Spettrometria di massa applicata ai peptidi spiegata

Spettrometria di massa dei peptidi: come si studia l'identità molecolare?

Nel controllo qualità dei peptidi per la ricerca, spesso si combinano diverse tecniche analitiche. L'HPLC può fornire informazioni sulla purezza cromatografica, ma un picco principale elevato non dimostra automaticamente che sia presente il peptide corretto.

Per studiare ulteriormente l'identità molecolare, viene spesso utilizzata la spettrometria di massa.

La spettrometria di massa, generalmente abbreviata in MS, è una tecnica analitica che misura il rapporto massa-carica delle molecole ionizzate. Nell'analisi dei peptidi, la massa molecolare misurata può essere confrontata con la massa teoricamente attesa della sequenza amminoacidica.

Quando questi valori corrispondono, ciò supporta l'identificazione del peptide esaminato. Tuttavia, anche la spettrometria di massa da sola non fornisce un quadro completo della qualità.

In questo blog spieghiamo come funziona la spettrometria di massa, perché i peptidi possono produrre più segnali di massa e come interpretare i risultati della MS insieme all'HPLC e ad altri metodi analitici.

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Che cos'è la spettrometria di massa?

La spettrometria di massa è una tecnica analitica che trasforma le molecole in particelle cariche, ovvero ioni.

Questi ioni vengono quindi separati e misurati in base al loro rapporto massa-carica.

Questo rapporto è rappresentato come:

m/z

Indica:

• m per la massa;
• z per la carica elettrica.

Uno spettrometro di massa, quindi, non misura sempre direttamente la massa molecolare completa. Lo strumento misura il rapporto tra massa e carica.

Nelle molecole più grandi, inclusi molti peptidi, possono formarsi cariche multiple. Di conseguenza, lo stesso peptide può essere visibile in punti diversi dello spettro di massa.

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Perché si utilizza la spettrometria di massa nell'analisi dei peptidi?

Un peptide è costituito da una sequenza specifica di amminoacidi.

Ogni combinazione di amminoacidi ha una massa molecolare teoricamente calcolabile.

La spettrometria di massa può essere utilizzata per verificare se la massa misurata corrisponde a questo valore teorico.

L'analisi MS può contribuire a:

• conferma dell'identità molecolare;
• confronto con la massa molecolare teorica;
• rilevamento di determinate modifiche chimiche;
• analisi dei prodotti di degradazione;
• studio delle varianti peptidiche;
• confronto tra i lotti di produzione.

Una massa corrispondente supporta l'identità di un peptide.

Tuttavia, il risultato deve essere sempre valutato in combinazione con il metodo analitico e altri dati sulla qualità.

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Qual è la massa molecolare teorica?

La massa molecolare teorica viene calcolata sulla base di:

• la sequenza amminoacidica;
• il numero di amminoacidi;
• eventuali modifiche chimiche;
• la forma molecolare;
• gruppi terminali specifici.

Quando gli amminoacidi formano insieme una catena peptidica, si formano legami peptidici.

Durante la formazione di ogni legame peptidico, viene separata una molecola d'acqua. Pertanto, la massa di un peptide completo non è semplicemente la somma delle masse dei singoli amminoacidi.

Anche le modifiche possono influire sulla massa.

Esempi:

• amidazione;
• acetilazione;
• fosforilazione;
• ossidazione;
• aggiunta di catene di acidi grassi;
• formazione di ponti disolfuro.

La massa teorica deve quindi essere calcolata per la struttura molecolare esatta.

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Che cosa significa peso molecolare?

I termini massa molecolare e peso molecolare sono spesso usati indistintamente.

Nei rapporti di laboratorio, il valore viene generalmente espresso in:

• dalton, abbreviato Da;
• kilodalton, abbreviato kDa.

Un dalton corrisponde approssimativamente alla massa di un atomo di idrogeno.

Un peptide con una massa molecolare di 3.000 Da ha quindi una massa di circa 3 kDa.

La massa molecolare dei peptidi può variare notevolmente, a seconda di:

• lunghezza della catena;
• composizione aminoacidica;
• modifiche chimiche.

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Come funziona uno spettrometro di massa?

Uno spettrometro di massa è generalmente costituito da diverse componenti.

1. Introduzione del campione

Il peptide viene prima preparato e introdotto nello strumento.

La preparazione del campione può influire su:

• intensità del segnale;
• rilevabilità;
• formazione di ioni;
• segnali di fondo.

2. Ionizzazione

Le molecole vengono caricate elettricamente.

Le tecniche comunemente utilizzate per l'analisi dei peptidi sono:

• electrospray ionization;
• matrix-assisted laser desorption/ionization.

3. Analisi della massa

Gli ioni formati vengono separati in base al loro rapporto massa-carica.

4. Rilevamento

Il rivelatore registra gli ioni.

5. Elaborazione dei dati

I segnali misurati vengono convertiti in uno spettro di massa.

Questo spettro contiene picchi corrispondenti agli ioni rilevati.

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Che cos'è l'electrospray ionization?

Electrospray ionization, abbreviata in ESI, è una tecnica di ionizzazione ampiamente utilizzata per i peptidi.

Durante l'ESI, un campione liquido viene fatto passare attraverso una piccola apertura mentre viene applicata una tensione elettrica.

Si formano così goccioline elettricamente cariche.

Quando il solvente evapora, rimangono molecole cariche.

Una caratteristica importante dell'ESI è che le molecole più grandi possono acquisire più cariche elettriche.

Un peptide può presentarsi, ad esempio, come:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Qui M indica la massa molecolare del peptide.

Le cariche multiple generano diversi segnali m/z per la stessa molecola.

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Perché un peptide presenta più picchi?

Quando un peptide acquista più protoni, si formano diverse forme di carica.

Supponiamo che un peptide abbia una massa molecolare di circa 3.000 Da.

I potenziali segnali sono quindi approssimativamente:

• una carica positiva: m/z intorno a 3.001;
• due cariche positive: m/z intorno a 1.501;
• tre cariche positive: m/z intorno a 1.001.

Questi segnali possono appartenere tutti allo stesso peptide.

Il software può utilizzare questa distribuzione delle cariche per calcolare la massa molecolare originaria.

Questo processo è chiamato deconvoluzione.

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Che cos'è uno spettro di massa deconvoluto?

Una misurazione ESI grezza può contenere diversi picchi di carica.

Ciò può rendere complessa l'interpretazione.

Con un software di deconvoluzione, le diverse forme di carica vengono convertite in un'unica massa molecolare stimata.

Lo spettro deconvoluto può quindi essere confrontato più facilmente con:

• la massa teorica;
• uno standard di riferimento;
• specifiche del prodotto.

La qualità del calcolo dipende da:

• intensità del segnale;
• risoluzione;
• rumore di fondo;
• impostazioni del software;
• presenza di componenti sovrapposti.

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Che cos'è la MALDI?

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, abbreviata in MALDI, è un'altra tecnica di ionizzazione.

Il peptide viene miscelato con un materiale matrice e applicato su una piastra di misura.

Un laser attiva la matrice, generando ioni peptidici.

La MALDI produce spesso principalmente ioni a carica singola.

Di conseguenza, lo spettro può apparire più semplice rispetto a uno spettro ESI.

La MALDI viene spesso combinata con un analizzatore di massa time-of-flight.

Questa combinazione è denominata:

MALDI-TOF

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Che cos'è il time-of-flight?

In un analizzatore di massa time-of-flight, gli ioni vengono accelerati da un campo elettrico.

Successivamente, attraversano un tubo di misura.

Gli ioni con un rapporto massa/carica inferiore raggiungono generalmente il rivelatore più rapidamente rispetto agli ioni con un rapporto più elevato.

Il tempo di volo viene utilizzato per calcolare il valore m/z.

I sistemi TOF possono essere utilizzati per:

• identificazione dei peptidi;
• determinazione della massa;
• confronto tra varianti molecolari.

L'accuratezza finale dipende dalla calibrazione, dalle impostazioni dello strumento e dalla preparazione del campione.

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Che cos'è la LC-MS?

Liquid chromatography-mass spectrometry, abbreviata in LC-MS, combina la cromatografia liquida con la spettrometria di massa.

I componenti vengono prima separati cromatograficamente.

Successivamente, i singoli segnali vengono analizzati dallo spettrometro di massa.

La LC-MS può combinare informazioni su:

• tempo di ritenzione;
• profilo cromatografico;
• massa molecolare;
• possibili impurità;
• prodotti di degradazione.

Per questo, la LC-MS può fornire informazioni più approfondite rispetto a un'analisi HPLC o MS singola.

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Qual è la differenza tra HPLC e spettrometria di massa?

HPLC e spettrometria di massa rispondono a domande analitiche diverse.

HPLC

L'HPLC può fornire informazioni su:

• purezza cromatografica;
• quantità relativa dei componenti rilevati;
• tempi di ritenzione;
• variazioni nel profilo cromatografico.

Spettrometria di massa

La spettrometria di massa può fornire informazioni su:

• massa molecolare;
• possibile identità;
• modifiche chimiche;
• determinati prodotti di degradazione.

Un confronto semplificato:

Per questo motivo, le due tecniche vengono spesso combinate.

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La stessa massa molecolare può essere presente in peptidi diversi?

Sì.

Sequenze aminoacidiche diverse possono avere la stessa massa totale o una massa quasi identica.

Talvolta vengono chiamate strutture isobare.

Pertanto, una massa corrispondente non dimostra sempre che l’intera sequenza aminoacidica sia corretta.

Per un’identificazione più approfondita possono essere necessarie tecniche aggiuntive, come:

• spettrometria di massa tandem;
• analisi di frammentazione;
• analisi aminoacidica;
• analisi della sequenza;
• confronto con uno standard di riferimento.

Il metodo analitico necessario dipende dal livello di certezza desiderato.

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Cos’è la spettrometria di massa tandem?

La spettrometria di massa tandem viene generalmente indicata come:

MS/MS

Durante la MS/MS, uno ione peptidico selezionato viene ulteriormente frammentato.

I frammenti formati vengono quindi misurati nuovamente.

Il pattern di frammentazione può fornire informazioni su:

• sequenza aminoacidica;
• posizione delle modifiche;
• identità del peptide;
• struttura dei prodotti di degradazione.

La MS/MS può quindi fornire più informazioni strutturali rispetto alla sola massa molecolare intatta.

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Cosa sono i frammenti peptidici?

Quando una catena peptidica si rompe in punti specifici durante la MS/MS, si formano ioni frammento.

I tipi di frammenti più comuni sono:

• ioni b;
• ioni y.

Le masse di questi frammenti possono essere utilizzate per ricostruire parti della sequenza aminoacidica.

L’interpretazione può essere complessa.

Non tutti i peptidi si frammentano allo stesso modo.

I fattori che possono influire sono:

• composizione aminoacidica;
• carica elettrica;
• dimensione del peptide;
• metodo di frammentazione;
• modifiche chimiche.

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La spettrometria di massa può rilevare l’ossidazione?

Alcune modifiche ossidative causano una variazione di massa misurabile.

Ad esempio, l’aggiunta di un singolo atomo di ossigeno comporta spesso un aumento della massa di circa 16 Da.

In questo modo, la spettrometria di massa può contribuire a identificare determinati prodotti di ossidazione.

La rilevazione dipende da:

• concentrazione;
• risoluzione dello strumento;
• metodo analitico;
• separazione dei componenti.

Non ogni modifica ossidativa può essere localizzata completamente basandosi esclusivamente su un singolo segnale di massa.

A tal fine può essere necessaria un’analisi di frammentazione aggiuntiva.

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La spettrometria di massa può determinare la quantità di peptide?

Non automaticamente.

L'intensità di un segnale di massa è influenzata da:

• efficienza di ionizzazione;
• proprietà molecolari;
• solvente;
• impostazioni dello strumento;
• presenza di altri componenti.

Pertanto, un segnale due volte più intenso non significa automaticamente che sia presente una quantità doppia di peptide.

Per una quantificazione affidabile sono necessari metodi convalidati e standard adeguati.

Le tecniche possibili sono:

• LC-MS quantitativa;
• standard interni;
• riferimenti marcati isotopicamente;
• saggi HPLC calibrati.

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La spettrometria di massa può dimostrare la sterilità?

No.

La spettrometria di massa per l'identificazione dei peptidi non è un test di sterilità.

Il risultato non fornisce informazioni dirette su:

• batteri;
• funghi;
• crescita microbica;
• sterilità del prodotto.

La sterilità richiede metodi di analisi microbiologici specifici.

Anche le endotossine non vengono determinate automaticamente durante un'analisi standard MS dei peptidi.

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La spettrometria di massa può misurare le endotossine?

Non mediante un'analisi standard dell'identità.

Le endotossine sono componenti batterici complessi.

Per l'analisi delle endotossine vengono utilizzati metodi specifici, come:

• test del lisato di amebociti di Limulus;
• metodi con fattore C ricombinante.

Pertanto, uno spettro di massa corretto di un peptide non dimostra che il materiale abbia un basso contenuto di endotossine.

Identità, purezza, sterilità ed endotossine sono parametri di qualità distinti.

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Perché i risultati di laboratorio possono differire?

Laboratori diversi possono riportare valori di massa leggermente differenti.

Le possibili cause sono:

• tipo di strumento;
• calibrazione;
• metodo di ionizzazione;
• preparazione del campione;
• addotti salini;
• software utilizzato;
• risoluzione;
• metodo di interpretazione.

Piccole differenze non significano automaticamente che un risultato sia errato.

Il valore misurato deve essere valutato tenendo conto di:

• accuratezza dello strumento;
• forma molecolare prevista;
• metodo analitico utilizzato.

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Che cosa sono gli addotti?

Durante la spettrometria di massa, gli ioni peptidici possono legarsi ad altre particelle cariche.

Esempi:

• sodio;
• potassio;
• ammonio.

Di conseguenza possono comparire picchi aggiuntivi.

Ad esempio, un addotto di sodio ha una massa diversa da quella di un semplice ione peptidico protonato.

Gli addotti non significano automaticamente che sia presente un altro peptide.

L'interpretazione richiede conoscenze di:

• preparazione del campione;
• tamponi utilizzati;
• forme ioniche previste.

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Quali informazioni devono essere incluse in un rapporto MS?

Un rapporto di analisi professionale può includere, tra l'altro:

• nome del peptide;
• numero di batch o di lotto;
• massa molecolare teorica;
• massa molecolare misurata;
• metodo di ionizzazione;
• tipo di spettrometro di massa;
• spettro di massa;
• data dell'analisi;
• nome del laboratorio.

In caso di un'analisi più approfondita, possono essere indicati anche:

• intervallo di misurazione;
• risoluzione;
• accuratezza della massa;
• dati di frammentazione;
• software utilizzato.

La documentazione necessaria dipende dall'obiettivo della ricerca.

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Spettrometria di massa e controllo dei lotti

Ogni lotto di produzione può essere esaminato separatamente.

L'analisi MS specifica del lotto supporta:

• controllo dell'identità;
• confronto tra lotti;
• tracciabilità;
• indagine sulle anomalie.

Il numero di lotto sul rapporto di analisi deve corrispondere all'identificazione sulla fiala.

Un risultato di spettrometria di massa senza un chiaro collegamento al lotto ha un valore più limitato ai fini della tracciabilità.

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Limitazioni scientifiche

La spettrometria di massa è una potente tecnica analitica, ma non costituisce una valutazione completa della qualità.

Una massa molecolare corrispondente non dimostra automaticamente:

• sequenza amminoacidica completa;
• elevata purezza cromatografica;
• quantità corretta di peptide;
• sterilità;
• basso contenuto di endotossine;
• attività biologica;
• stabilità a lungo termine.

Per una valutazione più ampia possono essere necessari diversi metodi:

• HPLC;
• LC-MS;
• MS/MS;
• saggio quantitativo;
• studio della stabilità;
• analisi dell'umidità;
• test aggiuntivi specifici per il prodotto.

I risultati devono essere interpretati nel loro insieme.

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Riepilogo

La spettrometria di massa viene utilizzata per esaminare la massa molecolare dei peptidi per la ricerca.

La tecnica misura il rapporto massa/carica delle molecole ionizzate.

Nell'analisi dei peptidi, la massa misurata può essere confrontata con la massa teorica prevista.

Una corrispondenza supporta l'identificazione molecolare.

Le principali tecniche analitiche includono:

• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;
• MS/MS.

Tuttavia, la spettrometria di massa non fornisce automaticamente informazioni su:

• quantità esatta;
• purezza cromatografica;
• sterilità;
• endotossine;
• attività biologica.

Per questo motivo, la MS viene spesso combinata con HPLC e ulteriori analisi di qualità.

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Dichiarazione di esclusione di responsabilità per la ricerca

I peptidi per la ricerca di Peptidera sono offerti esclusivamente per Research Use Only (RUO) e sono destinati alla ricerca di laboratorio e alle applicazioni analitiche.

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Categoria:
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• Link a PB-0229 per l'analisi specifica del lotto
• Link alla pagina del COA con i risultati dei test di spettrometria di massa
• Link alla raccolta di peptidi per la ricerca
• Link alla pagina sull'analisi di laboratorio indipendente