Standard di riferimento peptidici spiegati
Standard di riferimento peptidici: perché il confronto analitico è importante
Nell'analisi della qualità dei peptidi di ricerca vengono spesso utilizzate tecniche come:
- HPLC;
- LC-MS;
- dosaggio del peptide;
- analisi degli amminoacidi;
- spettrofotometria UV.
Questi strumenti producono dati di misurazione, ma un segnale del rivelatore o un picco cromatografico non ha automaticamente un significato preciso.
Per identificare o quantificare in modo affidabile un campione sconosciuto, è possibile confrontarlo con un materiale le cui proprietà rilevanti siano già state accuratamente determinate.
Questo materiale viene definito standard di riferimento.
Uno standard di riferimento peptidico ben caratterizzato può essere utilizzato per:
- identificazione;
- confronto dei tempi di ritenzione;
- quantificazione;
- calibrazione;
- valutazione dei metodi HPLC;
- analisi delle impurità;
- analisi dei prodotti di degradazione;
- supporto alla tracciabilità delle misurazioni.
La qualità di un risultato analitico non dipende quindi soltanto dallo strumento di laboratorio. Sono importanti anche l'identità, la purezza, il contenuto peptidico, la conservazione e la documentazione dello standard di riferimento utilizzato.
Inoltre, uno standard di riferimento non corrisponde automaticamente a un campione qualsiasi con un'elevata percentuale HPLC. Per l'uso quantitativo, è necessario sapere chiaramente quanto peptide effettivo è presente e quali componenti non peptidici contribuiscono alla massa totale.
In questo articolo analizziamo cosa sono gli standard di riferimento peptidici, in cosa differiscono gli standard primari da quelli secondari e perché il confronto analitico è importante per un'analisi affidabile dei peptidi.
Che cos'è uno standard di riferimento peptidico?
Uno standard di riferimento peptidico è un materiale accuratamente caratterizzato, utilizzato come base di confronto durante l'analisi di laboratorio.
A seconda dell'obiettivo della ricerca, possono essere determinate proprietà quali:
- sequenza amminoacidica;
- massa molecolare;
- identità;
- Purezza HPLC;
- contenuto peptidico;
- contenuto d’acqua;
- contenuto di controioni;
- presenza di impurità rilevanti;
- stabilità durante la conservazione.
Lo standard può quindi essere utilizzato per confrontare analiticamente un campione sconosciuto.
La caratterizzazione necessaria dipende dall'applicazione.
Uno standard per l'identificazione non deve sempre soddisfare esattamente gli stessi requisiti di uno standard per un'analisi quantitativa.
Perché è necessaria una comparazione analitica?
Uno strumento di laboratorio misura un segnale fisico o chimico.
Esempi:
- assorbimento UV;
- fluorescenza;
- area del picco cromatografico;
- rapporto massa-carica;
- intensità ionica.
Un segnale non corrisponde automaticamente a una quantità esatta di peptide.
A tal fine è necessaria una relazione affidabile tra:
- quantità nota;
- segnale misurato;
- campione sconosciuto.
Uno standard di riferimento può contribuire a stabilire questa relazione.
Un semplice esempio
Supponiamo che un laboratorio voglia determinare la quantità di un peptide mediante HPLC quantitativa.
Il laboratorio prepara diverse soluzioni di uno standard di riferimento caratterizzato:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Ogni soluzione viene analizzata.
Le aree dei picchi misurate vengono riportate in funzione delle concentrazioni note.
Da ciò si ottiene una curva di calibrazione.
Successivamente si misura il campione sconosciuto.
La concentrazione può essere calcolata confrontando il segnale del campione con la curva di calibrazione.
L'affidabilità di questo calcolo dipende, tra l'altro, da:
- qualità dello standard di riferimento;
- calcolo corretto della concentrazione;
- pesata accurata;
- pipettaggio accurato;
- linearità del metodo;
- stabilità delle soluzioni.
Che cos'è uno standard di riferimento primario?
Uno standard di riferimento primario è un materiale le cui proprietà rilevanti sono state ampiamente determinate.
Lo standard può essere caratterizzato mediante diverse tecniche analitiche indipendenti.
Le analisi possibili includono:
- HPLC;
- LC-MS;
- analisi degli amminoacidi;
- determinazione dell'acqua;
- analisi del controione;
- NMR;
- analisi elementare;
- bilancio di massa.
L'obiettivo è stabilire con elevata affidabilità:
- quale materiale è presente;
- quanto è puro;
- quanta componente desiderata è presente;
- quali fattori di correzione sono necessari.
Uno standard primario può quindi essere utilizzato per qualificare altri standard.
Che cos'è uno standard di riferimento secondario?
Uno standard di riferimento secondario è anche chiamato:
- standard di lavoro;
- standard di lavoro;
- standard di riferimento interno.
Questo standard viene qualificato mediante confronto con uno standard primario o con uno standard di riferimento ufficialmente riconosciuto.
Uno standard secondario può essere utilizzato per le analisi di laboratorio di routine.
I possibili vantaggi sono:
- maggiore disponibilità;
- costi inferiori;
- conservazione dello standard primario;
- uso di routine più efficiente.
Tuttavia, lo standard secondario deve essere controllato periodicamente e conservato correttamente.
Perché non si utilizza sempre lo standard primario?
Gli standard primari possono:
- essere disponibili in quantità limitate;
- essere costosi;
- essere forniti in piccole quantità;
- destinati a specifici metodi analitici ufficiali.
Qualificando uno standard secondario rispetto a uno standard primario, è possibile effettuare analisi di routine senza utilizzare continuamente lo standard primario.
L'affidabilità dipende dalla qualità della qualificazione.
Che cosa significa qualificare uno standard di lavoro?
La qualificazione consiste nell'esaminare sistematicamente le proprietà dello standard di lavoro e nel confrontarle con un riferimento idoneo.
Un programma di qualificazione può comprendere:
- controllo dell'identità;
- Purezza HPLC;
- dosaggio del peptide;
- contenuto d’acqua;
- contenuto di controioni;
- confronto dei cromatogrammi;
- confronto degli spettri di massa;
- valutazione della stabilità.
I test necessari dipendono dall'uso previsto.
Identità versus quantificazione
Uno standard di riferimento può avere diverse funzioni analitiche.
Standard di identità
Uno standard di identità viene utilizzato per verificare se un campione sconosciuto corrisponde al peptide atteso.
I possibili confronti sono:
- Tempo di ritenzione HPLC;
- massa molecolare;
- profilo spettrometrico di massa;
- proprietà spettroscopiche.
Standard quantitativo
Uno standard quantitativo viene utilizzato per determinare la quantità di peptide.
A tale scopo, il contenuto effettivo di peptide deve essere noto con sufficiente affidabilità.
Di solito, una purezza HPLC elevata da sola non è sufficiente a questo scopo.
Perché la purezza HPLC non è sufficiente?
Un peptide può avere, ad esempio, una purezza HPLC del 99%.
Ciò non significa automaticamente che il 99% della massa totale sia costituito dal peptide.
Il materiale può contenere inoltre:
- acqua;
- acetato;
- cloruro;
- TFA;
- sali;
- altri componenti non misurati cromatograficamente.
Per uno standard quantitativo occorre quindi distinguere tra:
- purezza cromatografica;
- massa totale del materiale;
- contenuto netto di peptide.
Qual è il valore assegnato?
Uno standard di riferimento può avere un valore assegnato.
Questo valore descrive, ad esempio:
- contenuto peptidico;
- purezza;
- concentrazione;
- potenza;
- quantità per confezione.
Il valore assegnato deve basarsi su dati analitici adeguati.
Può inoltre essere indicato un fattore di correzione.
Che cos'è un fattore di correzione?
Un fattore di correzione viene utilizzato per convertire la quantità di materiale pesata nella quantità effettiva di peptide.
Supponiamo:
- materiale pesato: 10,0 mg;
- contenuto di peptide assegnato: 85%;
- quantità effettiva di peptide: 8,5 mg.
Se non si applica questa correzione, la concentrazione calcolata può essere sovrastimata.
Perché è importante il contenuto netto di peptide?
Il contenuto netto di peptide descrive la quota di peptide effettivo presente nel materiale esaminato.
Nel calcolo possono essere inclusi fattori quali:
- umidità residua;
- controioni;
- componenti organici;
- componenti inorganici.
Per l'analisi quantitativa, ciò è spesso più rilevante della sola purezza HPLC.
Quale ruolo svolge l'analisi degli aminoacidi?
L'analisi degli aminoacidi può essere utilizzata per determinare il contenuto di peptide.
La catena peptidica viene idrolizzata in singoli aminoacidi.
Gli aminoacidi selezionati vengono quindi quantificati.
Quando è noto quanti di questi aminoacidi sono presenti in ogni catena peptidica, è possibile calcolare la quantità di peptide.
L'analisi degli aminoacidi può quindi contribuire all'assegnazione del valore di uno standard di riferimento.
Quale ruolo svolge la spettrometria di massa?
La spettrometria di massa può contribuire a confermare:
- massa molecolare;
- identità;
- determinate modifiche;
- prodotti di degradazione.
La LC-MS può combinare la separazione cromatografica con il rilevamento di massa.
Una massa molecolare corrispondente supporta l'identità, ma non dimostra da sola:
- quantità esatta di peptide;
- sequenza completa;
- assenza di tutte le impurità.
Per questo motivo, spesso si combinano più tecniche.
Quale ruolo svolge la MS/MS?
Nella spettrometria di massa tandem, uno ione peptidico selezionato viene frammentato.
I frammenti possono fornire informazioni sulla sequenza aminoacidica.
La MS/MS può quindi fornire un supporto aggiuntivo per:
- conferma della sequenza;
- localizzazione delle modifiche;
- identificazione dei prodotti di degradazione.
La capacità analitica dipende da:
- dimensione del peptide;
- frammentazione;
- risoluzione dello strumento;
- elaborazione dei dati.
Quale ruolo svolge la HPLC?
La HPLC può essere utilizzata per:
- confronto dei tempi di ritenzione;
- valutazione della purezza cromatografica;
- ricerca di picchi secondari;
- saggio quantitativo;
- studio di stabilità.
Nel confronto, il riferimento e il campione devono essere analizzati con lo stesso metodo controllato.
I parametri importanti sono:
- tipo di colonna;
- fase mobile;
- temperatura;
- velocità di flusso;
- lunghezza d'onda di rilevazione.
Che cos'è una curva di calibrazione?
Una curva di calibrazione descrive la relazione tra concentrazioni note e segnali misurati dal rivelatore.
Una curva di calibrazione affidabile deve essere valutata in base a:
- linearità;
- intervallo di misura;
- riproducibilità;
- scostamenti;
- idoneità al metodo analitico.
La concentrazione sconosciuta viene calcolata entro l'intervallo di misura convalidato.
L'estrapolazione al di fuori di questo intervallo può causare un'ulteriore incertezza.
Che cos'è la linearità?
La linearità descrive il grado in cui il segnale misurato varia proporzionalmente alla concentrazione.
Quando la concentrazione raddoppia, entro un intervallo lineare ci si attende una variazione corrispondente del segnale.
La relazione non deve essere lineare per ogni metodo e per ogni intervallo di concentrazione.
Pertanto, l'intervallo di misura pertinente viene esaminato sperimentalmente.
Che cosa significa tracciabilità analitica?
La tracciabilità analitica o metrologica descrive come un risultato di misura è collegato a un riferimento riconosciuto attraverso una catena documentata di confronti.
Gli elementi importanti sono:
- standard utilizzato;
- certificato;
- valore assegnato;
- calibrazione;
- metodo analitico;
- incertezza di misura;
- documentazione.
La tracciabilità supporta la comparabilità dei risultati tra:
- diverse giornate di misurazione;
- laboratori;
- strumenti;
- lotti.
Che cos'è la tracciabilità metrologica?
La metrologia è la scienza della misurazione.
La tracciabilità metrologica richiede una catena di confronti documentata e ininterrotta verso un riferimento specificato. Ogni passaggio contribuisce all'incertezza di misura totale.
Per l'analisi dei peptidi, la tracciabilità pratica può dipendere, tra l'altro, da:
- standard di riferimento;
- contenuto peptidico assegnato;
- bilancia calibrata;
- apparecchiature volumetriche;
- metodo analitico.
Che cos'è l'incertezza di misura?
Ogni misurazione analitica contiene un'incertezza.
Le possibili fonti sono:
- incertezza dello standard di riferimento;
- pesata;
- pipettaggio;
- diluizione;
- variabilità dello strumento;
- calibrazione;
- integrazione dei picchi;
- preparazione del campione.
L'incertezza di misura non significa che un risultato sia inaffidabile.
Descrive la dispersione stimata entro la quale il valore reale può ragionevolmente trovarsi.
Perché gli standard devono essere specifici per lotto?
Anche gli standard di riferimento vengono prodotti in lotti.
Lotti diversi possono differire per:
- contenuto peptidico;
- contenuto d’acqua;
- contenuto di controioni;
- profilo di purezza;
- stabilità.
Pertanto, deve essere chiaro quale numero di lotto dello standard di riferimento è stato utilizzato.
Che cosa è riportato su un certificato di uno standard di riferimento?
Un certificato può contenere informazioni su:
- nome;
- numero di catalogo;
- numero di lotto;
- valore assegnato;
- uso previsto;
- condizioni di conservazione;
- informazioni sulla validità;
- metodi analitici;
- fattore di correzione.
Non tutti i certificati contengono gli stessi dati.
Lo standard deve essere utilizzato secondo le relative istruzioni.
Perché le condizioni di conservazione sono importanti?
Uno standard di riferimento può cambiare durante la conservazione.
I processi possibili includono:
- ossidazione;
- deamidazione;
- assorbimento di umidità;
- aggregazione;
- degradazione.
Pertanto, possono essere stabilite condizioni per:
- temperatura;
- protezione dalla luce;
- protezione dall’umidità;
- uso dopo l’apertura;
- durata di conservazione.
Uno standard conservato in modo non corretto può causare confronti errati.
Che cos’è una data di scadenza?
Alcuni standard di riferimento hanno una data di scadenza stabilita.
Altri standard prevedono:
- verifica della validità;
- data di riqualificazione;
- stato attuale del lotto.
Il laboratorio deve verificare che lo standard sia idoneo e valido al momento dell’uso.
Che cos’è la riqualificazione?
La riqualificazione consiste nel rivalutare uno standard di riferimento.
Le analisi possibili includono:
- HPLC;
- LC-MS;
- dosaggio del peptide;
- contenuto d’acqua;
- confronto con uno standard primario.
La riqualificazione può essere necessaria dopo:
- periodo di utilizzo prestabilito;
- conservazione prolungata;
- cambiamento dell’aspetto;
- risultato analitico anomalo.
Perché gli standard delle impurità sono importanti?
Non solo il peptide desiderato può essere utilizzato come standard.
Anche le impurità o i prodotti di degradazione noti possono fungere da materiale di riferimento.
Esempi:
- prodotti di ossidazione;
- varianti deamидate;
- frammenti;
- sequenze di delezione;
- componenti correlati all’aggregazione.
Questi standard possono aiutare a identificare e quantificare i picchi secondari.
Che cosa sono gli standard di degradazione?
Uno standard di degradazione rappresenta una variante di degradazione nota.
Può essere utilizzato per esaminare:
- dove eluisce un prodotto di degradazione;
- quale massa molecolare è presente;
- quanto è sensibile il metodo analitico;
- la quantità di prodotto di degradazione presente.
Non tutti i prodotti di degradazione sono disponibili come standard puri.
Standard di riferimento e convalida del metodo
Un metodo analitico deve dimostrare di essere idoneo allo scopo previsto.
ICH Q2(R2) descrive i principi per la convalida delle procedure analitiche. Le caratteristiche rilevanti possono includere, tra le altre, specificità, accuratezza, precisione, linearità e intervallo di misurazione.
Gli standard di riferimento possono essere utilizzati per esaminare:
- accuratezza;
- specificità;
- linearità;
- intervallo quantitativo;
- prestazioni del metodo.
Che cos’è l’accuratezza?
L’accuratezza descrive quanto un risultato misurato sia vicino a un valore di riferimento accettato.
Uno standard ben caratterizzato può essere utilizzato per esaminare l’accuratezza di un metodo analitico.
Che cos’è la precisione?
La precisione descrive quanto sono vicini tra loro risultati di misurazioni ripetute.
Un metodo può fornire risultati molto precisi che tuttavia presentano una deviazione sistematica.
Pertanto, sono importanti sia la precisione sia l’accuratezza.
Che cos’è la specificità?
La specificità descrive se il metodo analitico è in grado di distinguere adeguatamente il componente desiderato dagli altri componenti.
Esempi:
- impurità;
- prodotti di degradazione;
- componenti della formulazione;
- controioni.
Uno standard di riferimento appropriato può aiutare a identificare il picco principale.
Due laboratori possono ottenere risultati diversi?
Sì.
Le differenze possono derivare da:
- standard di riferimento;
- metodo analitico;
- preparazione del campione;
- apparecchiature;
- calibrazione;
- elaborazione dei dati;
- incertezza di misura.
L’uso di standard ben caratterizzati e di metodi convalidati può migliorare la comparabilità.
Un peptide commerciale è automaticamente uno standard di riferimento?
No.
Un peptide commerciale può essere adatto come materiale di ricerca, ma non è automaticamente uno standard di riferimento qualificato.
Per poter essere utilizzato come standard, deve essere chiaro:
- identità;
- contenuto peptidico;
- purezza;
- contenuto d’acqua;
- contenuto di controioni;
- stabilità durante la conservazione;
- documentazione.
I requisiti dipendono dall’obiettivo analitico.
Standard di riferimento ufficiali di farmacopea
Le organizzazioni ufficiali rendono disponibili standard di riferimento per specifiche applicazioni compendiali.
Esempi:
- Standard di riferimento USP;
- Standard di riferimento della Farmacopea Europea;
- Sostanze chimiche di riferimento internazionali dell’OMS.
Questi standard sono destinati alle applicazioni descritte nei relativi metodi ufficiali o nella documentazione associata.
Non esiste uno standard ufficiale di farmacopea per ogni peptide di ricerca.
Limiti scientifici
Uno standard di riferimento migliora la comparabilità analitica, ma non risolve ogni difficoltà di misurazione.
L’affidabilità rimane dipendente da:
- metodo analitico;
- preparazione del campione;
- strumento;
- calibrazione;
- conservazione;
- elaborazione dei dati;
- incertezza di misura.
Un tempo di ritenzione HPLC corrispondente non dimostra da solo l’identità molecolare completa.
Una massa molecolare corrispondente non dimostra automaticamente:
- sequenza completa corretta;
- quantità esatta di peptide;
- assenza di tutte le impurità.
Pertanto, vengono utilizzate diverse tecniche analitiche complementari.
Riepilogo
Uno standard di riferimento peptidico è un materiale ben caratterizzato utilizzato come base di confronto analitico.
Gli standard di riferimento possono essere utilizzati per:
- identificazione;
- confronto HPLC;
- calibrazione;
- dosaggio del peptide;
- quantificazione;
- convalida del metodo;
- analisi delle impurità.
Uno standard primario viene caratterizzato in modo approfondito.
Uno standard secondario o di lavoro viene qualificato rispetto a un riferimento primario appropriato e può essere utilizzato per le analisi di routine.
Per le applicazioni quantitative, la sola purezza HPLC è generalmente insufficiente. Devono essere valutati anche il contenuto peptidico, l’acqua, i controioni e altri componenti rilevanti.
Un confronto analitico affidabile richiede:
- standard di riferimento appropriato;
- corretta assegnazione del valore;
- tracciabilità del lotto;
- conservazione controllata;
- metodo analitico convalidato;
- valutazione dell’incertezza di misura.
Fonti ufficiali e riferimenti scientifici
-
ICH Q2(R2) — Convalida delle procedure analitiche
Linea guida internazionale per la convalida delle procedure analitiche, inclusi specificità, accuratezza, precisione, linearità e intervallo di misurazione. -
USP — Standard di riferimento ufficiali
La USP descrive gli standard di riferimento come materiali ampiamente caratterizzati per, tra l’altro, la ricerca sull’identità, il titolo, la purezza e la qualità. -
Standard di riferimento della Farmacopea europea — EDQM
Il catalogo EDQM contiene standard di riferimento ufficialmente validi per le applicazioni descritte nella Farmacopea europea. -
OMS — Sostanze chimiche di riferimento internazionali
I WHO-ICRS sono stabiliti mediante procedure conformi alle linee guida dell’OMS per le sostanze chimiche di riferimento. -
NIST — Tracciabilità metrologica
NIST descrive la tracciabilità metrologica come una catena documentata e ininterrotta di tarature riconducibili a riferimenti specificati. -
NIST — Materiali di riferimento standard
NIST sviluppa e certifica materiali di riferimento con composizione o proprietà ben caratterizzate per supportare misurazioni affidabili e comparabili. -
FDA — Procedure analitiche e convalida dei metodi per farmaci e prodotti biologici
Le linee guida della FDA trattano l’uso e la qualificazione degli standard di riferimento nell’ambito della convalida dei metodi analitici.
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Categoria:
Conoscenza dei peptidi e controllo qualità
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