Purezza del peptide: cosa significa 99% HPLC?
Purezza del peptide spiegata: che cosa indica realmente una percentuale HPLC?
Per i peptidi destinati alla ricerca viene spesso indicata una percentuale di purezza. Valori come 98%, 99% o 99,5% di purezza vengono utilizzati regolarmente per descrivere la qualità di un peptide.
Una percentuale elevata sembra facile da interpretare: più alto è il numero, migliore è il prodotto. Nella pratica, la purezza del peptide è più complessa.
Un risultato HPLC fornisce informazioni sulla composizione relativa di un campione analizzato. Tuttavia, la percentuale non dimostra automaticamente:
- che sia presente il peptide corretto;
- che la sequenza degli amminoacidi sia completamente corretta;
- che la quantità dichiarata di peptide nella fiala sia corretta;
- che il materiale sia sterile;
- che sia privo di endotossine;
- che siano state misurate tutte le possibili impurità.
Per valutare accuratamente la qualità di un peptide, è necessario esaminare congiuntamente diversi dati analitici.
In questo articolo analizziamo come viene misurata la purezza del peptide, che cosa significa una percentuale HPLC e perché la purezza rappresenta solo un elemento del controllo qualità completo.
Che cosa significa purezza del peptide?
La purezza del peptide descrive quale parte dei componenti correlati al peptide rilevati corrisponde al componente principale nel campione analizzato.
Quando, ad esempio, un certificato di analisi indica una purezza HPLC del 99% indica, generalmente, che circa il 99% del segnale cromatografico integrato è stato attribuito al picco principale.
Ciò non significa automaticamente che il 99% del peso totale nella fiala sia costituito dal peptide desiderato.
Una fiala può contenere, oltre al peptide, anche altri componenti, come:
- acqua;
- controioni;
- sali;
- eccipienti;
- residui della produzione;
- componenti non rilevabili.
La percentuale HPLC e la quantità effettiva di peptide sono quindi parametri di qualità diversi.
Che cos’è l’HPLC?
HPLC sta per cromatografia liquida ad alte prestazioni.
È una tecnica analitica che consente di separare tra loro diversi componenti chimici presenti in un campione.
Durante un’analisi HPLC, un campione disciolto viene fatto passare attraverso una colonna. Questa colonna contiene una fase stazionaria.
Il liquido che scorre attraverso la colonna viene chiamato fase mobile.
Le diverse molecole non interagiscono tutte allo stesso modo con queste fasi. Di conseguenza, alcuni componenti attraversano la colonna più velocemente di altri.
Il risultato viene visualizzato in un cromatogramma.
Un cromatogramma è generalmente composto da:
- un asse orizzontale del tempo;
- un asse verticale del segnale;
- uno o più picchi.
Ogni picco rappresenta un componente rilevato o un gruppo di componenti.
Che cos'è un tempo di ritenzione?
Il tempo necessario a un componente per attraversare la colonna HPLC e raggiungere il rilevatore viene chiamato tempo di ritenzione.
Il tempo di ritenzione può essere influenzato da:
- tipo di colonna HPLC;
- composizione della fase mobile;
- temperatura;
- velocità di flusso;
- proprietà del peptide;
- metodo analitico utilizzato.
Un tempo di ritenzione corrispondente può essere utile per il confronto con uno standard di riferimento.
Tuttavia, il solo tempo di ritenzione è generalmente insufficiente per confermare definitivamente l'identità di un peptide.
In determinate condizioni, molecole diverse possono avere tempi di ritenzione simili.
Per questo motivo, la HPLC viene spesso combinata con la spettrometria di massa.
Come viene calcolata la percentuale di purezza?
In molte analisi HPLC, viene calcolata l'area sottesa a ciascun picco cromatografico.
Questa operazione viene chiamata integrazione dell'area dei picchi.
Un esempio semplificato:
- picco principale: 99%;
- picco secondario A: 0,5%;
- picco secondario B: 0,3%;
- altre picchi rilevati: 0,2%.
La purezza cromatografica riportata è quindi di circa il 99%.
Questo calcolo dipende da:
- metodo di rilevamento;
- impostazioni di integrazione;
- lunghezza d'onda selezionata;
- metodo analitico utilizzato;
- limite di rilevazione;
- concentrazione del campione.
Pertanto, una percentuale di purezza deve essere sempre interpretata nel contesto del metodo utilizzato.
Che cosa significa picco principale?
Il picco più grande in un cromatogramma viene spesso chiamato picco principale.
Per un peptide ben caratterizzato, ci si aspetta che questo picco corrisponda al peptide desiderato.
Tuttavia, ciò deve essere confermato analiticamente.
Un picco elevato non dimostra da solo la presenza della struttura molecolare corretta.
Per supportare l'identità, possono essere utilizzate tecniche aggiuntive, come:
- spettrometria di massa;
- analisi degli amminoacidi;
- analisi della sequenza;
- risonanza magnetica nucleare;
- confronto con uno standard di riferimento.
La HPLC descrive principalmente la composizione cromatografica del campione.
Quali impurità possono formarsi durante la sintesi peptidica?
Molti peptidi sintetici vengono prodotti mediante la sintesi peptidica in fase solida, generalmente abbreviata in SPPS.
Durante questo processo, gli amminoacidi vengono collegati gradualmente a una catena peptidica in crescita.
A ogni passaggio possono verificarsi piccole deviazioni di processo.
Le possibili impurità correlate ai peptidi sono:
Catene peptidiche accorciate
Quando un amminoacido non viene collegato correttamente, può formarsi una catena peptidica incompleta.
Questo viene anche chiamato prodotto di troncamento.
Sequenze di delezione
In una sequenza con delezione mancano uno o più amminoacidi dalla catena prevista.
Di conseguenza, la massa molecolare differisce da quella del peptide desiderato.
Varianti modificate chimicamente
Durante la produzione, la purificazione o la conservazione possono verificarsi cambiamenti chimici.
Esempi:
- ossidazione;
- deamidazione;
- idrolisi;
- isomerizzazione.
Residui di gruppi protettivi
Durante la sintesi peptidica vengono utilizzati gruppi protettivi temporanei per prevenire reazioni indesiderate.
Questi devono essere rimossi in seguito.
Una rimozione incompleta può contribuire alla presenza di componenti secondari.
Aggregati
Le molecole peptidiche possono formare strutture più grandi in determinate condizioni.
Non tutti i metodi HPLC rilevano o caratterizzano l’aggregazione nello stesso modo.
Una purezza HPLC del 99% equivale a un contenuto di peptide del 99%?
No.
Questa è una distinzione importante.
La purezza HPLC descrive generalmente la proporzione relativa dei componenti cromatografici rilevati.
Il contenuto di peptide descrive la quantità di peptide effettivamente presente rispetto al materiale totale.
Ad esempio, una fiala liofilizzata può contenere:
- il peptide desiderato;
- acqua;
- controioni;
- sali;
- eccipienti.
Questi componenti non vengono necessariamente misurati tutti nello stesso modo durante un’analisi HPLC standard.
Pertanto, un campione può avere un’elevata purezza cromatografica, mentre il contenuto totale di peptide è inferiore alla percentuale HPLC.
Per la determinazione quantitativa sono necessari metodi analitici aggiuntivi.
Che cos’è l’assay peptidico?
Un assay viene utilizzato per determinare la quantità o la concentrazione di un componente specifico.
A seconda dell’obiettivo dello studio, è possibile utilizzare diversi metodi.
Esempi:
- HPLC quantitativa con uno standard di riferimento;
- analisi degli amminoacidi;
- analisi dell’azoto;
- tecniche spettroscopiche;
- calcoli del bilancio di massa.
Un assay risponde a una domanda diversa rispetto a un’analisi standard della purezza.
L’analisi della purezza richiede:
Quale parte dei componenti peptidici rilevati appartiene al picco principale?
Un assay quantitativo richiede:
Quanto del peptide desiderato è effettivamente presente?
Entrambi i dati possono essere rilevanti per una caratterizzazione completa della qualità.
Perché è importante la spettrometria di massa?
La spettrometria di massa, spesso abbreviata in MS, misura il rapporto massa/carica delle molecole ionizzate.
Nell’analisi peptidica si può verificare se la massa molecolare misurata corrisponde alla massa teoricamente prevista.
La spettrometria di massa può contribuire a:
- conferma dell’identità;
- rilevamento di determinate modifiche;
- analisi dei prodotti di degradazione;
- confronto delle varianti peptidiche.
Quando la massa misurata corrisponde alla massa attesa, ciò supporta l’identificazione.
Tuttavia, la spettrometria di massa non fornisce automaticamente informazioni complete su:
- percentuale di purezza;
- quantità esatta;
- sterilità;
- endotossine;
- attività biologica.
Pertanto, HPLC e spettrometria di massa si completano a vicenda.
Che cos’è l’LC-MS?
L’LC-MS combina la cromatografia liquida con la spettrometria di massa.
Prima i componenti vengono separati cromatograficamente. Successivamente, i singoli segnali vengono esaminati ulteriormente mediante spettrometria di massa.
Questa combinazione può fornire informazioni su:
- tempo di ritenzione;
- massa molecolare;
- possibili impurità;
- prodotti di degradazione;
- modificazioni chimiche.
L’LC-MS può quindi fornire più informazioni analitiche rispetto a una singola tecnica.
La qualità dei risultati rimane dipendente da:
- preparazione del campione;
- impostazioni dello strumento;
- validazione del metodo;
- materiali di riferimento;
- interpretazione da parte di esperti.
Perché laboratori diversi possono misurare risultati differenti?
Lo stesso peptide può produrre risultati leggermente diversi in laboratori diversi.
Le possibili cause sono:
- diverse colonne HPLC;
- diverse fasi mobili;
- gradienti differenti;
- diverse lunghezze d’onda di rilevazione;
- differenze nella preparazione del campione;
- diverse impostazioni di integrazione;
- variazioni dello strumento.
Una differenza non significa automaticamente che una delle analisi sia errata.
Per confrontare correttamente i risultati, è necessario esaminare anche il metodo analitico.
Una percentuale senza informazioni sul metodo fornisce solo un contesto limitato.
Che cos’è la validazione del metodo?
Un metodo analitico deve essere dimostrabilmente idoneo allo scopo previsto.
Questo viene chiamato validazione del metodo.
Le possibili caratteristiche da validare sono:
- specificità;
- accuratezza;
- precisione;
- linearità;
- intervallo di misurazione;
- limite di rilevazione;
- limite di quantificazione;
- robustezza.
Un metodo per l’identificazione non è automaticamente adatto alla quantificazione esatta.
Pertanto, è necessario definire in anticipo quale quesito analitico si intende esaminare.
Che cos’è il limite di rilevazione?
Ogni metodo analitico ha una soglia al di sotto della quale un componente non può essere rilevato in modo affidabile.
Questo viene chiamato limite di rilevazione.
Un componente che non è visibile in un cromatogramma non è quindi automaticamente del tutto assente.
La concentrazione può essere inferiore al limite di rilevazione.
Inoltre, alcune sostanze possono:
- non reagire al rivelatore utilizzato;
- rientrare al di fuori dell’intervallo di misurazione;
- andare persi durante la preparazione del campione;
- non essere sufficientemente separati.
L’espressione «non rilevato» non è quindi sempre sinonimo di «non presente».
È possibile manipolare un cromatogramma?
Un cromatogramma deve contenere informazioni sufficienti per poter essere valutato professionalmente.
I dati importanti sono:
- nome del prodotto;
- numero di lotto;
- data dell’analisi;
- metodo utilizzato;
- impostazioni del rivelatore;
- tempi di ritenzione;
- integrazione dei picchi;
- dati di laboratorio.
Una semplice immagine con un unico picco di grandi dimensioni e una percentuale offre una verificabilità limitata.
Anche le impostazioni di integrazione possono influire sui segnali inclusi nel calcolo.
La trasparenza nella documentazione è pertanto importante.
Quali informazioni deve contenere un COA affidabile?
Un Certificate of Analysis può contenere, tra le altre cose:
- nome del peptide;
- sequenza amminoacidica;
- numero di lotto;
- data di produzione;
- data del test;
- risultato HPLC;
- cromatogramma;
- risultato della spettrometria di massa;
- massa molecolare teorica;
- massa molecolare misurata;
- metodi analitici utilizzati;
- nome del laboratorio.
Non tutti i COA contengono tutte le sezioni.
Le informazioni necessarie dipendono dal prodotto e dall’obiettivo della ricerca.
Un COA dettagliato può offrire maggiore trasparenza, ma l’affidabilità dipende anche dalla qualità dell’analisi.
È sempre necessaria un’elevata purezza?
La purezza desiderata dipende dall’obiettivo della ricerca.
In alcune applicazioni analitiche, quantità molto ridotte di componenti secondari possono influire su:
- risultati delle misurazioni;
- ricerca sui recettori;
- ricerca cellulare;
- riproducibilità.
In tal caso, può essere auspicabile un livello di purezza più elevato.
Tuttavia, una percentuale più elevata non significa automaticamente che tutte le altre caratteristiche qualitative siano migliori.
Un peptide con una purezza HPLC del 99,5%, ad esempio, può comunque:
- contenere una quantità diversa da quella prevista;
- essere stati conservati in modo errato;
- non essere stati identificati adeguatamente;
- contenere una quantità elevata di umidità residua;
- avere una confezione danneggiata.
La qualità deve pertanto essere valutata in modo multidimensionale.
Purezza e differenze tra i lotti
Ogni lotto di produzione ha un proprio processo di produzione e analisi.
Pertanto, i risultati di purezza possono variare tra i lotti.
L’analisi di un singolo lotto non deve essere automaticamente utilizzata come prova per tutti i lotti futuri.
L’analisi specifica del lotto supporta:
- tracciabilità;
- confronto;
- controllo qualità;
- indagine sulle deviazioni.
Il numero di lotto sulla fiala deve pertanto corrispondere al numero riportato sul certificato di analisi.
Purezza e stabilità
Un’elevata purezza iniziale non garantisce che venga mantenuta durante la conservazione prolungata.
I possibili processi di degradazione sono:
- ossidazione;
- idrolisi;
- deamidazione;
- aggregazione.
La velocità è influenzata da:
- temperatura;
- umidità;
- luce;
- ossigeno;
- sequenza amminoacidica;
- confezione.
Gli studi di stabilità possono essere utilizzati per monitorare nel tempo i cambiamenti nel profilo cromatografico.
Limitazioni scientifiche
Nessun metodo analitico, preso singolarmente, offre un quadro completo della qualità del peptide.
L’HPLC può fornire informazioni importanti sulla purezza cromatografica, ma presenta dei limiti.
Una percentuale HPLC non dimostra automaticamente:
- identità;
- quantità esatta di peptide;
- sequenza amminoacidica;
- sterilità;
- contenuto di endotossine;
- attività biologica;
- stabilità a lungo termine.
Per questo vengono combinati diversi metodi analitici.
Una valutazione completa della qualità può includere:
- HPLC;
- spettrometria di massa;
- saggio quantitativo;
- analisi dell’umidità;
- studio di stabilità;
- test aggiuntivi specifici per il prodotto.
Riepilogo
La purezza del peptide è un importante parametro di qualità, ma una percentuale HPLC deve essere interpretata correttamente.
Un valore del 99% indica generalmente che circa il 99% del segnale cromatografico integrato è stato attribuito al picco principale.
Non significa automaticamente che:
- il 99% del peso della fiala sia costituito da peptide;
- l’identità sia stata confermata completamente;
- la quantità dichiarata sia corretta;
- il materiale sia sterile;
- siano state escluse tutte le possibili impurità.
Per una valutazione più ampia della qualità, i risultati HPLC devono essere combinati con altri dati, come:
- spettrometria di massa;
- informazioni sul lotto;
- analisi quantitativa;
- dati di conservazione;
- studi di stabilità.
La qualità dei peptidi, pertanto, comprende più di una sola percentuale.
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