Saggio peptidico: purezza versus contenuto di peptidi
Saggio peptidico: la differenza tra purezza e contenuto reale di peptide
Nella valutazione della qualità dei peptidi di ricerca, si guarda spesso prima alla percentuale di purezza. Nei certificati di analisi compaiono regolarmente valori come 98%, 99% o 99,5% di purezza HPLC.
Una percentuale elevata può fornire informazioni importanti sulla composizione cromatografica di un campione. Tuttavia, non risponde automaticamente a un’altra domanda importante:
Quanta quantità reale di peptide è presente nella fiala?
Purezza HPLC e contenuto peptidico vengono spesso confusi. Un peptide di ricerca può ad esempio avere una purezza cromatografica del 99%, mentre la quantità reale di peptide nel materiale liofilizzato totale è inferiore.
Questo non indica necessariamente un problema di qualità. Un prodotto liofilizzato può contenere, oltre al peptide, anche acqua, controioni, sali o componenti della formulazione.
Per determinare la quantità reale di peptide, può essere eseguita un’analisi quantitativa. Questo è spesso chiamato saggio peptidico.
In questo blog spieghiamo cos’è un saggio peptidico, come differisce dalla purezza HPLC e perché possono essere necessari più metodi analitici per una valutazione completa della qualità.
Cos’è un saggio peptidico?
Un saggio peptidico è una determinazione analitica che misura la quantità di un peptide specifico in un campione.
A seconda del metodo utilizzato, il risultato può essere espresso come:
- milligrammi di peptide per fiala;
- milligrammi di peptide per grammo di materiale;
- percentuale di contenuto peptidico;
- concentrazione in una soluzione;
- quantità rispetto a uno standard di riferimento.
Un saggio si concentra quindi su quantità.
La domanda centrale è:
Quanto peptide desiderato è effettivamente presente?
Questo differisce da un’analisi standard di purezza HPLC.
Nella purezza cromatografica la domanda centrale è:
Quale parte del segnale cromatografico misurato appartiene al componente principale?
Entrambe le analisi possono essere utili, ma descrivono proprietà diverse.
Cosa significa purezza HPLC?
HPLC sta per High-Performance Liquid Chromatography.
Durante un’analisi HPLC, un campione disciolto viene fatto passare attraverso una colonna cromatografica. Diversi componenti molecolari si muovono a velocità differenti attraverso questa colonna.
Ciò consente di separarli l’uno dall’altro.
Il risultato viene mostrato in un cromatogramma.
Un cromatogramma contiene solitamente:
- un asse temporale orizzontale;
- una risposta verticale del rivelatore;
- un picco principale;
- eventuali picchi secondari minori.
Quando un certificato di analisi indica, ad esempio, una purezza HPLC del 99%, significa generalmente che circa il 99% del segnale cromatografico integrato è assegnato al picco principale.
Non significa automaticamente che il 99% della massa totale nella fiala sia costituito dal peptide desiderato.
Perché la purezza HPLC non è uguale al contenuto di peptide?
Un'analisi standard di purezza HPLC confronta solitamente le aree relative dei picchi cromatografici rilevati.
Non tutti i componenti in una fiala liofilizzata vengono necessariamente misurati allo stesso modo.
Il contenuto totale può ad esempio essere costituito da:
- il peptide desiderato;
- residuo di liquido;
- acqua legata;
- ioni acetato;
- ioni trifluoroacetato;
- ioni cloruro;
- sali;
- eccipienti.
Alcuni di questi componenti producono poco o nessun segnale rilevabile nelle condizioni HPLC utilizzate.
Per questo motivo un campione può avere un'alta purezza cromatografica, mentre il contenuto reale di peptide è inferiore.
Non è una contraddizione. Le analisi misurano proprietà diverse.
Un esempio di calcolo semplificato
Supponiamo che un campione liofilizzato pesi in totale 10 milligrammi.
La composizione è ipotetica:
- 8,5 mg di peptide desiderato;
- 0,8 mg di controioni;
- 0,5 mg di acqua;
- 0,2 mg di componenti residui.
Un'analisi HPLC può mostrare che il 99% dei segnali rilevati correlati al peptide appartiene al picco principale.
Tuttavia, il 99% della massa secca totale non è costituito da peptide.
Il contenuto reale di peptide in questo esempio semplificato è:
8,5 mg su 10 mg = 85%
Il risultato HPLC e il dosaggio possono quindi essere entrambi corretti.
Descrivono solo diverse caratteristiche di qualità.
Cosa significa contenuto netto di peptide?
Il termine contenuto netto di peptide si riferisce alla quantità reale di peptide dopo aver considerato alcune componenti non peptidiche.
Esempi di tali componenti sono:
- acqua;
- controioni;
- sali residui;
- componenti della formulazione.
Il contenuto netto di peptide può essere espresso come percentuale.
Quando un materiale liofilizzato ha, ad esempio, un contenuto netto di peptide dell'85%, significa che circa l'85% della massa analizzata è attribuibile al peptide.
Il calcolo esatto dipende da:
- metodi di analisi utilizzati;
- composizione del prodotto;
- fattori correttivi;
- specifiche.
Il termine deve quindi essere interpretato nel contesto del rapporto di analisi.
Quali fattori influenzano il contenuto di peptide?
Il contenuto reale di peptide può essere influenzato da diversi fattori.
Umidità residua
Dopo la liofilizzazione rimane spesso una piccola quantità di acqua.
Questo viene chiamato umidità residua.
La quantità può dipendere da:
- processo di congelamento;
- fase di essiccazione primaria;
- fase di essiccazione secondaria;
- formulazione;
- condizioni di conservazione;
- integrità del confezionamento.
L'umidità residua contribuisce alla massa totale, ma non è un peptide.
Controioni
I peptidi possono essere presenti in forma salina durante la produzione e la purificazione.
I controioni più comuni sono:
- acetato;
- trifluoroacetato;
- cloruro.
Questi ioni contribuiscono alla massa totale del materiale.
La quantità di controione può variare tra i lotti di produzione e i metodi di purificazione.
Sali
I sali residui possono provenire da:
- buffer;
- processi di purificazione;
- scambio ionico;
- fasi di formulazione.
Eccipienti
In alcuni processi di liofilizzazione si utilizzano eccipienti per supportare la struttura fisica o la stabilità.
Queste sostanze possono far parte del materiale liofilizzato totale.
Come si può determinare il contenuto peptidico?
Non esiste un unico metodo di analisi universale ottimale per ogni peptide.
Il metodo adatto dipende da:
- sequenza degli amminoacidi;
- struttura molecolare;
- quantità di materiale;
- precisione desiderata;
- obiettivo dell'analisi.
Le tecniche possibili sono:
- HPLC quantitativa;
- analisi degli amminoacidi;
- quantificazione LC-MS;
- spettrofotometria ultravioletta;
- calcolo del bilancio di massa.
Ogni metodo ha vantaggi e limiti propri.
HPLC quantitativa
L'HPLC non può essere utilizzata solo per l'analisi della purezza relativa.
Con uno standard di riferimento adeguato, l'HPLC può essere utilizzata anche quantitativamente.
Il segnale del rivelatore del campione viene confrontato con i segnali di concentrazioni note.
Di solito viene creata una curva di calibrazione per questo scopo.
Una procedura semplificata consiste in:
- preparazione di soluzioni di riferimento;
- misurazione di concentrazioni note;
- creazione di una curva di calibrazione;
- misurazione del campione sconosciuto;
- calcolo della concentrazione peptidica.
Per risultati affidabili, il metodo deve essere sufficientemente convalidato.
Perché uno standard di riferimento è importante?
Uno standard di riferimento è un materiale ben caratterizzato di cui sono note le proprietà rilevanti.
Nell'HPLC quantitativa, lo standard può essere utilizzato per confrontare il segnale misurato con una quantità nota.
La qualità dello standard influisce sull'affidabilità del test.
Le proprietà importanti sono:
- identità confermata;
- purezza nota;
- contenuto peptidico noto;
- conservazione adeguata;
- tracciabilità.
Uno standard caratterizzato in modo errato può portare a deviazioni sistematiche nelle misurazioni.
Cos'è una curva di calibrazione?
Una curva di calibrazione descrive la relazione tra:
- concentrazione nota;
- segnale del rivelatore misurato.
Vengono analizzate più soluzioni standard.
I segnali misurati vengono quindi tracciati rispetto alle concentrazioni note.
Quando il metodo è lineare nell'intervallo di misura utilizzato, è possibile calcolare la concentrazione di un campione sconosciuto.
L'affidabilità dipende, tra l'altro, da:
- linearità;
- accuratezza;
- precisione;
- qualità dello standard;
- preparazione del campione.
Analisi degli amminoacidi
L'analisi degli amminoacidi può essere utilizzata per esaminare la composizione degli amminoacidi o la quantità di peptide.
Durante un'analisi classica, la catena peptidica viene scomposta in singoli amminoacidi.
Questo avviene spesso tramite idrolisi.
Gli amminoacidi liberati vengono poi separati e misurati.
L'analisi degli amminoacidi può fornire informazioni su:
- composizione amminoacidica;
- rapporto tra amminoacidi;
- quantità stimata di peptide.
Il metodo può essere utile per la quantificazione, ma ha delle limitazioni.
Limitazioni dell'analisi degli amminoacidi
Non tutti gli amminoacidi rimangono completamente stabili durante l'idrolisi.
Le possibili sfide sono:
- degradazione parziale;
- idrolisi incompleta;
- conversione di certi amminoacidi;
- perdita durante la preparazione del campione.
Per questo spesso si selezionano amminoacidi specifici per i calcoli quantitativi.
Il metodo deve essere adattato al peptide studiato.
LC-MS per analisi quantitativa
La cromatografia liquida-spettrometria di massa combina la separazione cromatografica con la spettrometria di massa.
LC-MS può essere usata per:
- identificazione;
- analisi di modifiche;
- rilevamento di prodotti di degradazione;
- quantificazione.
Per una quantificazione affidabile sono generalmente necessari:
- standard di calibrazione adeguati;
- condizioni di misura validate;
- standard interni;
- preparazione del campione controllata.
L'intensità di un segnale di massa non può essere tradotta direttamente in una quantità esatta senza calibrazione.
Perché l'intensità del segnale non corrisponde automaticamente alla quantità?
Diverse molecole non si ionizzano tutte con la stessa efficienza.
L'intensità del segnale nella spettrometria di massa è influenzata da:
- struttura molecolare;
- carica elettrica;
- solvente;
- concentrazione di sale;
- impostazioni dello strumento;
- presenza di altri componenti.
Un segnale di massa doppio non significa automaticamente che ci sia il doppio del peptide.
La LC-MS quantitativa richiede un metodo analitico controllato.
Spettrofotometria ultravioletta
Alcuni peptidi assorbono la luce ultravioletta.
Questa assorbanza può essere usata in certe condizioni per la determinazione della concentrazione.
L'idoneità dipende dalla composizione amminoacidica.
Soprattutto gli amminoacidi aromatici possono contribuire all'assorbimento UV, tra cui:
- triptofano;
- tirosina;
- fenilalanina.
Non tutti i peptidi contengono abbastanza di questi amminoacidi per una quantificazione affidabile.
Anche altri componenti possono influenzare il segnale UV.
Cos'è il bilancio di massa?
In un bilancio di massa vengono combinati diversi componenti misurati.
Un calcolo semplificato può tenere conto di:
- purezza HPLC;
- contenuto di acqua;
- contenuto di controioni;
- componenti inorganici;
- altre sostanze misurate.
Con questo si può fare una stima del contenuto netto di peptide.
L'affidabilità dipende dalla completezza delle analisi.
Componenti non misurati possono influenzare il risultato.
Cos'è il contenuto della fiala?
La quantità indicata su una fiala è spesso espressa in milligrammi.
Ad esempio:
10 mg di peptide di ricerca
Per una valutazione quantitativa affidabile deve essere chiaro cosa descrive questo valore.
Le possibili interpretazioni sono:
- quantità nominale;
- quantità di materiale pesata;
- quantità netta di peptide calcolata;
- quantità di peptide misurata.
Questi valori non sono automaticamente gli stessi.
Specifiche di prodotto trasparenti chiariscono come è stata determinata la quantità.
Cos’è il controllo del peso di riempimento?
Durante la produzione si può controllare quanta sostanza viene distribuita in ogni fiala.
Questo è talvolta chiamato controllo del peso di riempimento.
Il metodo può fornire informazioni su:
- coerenza tra le fiale;
- quantità totale di materiale liofilizzato;
- variazione durante il processo di riempimento.
Una sola determinazione del peso non mostra però quanto di quel materiale è costituito dal peptide desiderato.
Per questo è necessaria un’informazione analitica aggiuntiva.
Perché le fiale di un lotto possono variare?
I processi produttivi sono progettati per mantenere la variazione il più piccola possibile.
Tuttavia, può verificarsi una certa dispersione.
Le possibili cause sono:
- variazione del riempimento;
- differenze nella liofilizzazione;
- residuo di liquido;
- incertezza di misura;
- perdita di materiale.
Per questo motivo, i controlli di qualità possono esaminare più campioni di un lotto.
Una singola fiala testata non descrive automaticamente ogni singola fiala in modo completo.
Cosa significa incertezza di misura?
Ogni misurazione analitica contiene un certo grado di incertezza.
Le possibili fonti sono:
- variazione dello strumento;
- preparazione del campione;
- errori di pipettaggio;
- calibrazione;
- standard di riferimento;
- elaborazione dei dati.
Una quantità misurata non deve quindi essere considerata assolutamente priva di errori.
I laboratori professionali valutano:
- accuratezza;
- precisione;
- ripetibilità;
- riproducibilità.
Cos’è l’accuratezza?
L’accuratezza descrive quanto un valore misurato è vicino al valore reale o al valore di riferimento accettato.
Un metodo può essere testato, ad esempio, con campioni di quantità nota.
Quando i risultati misurati sono vicini ai valori attesi, ciò supporta l’accuratezza.
Cos’è la precisione?
La precisione descrive quanto sono vicine tra loro le misurazioni ripetute.
Un metodo può fornire risultati molto precisi che però si discostano sistematicamente dal valore reale.
Per questo motivo, sia l’accuratezza che la precisione sono importanti.
Perché è necessaria la validazione del metodo?
Un metodo analitico deve essere dimostrabilmente adatto allo scopo previsto.
In un saggio peptidico quantitativo, le caratteristiche di validazione rilevanti possono essere:
- specificità;
- accuratezza;
- precisione;
- linearità;
- campo di misura;
- robustezza;
- limite di quantificazione.
Un metodo adatto per l’identificazione non è automaticamente adatto per una quantificazione esatta.
Come si leggono i dati del saggio su un COA?
Controllare almeno quanto segue in un saggio peptidico:
- Quale metodo di analisi è stato utilizzato?
- Il risultato è espresso in milligrammi o percentuale?
- È stato utilizzato uno standard di riferimento?
- È chiaro cosa descrive il valore misurato?
- Il risultato è specifico per lotto?
- La data di analisi è indicata?
- Il metodo è adatto per la quantificazione?
Una percentuale isolata senza metodo o contesto offre informazioni limitate.
Perché purezza e saggio devono essere valutati insieme?
Purezza e saggio si completano a vicenda.
Un’alta purezza HPLC può indicare che sono stati rilevati pochi componenti secondari correlati al peptide.
Un saggio quantitativo può indicare quanto peptide desiderato è presente.
Insieme forniscono più informazioni su:
- composizione relativa;
- quantità reale;
- coerenza del lotto;
- specifiche del prodotto.
Nessuno dei due parametri fornisce da solo un quadro completo della qualità.
Limitazioni scientifiche
Un saggio peptidico ha sempre limitazioni specifiche del metodo.
I risultati possono essere influenzati da:
- preparazione del campione;
- standard di riferimento;
- impostazioni dello strumento;
- componenti interferenti;
- incertezza di misura;
- stabilità del campione.
Anche un saggio accurato non fornisce automaticamente informazioni su:
- sterilità;
- endotossine;
- attività biologica;
- stabilità a lungo termine;
- sequenza completa di amminoacidi.
Sono necessarie analisi separate per questo.
Riepilogo
Purezza HPLC e contenuto peptidico sono parametri di qualità distinti.
La purezza HPLC descrive solitamente la quota relativa del picco principale tra i segnali cromatografici rilevati.
Un saggio peptidico verifica quanto peptide desiderato è effettivamente presente.
Il materiale liofilizzato totale può inoltre contenere:
- acqua;
- controioni;
- sali;
- eccipienti.
Pertanto, il 99% di purezza HPLC non significa automaticamente che il 99% della massa totale della fiala sia costituito da peptide.
I metodi possibili per la quantificazione sono:
- HPLC quantitativa;
- analisi degli amminoacidi;
- LC-MS;
- Spettrofotometria UV;
- bilancio di massa.
Per una valutazione completa della qualità, purezza, identità, contenuto peptidico, informazioni sul lotto e test analitici aggiuntivi devono essere interpretati congiuntamente.
Disclaimer per la ricerca
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Non destinato al consumo umano o animale, uso diagnostico, applicazione terapeutica o autocon somministrazione.
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