Analiza aminokwasów w peptydach wyjaśniona

Analiza aminokwasowa peptydów: wyjaśnienie składu i oznaczania ilościowego

Peptydy składają się z łańcuchów aminokwasów. Kolejność tych aminokwasów w dużej mierze decyduje o właściwościach chemicznych i strukturalnych peptydu.

W badaniach jakości techniki takie jak HPLC i spektrometria mas są często wykorzystywane do oceny czystości i masy cząsteczkowej. Uzupełniającą metodą analityczną jest analiza aminokwasowa, często skracana do AAA.

Analizę aminokwasową można wykorzystać do zbadania:

które aminokwasy są obecne w próbce;
w jakim stopniu zmierzone proporcje aminokwasów odpowiadają oczekiwanemu składowi;
ile peptydu jest obecne;
czy skład aminokwasowy odpowiada teoretycznemu peptydowi;
jak można obliczyć zawartość netto peptydu.

Metoda ta działa inaczej niż HPLC i spektrometria mas. W klasycznej analizie aminokwasowej łańcuch peptydowy jest najpierw rozkładany na poszczególne aminokwasy. Następnie aminokwasy te są rozdzielane, wykrywane i oznaczane ilościowo.

Analiza aminokwasowa może dostarczyć cennych informacji, ale ma również ograniczenia. Podczas rozkładu niektóre aminokwasy mogą częściowo ulec zmianie lub zostać utracone. Dlatego wyniki należy zawsze interpretować w kontekście zastosowanej metody.

Czym jest analiza aminokwasowa?

Analiza aminokwasowa to technika laboratoryjna służąca do badania składu aminokwasowego próbki.

W analizie klasycznej zazwyczaj wykonuje się następujące etapy:

przygotowanie próbki;
hydroliza łańcucha peptydowego;
uwolnienie poszczególnych aminokwasów;
rozdzielenie aminokwasów;
wykrywanie i oznaczanie ilościowe;
porównanie z oczekiwanym składem.

Wynik można przedstawić jako:

ilość poszczególnych aminokwasów;
stosunek molowy;
stężenie masowe;
profil aminokwasowy;
obliczona zawartość peptydu.

Czym jest hydroliza?

Hydroliza to proces chemiczny, w którym wiązania są rozszczepiane za pomocą wody.

W analizie aminokwasowej wiązania peptydowe są rozszczepiane, dzięki czemu uwalniają się poszczególne aminokwasy.

Powszechnie stosowaną metodą jest hydroliza kwasowa.

W tym celu próbkę poddaje się przez określony czas działaniu:

silny kwas;
podwyższona temperatura;
kontrolowane warunki.

Po hydrolizie pierwotny łańcuch peptydowy nie występuje już jako nienaruszona cząsteczka.

Uwolnione aminokwasy można następnie badać oddzielnie.

Dlaczego łańcuch peptydowy jest rozkładany?

Nienaruszony peptyd może zawierać dziesiątki różnych reszt aminokwasowych.

Rozrywając łańcuch, można zmierzyć całkowitą ilość każdego aminokwasu.

Załóżmy, że teoretyczny peptyd zawiera:

cztery reszty alaniny;
dwie reszty glicyny;
trzy reszty leucyny;
jedną resztę tyrozyny.

Po hydrolizie można sprawdzić, czy zmierzone proporcje w przybliżeniu odpowiadają temu teoretycznemu składowi.

Pomaga to w ocenie składu aminokwasowego.

Jaka jest różnica między składem aminokwasowym a kolejnością aminokwasów?

Analiza aminokwasów mierzy przede wszystkim jakie aminokwasy są obecne i w jakiej ilości.

Metoda nie określa automatycznie dokładnej kolejności.

Dwa różne peptydy mogą mieć taki sam skład aminokwasowy, ale inną kolejność.

Na przykład:

Ala-Gly-Leu;
Leu-Gly-Ala.

Oba zawierają:

jedną alaninę;
jedna glicyna;
jedną leucynę.

Mimo to sekwencja jest inna.

Do badania sekwencji potrzebne są inne techniki, takie jak:

tandemowa spektrometria mas;
analiza fragmentów;
specyficzne metody sekwencjonowania.

Czy analiza aminokwasów może potwierdzić tożsamość?

Analiza aminokwasów może potwierdzać oczekiwany skład.

Jeśli zmierzony profil aminokwasowy znacznie odbiega od składu teoretycznego, może to stanowić podstawę do dalszych badań.

Jednak zgodny profil sam w sobie nie dowodzi, że dokładna sekwencja aminokwasów jest prawidłowa.

W celu szerszej oceny tożsamości można połączyć:

masa cząsteczkowa;
LC-MS;
MS/MS;
analiza aminokwasów;
dane chromatograficzne.

Jak rozdziela się aminokwasy?

Po hydrolizie próbka zawiera mieszaninę wolnych aminokwasów.

Należy je rozdzielić analitycznie.

Możliwe techniki to:

chromatografia jonowymienna;
HPLC;
UPLC;
elektroforeza kapilarna.

Wybór techniki zależy od:

wymagana czułość;
metoda laboratoryjna;
typ próbki;
wymagana dokładność.

Czym jest derywatyzacja?

Wiele aminokwasów ma bez dodatkowego przygotowania ograniczoną wykrywalność.

Dlatego można je chemicznie połączyć z wykrywalną grupą.

Nazywa się to derywatyzacją.

Derywatyzacja może zachodzić:

przed rozdzieleniem chromatograficznym;
po rozdzieleniu chromatograficznym.

Powstałe pochodne można lepiej mierzyć na przykład za pomocą:

detekcja UV;
detekcja fluorescencyjna;
spektrometria mas.

Derywatyzacja przedkolumnowa

W derywatyzacji przedkolumnowej aminokwasy są znakowane przed rozdzieleniem chromatograficznym.

Następnie powstałe pochodne są rozdzielane za pomocą kolumny.

Możliwe korzyści to:

wysoka czułość;
odpowiednia detekcja fluorescencyjna;
analiza wielu aminokwasów.

Reakcja musi przebiegać w sposób powtarzalny.

Niepełna derywatyzacja może wpływać na oznaczanie ilościowe.

Derywatyzacja postkolumnowa

W derywatyzacji postkolumnowej aminokwasy są najpierw rozdzielane.

Po opuszczeniu kolumny reagują z odczynnikiem detekcyjnym.

Znanym przykładem jest analiza z użyciem ninhydryny.

Powstałe produkty reakcji można następnie mierzyć optycznie.

W jaki sposób określa się ilość aminokwasu?

Do oznaczania ilościowego stosuje się wzorce referencyjne.

Roztwory wzorcowe zawierają znane ilości aminokwasów.

Mierzy się je w celu ustalenia zależności między:

stężenia;
sygnału detektora.

Następnie mierzy się nieznaną próbkę.

Na podstawie danych kalibracyjnych można obliczyć ilość każdego aminokwasu.

Czym jest standard wewnętrzny?

Standard wewnętrzny to znana substancja dodawana do próbek i roztworów kalibracyjnych.

Może pomóc skorygować zmienność podczas:

przygotowanie próbki;
wstrzykiwania;
derywatyzacja;
analizy.

Standard wewnętrzny musi dać się dobrze odróżnić analitycznie od badanych aminokwasów.

W jaki sposób analiza aminokwasów pozwala określić zawartość peptydu?

Gdy znany jest skład aminokwasowy peptydu, wybrane aminokwasy można wykorzystać do obliczenia ilości peptydu.

Załóżmy, że każdy łańcuch peptydowy zawiera dokładnie cztery reszty alaniny.

Po zmierzeniu całkowitej ilości alaniny można na tej podstawie oszacować, ile łańcuchów peptydowych było obecnych.

Obliczenia uwzględniają:

liczba reszt w peptydzie;
masa cząsteczkowa;
zmierzona ilość aminokwasu;
metoda analityczna.

Można to wykorzystać do ilościowego oznaczania peptydu.

Dlaczego nie zawsze wykorzystuje się wszystkie aminokwasy?

Nie każdy aminokwas jest równie odpowiedni do oznaczania ilościowego.

Niektóre aminokwasy mogą podczas hydrolizy:

ulegać częściowemu rozkładowi;
zmieniać się chemicznie;
uwalniane niecałkowicie;
trudne do wiarygodnego zmierzenia.

Dlatego często wybiera się stabilne aminokwasy.

Wybór zależy od sekwencji peptydu i metody analitycznej.

Które aminokwasy mogą ulegać zmianom podczas hydrolizy?

Hydroliza kwasowa może mieć różne skutki.

Tryptofan

Tryptofan może w dużej mierze ulec rozkładowi podczas standardowej hydrolizy kwasowej.

Dlatego w przypadku konieczności specyficznego pomiaru tryptofanu potrzebne są zmodyfikowane metody.

Asparagina

Asparagina może podczas hydrolizy zostać przekształcona w asparaginian.

W związku z tym w analizie klasycznej asparagina i asparaginian nie zawsze są raportowane oddzielnie.

Glutamina

Glutamina może zostać przekształcona w glutaminian.

Dzięki temu glutamina i glutaminian mogą być przedstawiane łącznie.

Seryna

Seryna może częściowo ulec utracie podczas długotrwałej hydrolizy.

Treonina

Również treonina może częściowo ulegać degradacji.

Cysteina

Cysteina może ulegać zmianom oksydacyjnym.

W celu uzyskania wiarygodnej analizy może być konieczne wstępne utlenianie lub zastosowanie zmodyfikowanej metody.

Dlaczego czas hydrolizy jest ważny?

Wiązania peptydowe muszą zostać wystarczająco rozłożone.

Zbyt krótka hydroliza może prowadzić do:

niepełna degradacja;
zaniżonych zmierzonych wartości aminokwasów.

Zbyt długa hydroliza może prowadzić do:

dalszy rozkład wrażliwych aminokwasów;
straty pomiarowe.

Dlatego czas i temperatura hydrolizy są kontrolowane.

Czasami stosuje się kilka czasów hydrolizy, aby zbadać straty lub niepełną degradację.

Co to jest stosunek molowy?

Stosunek molowy opisuje względną liczbę aminokwasów.

Załóżmy, że peptyd teoretycznie zawiera:

dwie alaniny;
jedna glicyna;
trzy leucyny.

Teoretyczny stosunek molowy wynosi:

2 : 1 : 3

Po analizie zmierzone wartości można znormalizować.

Gdy stosunek jest zbliżony do wartości teoretycznej, potwierdza to oczekiwany skład aminokwasowy.

Niewielkie odchylenia mogą powstawać z powodu:

niepewność pomiaru;
straty podczas hydrolizy;
derywatyzacja;
całkowanie pików chromatograficznych.

Co oznacza normalizacja?

Podczas normalizacji zmierzone wartości aminokwasów przelicza się na względne proporcje.

Odpowiedni aminokwas może służyć jako punkt odniesienia.

Dzięki temu zmierzony profil można porównać ze składem teoretycznym.

Normalizacja jest przydatna do badania składu, ale nie określa automatycznie bezwzględnej ilości peptydu.

Analiza aminokwasów a czystość HPLC

Czystość HPLC i analiza aminokwasów mierzą różne właściwości.

Czystość HPLC zazwyczaj bada:

główny pik chromatograficzny;
względną ilość pików dodatkowych.

Analiza aminokwasów bada:

skład aminokwasowy;
ilość wybranych aminokwasów;
możliwe oznaczanie ilościowe peptydu.

Wysoka czystość HPLC nie dowodzi automatycznie, że skład aminokwasowy jest prawidłowy.

Odpowiedni skład aminokwasowy nie dowodzi automatycznie braku zanieczyszczeń związanych z peptydami.

Techniki wzajemnie się uzupełniają.

Analiza aminokwasów a spektrometria mas

Spektrometria mas bada stosunek masy do ładunku cząsteczek.

Nienaruszony pomiar masy może potwierdzić, że masa cząsteczkowa odpowiada wartości teoretycznej.

Analiza aminokwasów bada ilość i proporcje aminokwasów po hydrolizie.

Obie techniki mają różne zalety.

Połączenie może dostarczyć więcej informacji na temat:

tożsamość;
skład;
zawartość peptydu.

Analiza aminokwasów a oznaczanie zawartości peptydu

Analiza aminokwasów może być stosowana jako metoda oznaczania zawartości.

Oznaczanie zawartości peptydu ma na celu:

określić ilość peptydu.

Analiza aminokwasów jest jedną z technik, za pomocą których można osiągnąć ten cel.

Inne możliwe metody oznaczania zawartości to:

ilościowa HPLC;
spektrofotometria UV;
ilościowe oznaczanie metodą LC-MS;
bilans masy.

Jaki wpływ mają przeciwjony?

Przeciwjony, takie jak:

octan;
chlorek;
TFA;

przyczyniają się do całkowitej masy materiału liofilizowanego.

W analizie aminokwasów bada się głównie składniki aminokwasowe peptydu.

Dzięki temu metoda może pomóc odróżnić:

całkowita masa materiału;
rzeczywista ilość peptydu.

Do sporządzenia pełnego bilansu masy mogą być potrzebne dodatkowe analizy.

Jaki wpływ ma pozostała wilgoć?

Pozostała wilgoć przyczynia się do całkowitej masy, ale nie do składu aminokwasowego.

Podczas obliczania zawartości netto peptydu analiza wilgotności może dostarczyć dodatkowych informacji.

Rozszerzony bilans masy może obejmować:

zawartość peptydu;
zawartość wody;
zawartość przeciwjonów;
pozostałe składniki.

Czy analiza aminokwasów może wykazać zanieczyszczenia?

Niektóre nietypowe sygnały aminokwasów mogą wskazywać na obecność nieoczekiwanych składników.

Metoda nie została jednak zaprojektowana do wykrywania każdego możliwego zanieczyszczenia.

Do określenia innych parametrów mogą być potrzebne:

zanieczyszczenia organiczne;
pozostałości rozpuszczalników;
metale;
zanieczyszczenia mikrobiologiczne;
endotoksyny.

Co może znajdować się w COA?

Certyfikat analizy może zawierać takie informacje jak:

badanie: analiza aminokwasów;
metoda analityczna;
zmierzone proporcje aminokwasów;
proporcje teoretyczne;
obliczona zawartość peptydu;
data badania;
numer partii.

Nie każdy COA zawiera analizę aminokwasów.

Jeżeli wykonano wyłącznie HPLC i MS, nie można na tej podstawie określić pełnej ilościowej zawartości aminokwasów.

Dlaczego powiązanie z partią jest ważne?

Analiza aminokwasów musi być powiązana z badaną partią.

Ważne dane to:

numer serii;
nazwa produktu;
data analizy;
laboratorium;
metoda analityczna.

Raport analityczny bez wyraźnego powiązania z partią ma mniejszą wartość z punktu widzenia identyfikowalności.

Co oznacza niepewność pomiaru?

Każda analiza ilościowa wiąże się z niepewnością pomiaru.

Źródłami zmienności w analizie aminokwasów mogą być:

przygotowanie próbki;
hydroliza;
utrata aminokwasów;
derywatyzacja;
kalibracja;
rozdział chromatograficzny;
integracja pików.

Dlatego wyników nie należy uznawać za absolutnie bezbłędne.

Dlaczego walidacja metody jest ważna?

Metoda musi być odpowiednia do zamierzonego celu.

W ilościowej analizie aminokwasów istotnymi cechami walidacyjnymi mogą być:

dokładność;
precyzja;
liniowość;
specyficzność;
zakres pomiarowy;
odporność na zakłócenia;
powtarzalność.

Metoda odpowiednia do jakościowego profilu aminokwasowego nie jest automatycznie wystarczająca do dokładnego ilościowego oznaczania peptydu.

Ograniczenia naukowe

Analiza aminokwasów ma istotne ograniczenia.

Metoda nie określa samodzielnie:

dokładna sekwencja aminokwasów;
masa cząsteczkowa;
czystość HPLC;
struktura trójwymiarowa;
aktywność biologiczna;
sterylność;
zawartość endotoksyn.

Ponadto niektóre aminokwasy mogą ulegać zmianom podczas hydrolizy.

W celu szerokiej oceny jakości należy połączyć kilka technik analitycznych.

Podsumowanie

Analiza aminokwasów bada skład i ilość aminokwasów w peptydzie.

W analizie klasycznej łańcuch peptydowy jest najpierw rozkładany w procesie hydrolizy.

Następnie aminokwasy są:

rozdzielone;
wykryte;
oznaczone ilościowo;
porównana ze składem teoretycznym.

Analizę aminokwasów można wykorzystać do:

kontrola składu aminokwasowego;
ocena stosunków molowych;
oznaczanie zawartości peptydu;
potwierdzenie tożsamości.

Metoda ma ograniczenia, ponieważ niektóre aminokwasy mogą ulegać zmianom podczas hydrolizy.

Dlatego analizę aminokwasów najlepiej łączyć z:

HPLC;
LC-MS;
MS/MS;
oznaczenie peptydu;
analiza wilgotności resztkowej;
analiza przeciwjonów.

Zastrzeżenie dotyczące badań

Peptydy badawcze Peptidera są oferowane wyłącznie do Research Use Only (RUO) i przeznaczone do badań laboratoryjnych oraz zastosowań analitycznych.

Nieprzeznaczone do spożycia przez ludzi ani zwierzęta, do użytku diagnostycznego, zastosowań terapeutycznych ani samodzielnego podawania.

Wiedza o peptydach i kontrola jakości

Powiązane produkty Peptidera:
Liofilizowane peptydy badawcze z identyfikacją partii i dostępnymi danymi dotyczącymi jakości analitycznej

Powiązane blogi wewnętrzne:

PB-0230 — Czystość peptydu i HPLC
PB-0231 — Spektrometria mas peptydów
PB-0233 — Oznaczenie peptydu: czystość a zawartość peptydu
PB-0234 — Wilgotność resztkowa w liofilizowanych peptydach
PB-0238 — Przeciwjony w peptydach

Propozycje linków wewnętrznych:

Link do PB-0233 dotyczącego analizy aminokwasów jako oznaczenia peptydu
Link do PB-0230 dotyczącego różnicy względem czystości HPLC
Link do PB-0231 dotyczącego masy cząsteczkowej i analizy sekwencji
Link do PB-0234 dotyczącego wilgotności resztkowej i zawartości netto peptydu
Link do PB-0238 dotyczącego przeciwjonów i bilansu masy
Link do strony Peptidera z certyfikatami analizy
Link do kolekcji peptydów badawczych

Kraj/region

Język