Leggere il COA del peptide: certificato di analisi spiegato

PEPTIDERA BLOG — PB-0232

Certificate of Analysis per i peptidi: come leggere e valutare un COA?

Per i peptidi destinati alla ricerca si fa spesso riferimento a un Certificate of Analysis, generalmente abbreviato in COA. Questo certificato di analisi contiene informazioni sull'identità, la composizione o la qualità analitica di uno specifico prodotto o lotto di produzione.

Un COA può contenere dati importanti, quali:

• il nome del peptide analizzato;

• il numero di lotto o batch;

• la purezza HPLC misurata;

• la massa molecolare teorica e misurata;

• i metodi analitici utilizzati;

• la data in cui è stata eseguita l'analisi.

Tuttavia, la presenza di un COA non significa automaticamente che siano stati esaminati tutti gli aspetti della qualità del peptide. Un certificato deve essere valutato nel merito. Sono importanti, tra gli altri, i metodi analitici utilizzati, il collegamento al lotto, la data del test e l'origine del rapporto.

Ad esempio, un cromatogramma con un picco principale elevato può fornire informazioni sulla purezza cromatografica, ma non dimostra automaticamente che la quantità di peptide nella fiala sia corretta. Inoltre, un rapporto standard HPLC o di spettrometria di massa non fornisce alcuna informazione sulla sterilità se non è stato eseguito un test specifico.

In questo blog spieghiamo che cos'è un COA di un peptide, quali informazioni può contenere e come interpretare correttamente i diversi risultati analitici.

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Che cos'è un Certificate of Analysis?

Un Certificate of Analysis è un documento in cui vengono registrati i risultati analitici di un prodotto, campione o lotto di produzione.

Il documento viene generalmente redatto da:

• il produttore;

• un laboratorio interno di controllo qualità;

• un laboratorio esterno specializzato;

• un'organizzazione di test indipendente.

Un COA può essere utilizzato per valutare se le proprietà misurate corrispondono a specifiche del prodotto prestabilite.

A seconda dell'obiettivo della ricerca, il certificato può contenere informazioni su:

• identità;

• purezza cromatografica;

• massa molecolare;

• contenuto di peptide;

• contenuto di peptide;

• solventi residui;

• endotossine;

• qualità microbiologica.

Non tutti i COA dei peptidi includono tutte queste analisi.

Pertanto, è necessario verificare sempre ciò che è stato effettivamente testato.

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Perché un COA è importante per i peptidi destinati alla ricerca?

I peptidi non possono essere valutati in modo affidabile basandosi solo sull'aspetto.

Una struttura bianca liofilizzata non mostra:

• quale peptide sia presente;

• quanto peptide sia presente;

• quale sia la purezza chimica;

• se sono presenti prodotti di degradazione;

• se il materiale è stato identificato correttamente.

I test analitici possono fornire informazioni non disponibili tramite la sola ispezione visiva.

Un COA supporta, tra le altre cose:

• controllo qualità;

• tracciabilità dei lotti;

• confronto tra lotti di produzione;

• documentazione dei dati di ricerca;

• valutazione delle specifiche del prodotto;

• riproducibilità degli esperimenti.

Il valore di un COA dipende dalla qualità e dalla completezza dell'analisi sottostante.

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Quali dati di base devono figurare in un COA di un peptide?

Un certificato di analisi utile contiene idealmente informazioni sufficienti per identificare il campione analizzato.

I dati importanti sono:

Nome del prodotto

Il nome del peptide analizzato deve essere indicato chiaramente.

Preferibilmente, devono essere incluse anche informazioni identificative aggiuntive, come:

• sequenza amminoacidica;

• formula molecolare;

• numero CAS;

• massa molecolare teorica.

Non tutti i peptidi hanno un unico nome di prodotto universalmente utilizzato. Informazioni molecolari aggiuntive possono quindi aiutare a evitare confusioni.

Numero di lotto

Il numero di lotto collega il rapporto analitico a uno specifico lotto di produzione.

Il numero riportato sul COA deve corrispondere al numero indicato su:

• la fiala;

• l'etichetta;

• la confezione;

• la documentazione interna del prodotto.

Quando i numeri di lotto non corrispondono, non è possibile stabilire in modo affidabile che il certificato si riferisca al prodotto ricevuto.

Data dell'analisi

La data dell'analisi indica quando il campione è stato esaminato.

Questa data è importante perché un risultato analitico descrive lo stato del campione in un determinato momento.

Dopo l'analisi, conservazione, temperatura, umidità, ossigeno e trasporto possono influire sulla stabilità.

Metodo analitico utilizzato

Una percentuale senza il metodo analitico offre poco contesto.

Il COA deve quindi indicare chiaramente quale tecnica è stata utilizzata, ad esempio:

• RP-HPLC;

• LC-MS;

• ESI-MS;

• MALDI-TOF;

• analisi degli amminoacidi;

• analisi dell'umidità con Karl Fischer.

Ogni metodo esamina caratteristiche qualitative diverse.

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Cosa significa la purezza HPLC in un COA?

HPLC sta per High-Performance Liquid Chromatography.

Con questa tecnica, i componenti di un campione disciolto vengono separati cromatograficamente.

Il risultato viene visualizzato in un cromatogramma.

Un cromatogramma contiene generalmente:

• un asse temporale orizzontale;

• una risposta verticale del rilevatore;

• un picco principale;

• eventuali picchi secondari minori.

Quando, ad esempio, un COA indica una purezza HPLC del 99%, ciò significa generalmente che circa il 99% del segnale cromatografico integrato è stato attribuito al picco principale.

Ciò non significa automaticamente che il 99% del peso totale della fiala sia costituito dal peptide desiderato.

Possono essere presenti altri componenti, come:

• acqua;

• sali;

• controioni;

• eccipienti;

• componenti che non vengono misurati dal metodo utilizzato.

La purezza HPLC e il reale contenuto di peptidi sono quindi parametri di qualità diversi.

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Come si legge un cromatogramma HPLC?

Nella valutazione di un cromatogramma possono essere rilevanti diversi elementi.

Tempo di ritenzione

Il tempo di ritenzione è il tempo necessario a un componente per raggiungere il rivelatore.

Questo tempo è influenzato da:

• il tipo di colonna;

• la fase mobile;

• la velocità di flusso;

• la temperatura;

• le proprietà del peptide.

Un tempo di ritenzione corrispondente può supportare l’identificazione quando viene utilizzato uno standard di riferimento appropriato.

Tuttavia, il solo tempo di ritenzione non dimostra definitivamente che sia presente il peptide corretto.

Picco principale

Il picco più grande viene generalmente interpretato come il principale componente peptidico.

L’identità di questo picco dovrebbe essere supportata, preferibilmente, da dati analitici aggiuntivi.

Picchi secondari

I picchi più piccoli possono avere cause diverse.

Le possibili spiegazioni sono:

• varianti correlate alla sintesi;

• catene peptidiche troncate;

• prodotti di ossidazione;

• prodotti di degradazione;

• altri componenti rilevati.

Non ogni piccolo picco costituisce automaticamente un problema di qualità rilevante. L’identità e la quantità devono essere esaminate separatamente.

Area del picco

L’area sotto un picco viene utilizzata per il calcolo relativo dei componenti cromatografici.

Il risultato può essere influenzato da:

• impostazioni di integrazione;

• lunghezza d’onda di rilevamento;

• concentrazione del campione;

• metodo analitico.

Pertanto, una percentuale deve sempre essere interpretata nel contesto del metodo utilizzato.

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Che cosa significa la spettrometria di massa in un COA?

La spettrometria di massa viene utilizzata per misurare il rapporto massa-carica delle molecole ionizzate.

Nell’analisi dei peptidi, la massa molecolare misurata viene confrontata con la massa teoricamente attesa.

Un COA può, ad esempio, riportare:

• massa teorica: 3.250,7 Da;

• massa misurata: 3.250,9 Da.

Una buona corrispondenza supporta l’identificazione molecolare.

Tuttavia, la spettrometria di massa non fornisce automaticamente informazioni su:

• purezza cromatografica;

• quantità esatta di peptide;

• sterilità;

• endotossine;

• attività biologica.

Per questo motivo, HPLC e spettrometria di massa vengono spesso combinati.

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Perché HPLC e spettrometria di massa sono complementari?

HPLC e spettrometria di massa rispondono a domande analitiche diverse.

L’HPLC esamina principalmente:

• quanti componenti cromatografici siano visibili;

• quale quota relativa corrisponda al picco principale;

• se sono presenti picchi secondari più piccoli.

La spettrometria di massa esamina principalmente:

• quale massa molecolare viene misurata;

• o se questa massa corrisponda al peptide atteso;

• o se siano visibili determinate modifiche chimiche.

Un’elevata purezza HPLC senza un’analisi dell’identità non dimostra completamente che il picco principale rappresenti il peptide corretto.

Una massa molecolare corrispondente senza un’analisi della purezza non fornisce un quadro completo della composizione relativa.

La combinazione offre quindi più informazioni rispetto a un singolo metodo.

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Che cos'è il contenuto di peptide?

Il contenuto di peptide descrive la quantità di peptide effettivamente presente rispetto al materiale totale.

Questo viene talvolta indicato come:

• contenuto di peptide;

• dosaggio del peptide;

• contenuto netto di peptide.

Il contenuto di peptide può differire dalla purezza HPLC.

Un prodotto liofilizzato può contenere, oltre al peptide:

• acqua legata;

• umidità residua;

• controioni;

• sali;

• eccipienti.

Un risultato HPLC del 99% non significa quindi automaticamente che il 99% della massa secca totale sia costituito da peptide.

Per la determinazione quantitativa possono essere necessari metodi aggiuntivi.

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Che cos'è l'analisi degli amminoacidi?

L'analisi degli amminoacidi può essere utilizzata per ottenere informazioni sulla composizione amminoacidica o sulla quantità di peptide.

Durante l'analisi, il peptide viene generalmente scomposto nei singoli amminoacidi.

Questi vengono quindi misurati.

L'analisi degli amminoacidi può contribuire a:

• quantificazione;

• verifica della composizione amminoacidica;

• confronto con la sequenza teorica.

Il metodo presenta dei limiti.

Durante l'idrolisi, alcuni amminoacidi possono modificarsi o andare parzialmente persi.

I risultati devono pertanto essere interpretati da personale esperto.

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Che cosa significa contenuto di acqua?

Dopo la liofilizzazione può rimanere una piccola quantità di umidità residua.

Il contenuto di acqua può influire su:

• stabilità;

• mobilità molecolare;

• struttura fisica;

• velocità di degradazione.

Un metodo comunemente utilizzato per l'analisi dell'umidità è la titolazione Karl Fischer.

Questa tecnica può essere utilizzata specificamente per determinare l'acqua.

Un basso contenuto di umidità non significa automaticamente che la qualità complessiva sia ottimale. La quantità desiderata di umidità residua può variare a seconda della formulazione del peptide.

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Che cosa sono i controioni?

Durante la produzione e la purificazione, i peptidi possono essere presenti sotto forma di sale.

I controioni più comuni sono:

• acetato;

• trifluoroacetato;

• cloruro.

Questi ioni possono contribuire alla massa totale del materiale liofilizzato.

La quantità di controione può dipendere da:

• sintesi;

• metodo di purificazione;

• scambio ionico;

• formulazione.

I controioni non vengono sempre indicati in una percentuale standard di purezza HPLC.

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Che cosa significa test di sterilità?

Un test di sterilità verifica se, nelle condizioni di prova applicate, vengono rilevati microrganismi vitali.

Si tratta di un'analisi microbiologica distinta.

Un risultato HPLC o MS non dimostra la sterilità.

Quando un COA riporta esclusivamente:

• purezza HPLC;

• massa molecolare;

non è possibile trarre alcuna conclusione sulla sterilità.

L'analisi della sterilità richiede metodi specifici, condizioni controllate e un protocollo di prova adeguato.

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Che cos'è un test per le endotossine?

Le endotossine sono componenti della membrana esterna di alcuni batteri Gram-negativi.

L'analisi delle endotossine è un controllo di qualità distinto.

I metodi comunemente utilizzati sono:

• test LAL;

• test del fattore C ricombinante.

I risultati possono essere espressi in unità di endotossine, ad esempio:

UE per flaconcino

oppure:

UE per milligrammo

Un basso valore di endotossine non equivale alla sterilità.

Un campione può non presentare una crescita microbiologica rilevabile e contenere comunque endotossine. Al contrario, un test per le endotossine non sostituisce un test di sterilità.

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Che cosa significa “pass” su un COA?

Alcuni certificati riportano per ogni test:

• superato;

• rispetta;

• conforme;

• approvato.

Questi termini indicano generalmente che il risultato rientra in una specifica prestabilita.

Per valutarne correttamente il significato, deve essere chiaro:

• quale specifica sia stata utilizzata;

• quale limite fosse applicabile;

• quale metodo sia stato applicato;

• quale fosse il risultato misurato.

La sola parola “pass” senza un valore misurato o una specifica offre una trasparenza limitata.

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Che cos'è una specifica del prodotto?

Una specifica del prodotto descrive criteri di qualità prestabiliti.

Esempi sono:

• purezza HPLC ≥98%;

• massa molecolare entro una determinata tolleranza;

• contenuto di umidità inferiore a un limite prestabilito;

• aspetto conforme alla descrizione.

Un risultato analitico viene confrontato con questi criteri.

Quando un risultato rientra nella specifica, il lotto può essere approvato per la caratteristica esaminata.

Una specifica del prodotto deve essere adeguata a:

• il prodotto;

• il metodo analitico;

• l'obiettivo dell'analisi.

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Qual è la differenza tra un COA interno e uno indipendente?

Un COA interno viene redatto sulla base di analisi effettuate dal produttore o da un laboratorio direttamente coinvolto nella produzione.

Un COA indipendente viene redatto da un laboratorio esterno.

Un'analisi indipendente può fornire una verifica aggiuntiva.

Il valore dipende da:

• indipendenza;

• qualità del laboratorio;

• metodo analitico utilizzato;

• identificazione del campione;

• collegamento al lotto;

• completezza del rapporto.

Un semplice logo esterno non dimostra che l'intera catena di custodia sia stata verificata in modo indipendente.

Anche la selezione e la spedizione del campione sono rilevanti.

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Che cos'è la catena di custodia?

La catena di custodia descrive il percorso documentato di un campione.

In questo contesto si possono registrare:

• chi ha selezionato il campione;

• quando è stato confezionato;

• chi lo ha spedito;

• quando il laboratorio lo ha ricevuto;

• come è stato conservato;

• quando è stata eseguita l'analisi.

Una chiara catena di custodia riduce l'incertezza riguardo a:

• scambio;

• provenienza;

• identità del campione.

In caso di analisi indipendente, questa documentazione può rafforzare la verificabilità.

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Come si riconosce un COA limitato?

Un COA offre meno verificabilità quando mancano dati importanti.

Aspetti da considerare:

• assenza del numero di lotto;

• assenza della data di analisi;

• assenza del nome del laboratorio;

• assenza del metodo analitico utilizzato;

• solo una percentuale di purezza;

• assenza del cromatogramma;

• assenza dello spettro di massa;

• dati illeggibili;

• numero di lotto che non corrisponde alla vial.

La mancanza di un singolo elemento non significa automaticamente che un'analisi sia inaffidabile.

Tuttavia, la completezza determina quante conclusioni si possono trarre dal documento.

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Un COA può essere falsificato?

I documenti digitali e le immagini possono essere modificati.

Per questo la verificabilità è importante.

I possibili metodi di verifica sono:

• controllo dei numeri di lotto;

• confronto con la vial fisica;

• verifica tramite il laboratorio;

• controllo dei numeri di rapporto;

• utilizzo di un portale di laboratorio;

• controllo dei codici di verifica digitali.

Un design professionale non costituisce di per sé una prova di affidabilità analitica.

I dati dei test sottostanti sono più importanti dell'aspetto visivo.

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Perché ogni lotto deve essere valutato separatamente?

I processi di produzione possono presentare piccole differenze tra i lotti.

Le possibili variabili sono:

• materie prime;

• efficienza della sintesi;

• processo di purificazione;

• liofilizzazione;

• umidità residua;

• durata di conservazione.

Pertanto, l'analisi di un lotto precedente non può essere utilizzata automaticamente come prova per un nuovo lotto.

L'analisi specifica del lotto supporta:

• tracciabilità;

• controllo qualità;

• confronto tra cicli di produzione;

• analisi delle deviazioni.

Il numero di lotto sul COA deve corrispondere al prodotto a cui si riferisce il certificato.

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Un COA può dimostrare la durata di conservazione?

Non da solo.

Un'analisi una tantum descrive lo stato di un campione in un momento specifico.

Per documentare la stabilità a lungo termine sono necessari dati aggiuntivi.

Uno studio di stabilità può comprendere:

• più momenti di misurazione;

• temperature di conservazione controllate;

• analisi dell'umidità;

• monitoraggio HPLC;

• analisi dei prodotti di degradazione;

• valutazione dell'imballaggio.

Un'elevata purezza alla data di produzione non garantisce automaticamente la stessa qualità dopo una conservazione prolungata.

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Limitazioni scientifiche

Un COA è un documento importante per la qualità, ma non costituisce una garanzia completa.

L'interpretazione è limitata da:

• i metodi analitici utilizzati;

• la qualità della preparazione del campione;

• la rappresentatività del campione;

• la validazione del metodo;

• la completezza del rapporto;

• il tempo tra l'analisi e l'utilizzo.

Un COA dimostra solo ciò che è stato effettivamente esaminato con metodi adeguati.

Le proprietà non testate non possono essere dedotte da altri risultati.

Ad esempio, un test HPLC non dimostra la sterilità e un risultato della spettrometria di massa non dimostra l'esatto contenuto della vial.

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Riepilogo

Un Certificate of Analysis contiene informazioni analitiche su un prodotto per la ricerca o su uno specifico lotto di produzione.

Gli elementi principali sono:

• identità del prodotto;

• numero di lotto o partita;

• data dell’analisi;

• metodi analitici utilizzati;

• risultato HPLC;

• risultato della spettrometria di massa;

• specifiche del prodotto.

Durante la valutazione è importante verificare:

1. Il numero di lotto corrisponde a quello della fiala?

2. È chiaro quale laboratorio ha eseguito l’analisi?

3. È indicata la data dell’analisi?

4. I metodi utilizzati sono descritti?

5. Sono disponibili cromatogrammi o spettri?

6. I valori misurati e le specifiche sono riportati in modo chiaro?

7. Si traggono conclusioni solo sulle proprietà effettivamente testate?

Un COA favorisce la trasparenza e il controllo qualità, ma deve essere sempre interpretato nel merito e insieme agli altri dati del prodotto.

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Disclaimer sulla ricerca

I peptidi per la ricerca di Peptidera sono offerti esclusivamente per Research Use Only (RUO) e sono destinati alla ricerca di laboratorio e alle applicazioni analitiche.

Non destinato al consumo umano o animale, all’uso diagnostico, all’applicazione terapeutica o all’autosomministrazione.

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Come leggere un COA dei peptidi: il certificato di analisi spiegato

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• Link a PB-0231 sulla spettrometria di massa

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Certificato di analisi peptidica specifico per lotto con cromatogramma HPLC e dati di spettrometria di massa accanto a fiale di peptidi per la ricerca