettrofotometria UV;
- quantificazione mediante LC-MS;
- bilancio di massa.
Qual è l’influenza dei controioni?
Controioni come:
- acetato;
- cloruro;
- TFA;
contribuiscono alla massa totale del materiale liofilizzato.
Nell’analisi degli amminoacidi vengono esaminati soprattutto i componenti amminoacidici del peptide.
In questo modo, il metodo può aiutare a distinguere tra:
- massa totale del materiale;
- quantità effettiva di peptide.
Per un bilancio di massa completo possono essere necessarie analisi aggiuntive.
Qual è l’influenza dell’umidità residua?
L’umidità residua contribuisce al peso totale, ma non alla composizione amminoacidica.
Quando si calcola il contenuto netto di peptide, l’analisi dell’umidità può fornire informazioni aggiuntive.
Un bilancio di massa completo può includere:
- contenuto peptidico;
- contenuto d’acqua;
- contenuto di controioni;
- altri componenti.
L’analisi degli amminoacidi può evidenziare contaminanti?
Alcuni segnali anomali degli amminoacidi possono indicare componenti inattesi.
Tuttavia, il metodo non è progettato per rilevare ogni possibile contaminante.
Per questi aspetti possono essere necessarie altre tecniche:
- impurezze organiche;
- solventi residui;
- metalli;
- contaminazione microbiologica;
- endotossine.
Che cosa può comparire in un COA?
Un certificato di analisi può contenere informazioni quali:
- test: analisi degli amminoacidi;
- metodo analitico;
- rapporti misurati degli amminoacidi;
- rapporti teorici;
- contenuto peptidico calcolato;
- data del test;
- numero di lotto.
Non tutti i COA contengono un’analisi degli amminoacidi.
Quando sono state eseguite solo HPLC e MS, non è possibile ricavare da esse una quantificazione completa degli amminoacidi.
Perché è importante il collegamento al lotto?
Un’analisi degli amminoacidi deve essere associata al lotto esaminato.
I dati importanti sono:
- numero di lotto;
- nome del prodotto;
- data dell’analisi;
- laboratorio;
- metodo analitico.
Un rapporto di analisi senza un chiaro collegamento al lotto ha un valore inferiore ai fini della tracciabilità.
Che cosa significa incertezza di misura?
Ogni analisi quantitativa comporta un’incertezza di misura.
Nell’analisi degli amminoacidi, le fonti di variabilità possono includere:
- preparazione del campione;
- idrolisi;
- perdita di amminoacidi;
- derivatizzazione;
- calibrazione;
- separazione cromatografica;
- integrazione dei picchi.
Pertanto, i risultati non devono essere considerati assolutamente privi di errori.
Perché è importante la convalida del metodo?
Un metodo deve essere adatto allo scopo previsto.
Nell’analisi quantitativa degli amminoacidi, le caratteristiche di convalida pertinenti possono includere:
- accuratezza;
- precisione;
- linearità;
- specificità;
- intervallo di misurazione;
- robustezza;
- ripetibilità.
Un metodo adatto a un profilo qualitativo degli amminoacidi non è automaticamente sufficiente per una quantificazione precisa del peptide.
Limitazioni scientifiche
L’analisi degli amminoacidi presenta importanti limitazioni.
Il metodo non determina autonomamente:
- sequenza amminoacidica esatta;
- massa molecolare;
- purezza HPLC;
- struttura tridimensionale;
- attività biologica;
- sterilità;
- contenuto di endotossine.
Inoltre, alcuni amminoacidi possono subire modifiche durante l’idrolisi.
Per una valutazione completa della qualità, è necessario combinare più tecniche analitiche.
Riepilogo
L’analisi degli amminoacidi esamina la composizione e la quantità degli amminoacidi in un peptide.
Nell’analisi classica, la catena peptidica viene prima scissa mediante idrolisi.
Successivamente, gli amminoacidi vengono:
- separati;
- rilevati;
- quantificati;
- confrontata con la composizione teorica.
L’analisi degli amminoacidi può essere utilizzata per:
- controllo della composizione amminoacidica;
- valutazione dei rapporti molari;
- quantificazione del contenuto di peptide;
- supporto dell’identità.
Il metodo presenta limitazioni perché alcuni amminoacidi possono subire modifiche durante l’idrolisi.
Pertanto, l’analisi degli amminoacidi viene preferibilmente combinata con:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- saggio del peptide;
- analisi dell’umidità residua;
- analisi dei controioni.
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