Spektrometria masowa peptydów wyjaśniona

Spektrometria mas peptydów: jak bada się tożsamość molekularną?

W kontroli jakości peptydów badawczych często łączy się kilka technik analitycznych. HPLC może dostarczyć informacji o czystości chromatograficznej, ale wysoki główny pik nie dowodzi automatycznie, że obecny jest właściwy peptyd.

W celu dokładniejszego zbadania tożsamości molekularnej często stosuje się spektrometrię mas.

Spektrometria mas, zwykle skracana do MS, to technika analityczna służąca do pomiaru stosunku masy do ładunku zjonizowanych cząsteczek. W analizie peptydów zmierzoną masę cząsteczkową można porównać z teoretycznie oczekiwaną masą wynikającą z sekwencji aminokwasów.

Gdy wartości te są zgodne, potwierdza to identyfikację badanego peptydu. Jednak spektrometria mas również nie przedstawia samodzielnie pełnego obrazu jakości.

W tym artykule omawiamy, jak działa spektrometria mas, dlaczego peptydy mogą generować wiele sygnałów masowych oraz jak interpretuje się wyniki MS wraz z HPLC i innymi metodami analitycznymi.

---

Czym jest spektrometria mas?

Spektrometria mas to technika analityczna, w której cząsteczki są przekształcane w naładowane cząstki, czyli jony.

Jony te są następnie rozdzielane i mierzone na podstawie ich stosunku masy do ładunku.

Stosunek ten jest przedstawiany jako:

m/z

Oznaczenia te przedstawiają:

• m masy;
• z ładunku elektrycznego.

Spektrometr mas nie zawsze mierzy więc bezpośrednio pełną masę cząsteczkową. Instrument mierzy stosunek masy do ładunku.

W przypadku większych cząsteczek, w tym wielu peptydów, mogą powstawać jony o wielu ładunkach. W rezultacie ten sam peptyd może być widoczny w różnych miejscach widma masowego.

---

Dlaczego spektrometria mas jest stosowana w analizie peptydów?

Peptyd składa się z określonej sekwencji aminokwasów.

Każda kombinacja aminokwasów ma teoretycznie obliczalną masę cząsteczkową.

Spektrometrię mas można wykorzystać do sprawdzenia, czy zmierzona masa odpowiada tej wartości teoretycznej.

Analiza MS może pomóc w:

• potwierdzenie tożsamości molekularnej;
• porównanie z teoretyczną masą cząsteczkową;
• wykrywanie określonych modyfikacji chemicznych;
• analiza produktów degradacji;
• badanie wariantów peptydu;
• porównanie między partiami produkcyjnymi.

Zgodna masa potwierdza tożsamość peptydu.

Wynik należy jednak zawsze oceniać w połączeniu z metodą analityczną i innymi danymi jakościowymi.

---

Jaka jest teoretyczna masa cząsteczkowa?

Teoretyczna masa cząsteczkowa jest obliczana na podstawie:

• sekwencja aminokwasów;
• liczba aminokwasów;
• ewentualne modyfikacje chemiczne;
• forma cząsteczki;
• specyficzne grupy końcowe.

Gdy aminokwasy łączą się, tworząc łańcuch peptydowy, powstają wiązania peptydowe.

Podczas powstawania każdego wiązania peptydowego odszczepiana jest cząsteczka wody. Dlatego masa całego peptydu nie jest po prostu sumą mas wszystkich wolnych aminokwasów.

Również modyfikacje mogą wpływać na masę.

Przykłady:

• amidacja;
• acetylacja;
• fosforylacja;
• utlenianie;
• dodawanie łańcuchów kwasów tłuszczowych;
• tworzenie mostków disiarczkowych.

Dlatego masę teoretyczną należy obliczyć dla dokładnej struktury cząsteczki.

---

Co oznacza ciężar cząsteczkowy?

Terminy masa cząsteczkowa i ciężar cząsteczkowy są często używane zamiennie.

W raportach laboratoryjnych wartość jest zwykle podawana w:

• dalton, w skrócie Da;
• kilodalton, w skrócie kDa.

Jeden dalton odpowiada w przybliżeniu masie jednego atomu wodoru.

Peptyd o masie cząsteczkowej 3 000 Da ma zatem masę około 3 kDa.

Masa cząsteczkowa peptydów może się znacznie różnić w zależności od:

• długość łańcucha;
• skład aminokwasowy;
• modyfikacje chemiczne.

---

Jak działa spektrometr mas?

Spektrometr mas zwykle składa się z kilku elementów.

1. Wprowadzanie próbki

Peptyd jest najpierw przygotowywany, a następnie wprowadzany do aparatu.

Na przygotowanie próbki mogą wpływać:

• intensywność sygnału;
• wykrywalność;
• powstawanie jonów;
• sygnały tła.

2. Jonizacja

Cząsteczki zostają naładowane elektrycznie.

Powszechnie stosowane techniki analizy peptydów to:

• jonizacja przez rozpylanie elektrorozpraszające;
• desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą.

3. Analiza masy

Powstałe jony są rozdzielane na podstawie ich stosunku masy do ładunku.

4. Detekcja

Detektor rejestruje jony.

5. Przetwarzanie danych

Zmierzony sygnały są przekształcane w widmo masowe.

Widmo to zawiera piki odpowiadające wykrytym jonom.

---

Czym jest jonizacja przez rozpylanie elektrorozpraszające?

Jonizacja przez rozpylanie elektrorozpraszające, w skrócie ESI, to powszechnie stosowana technika jonizacji peptydów.

Podczas ESI ciekła próbka jest przepuszczana przez niewielki otwór, na który przykładane jest napięcie elektryczne.

W ten sposób powstają elektrycznie naładowane krople.

Gdy rozpuszczalnik odparowuje, pozostają naładowane cząsteczki.

Ważną cechą ESI jest to, że większe cząsteczki mogą uzyskać wiele ładunków elektrycznych.

Peptyd może na przykład występować jako:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Litera M oznacza masę cząsteczkową peptydu.

W wyniku powstania wielu ładunków dla tej samej cząsteczki powstają różne sygnały m/z.

---

Dlaczego jeden peptyd ma wiele pików?

Gdy peptyd przyjmuje wiele protonów, powstają różne formy jonowe.

Załóżmy, że peptyd ma masę cząsteczkową wynoszącą około 3 000 Da.

Mogelijke signalen zijn dan ongeveer:

• jeden ładunek dodatni: m/z około 3.001;
• dwa ładunki dodatnie: m/z około 1.501;
• trzy ładunki dodatnie: m/z około 1.001.

Wszystkie te sygnały mogą pochodzić od tego samego peptydu.

Oprogramowanie może wykorzystać ten rozkład ładunków do obliczenia pierwotnej masy cząsteczkowej.

Proces ten nazywa się dekonwolucją.

---

Czym jest zdekonwolutowane widmo mas?

Surowy pomiar ESI może zawierać wiele pików odpowiadających różnym ładunkom.

Może to utrudniać interpretację.

Za pomocą oprogramowania do dekonwolucji różne formy jonów o różnych ładunkach są przeliczane na jedną szacunkową masę cząsteczkową.

Zdekonwolutowane widmo można dzięki temu łatwiej porównać z:

• masa teoretyczna;
• wzorzec referencyjny;
• specyfikacje produktu.

Jakość obliczeń zależy od:

• intensywność sygnału;
• rozdzielczość;
• szum tła;
• ustawienia oprogramowania;
• obecność nakładających się składników.

---

Czym jest MALDI?

Desorpcja/ionizacja laserowa wspomagana matrycą, w skrócie MALDI, to inna technika jonizacji.

Peptyd miesza się z materiałem matrycy i nanosi na płytkę pomiarową.

Laser aktywuje matrycę, w wyniku czego powstają jony peptydowe.

MALDI często wytwarza głównie jony jednokrotnie naładowane.

Dzięki temu widmo może wydawać się prostsze niż widmo ESI.

MALDI jest często łączone z analizatorem mas typu time-of-flight.

To połączenie określa się jako:

MALDI-TOF

---

Czym jest time-of-flight?

W analizatorze mas typu time-of-flight jony są przyspieszane przez pole elektryczne.

Następnie przemieszczają się przez rurę pomiarową.

Jony o niższym stosunku masy do ładunku zazwyczaj docierają do detektora szybciej niż jony o wyższym stosunku.

Czas przelotu służy do obliczenia wartości m/z.

Systemy TOF mogą być stosowane do:

• identyfikacja peptydów;
• oznaczanie masy;
• porównanie wariantów molekularnych.

Ostateczna dokładność zależy od kalibracji, ustawień aparatury i przygotowania próbki.

---

Czym jest LC-MS?

Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas, w skrócie LC-MS, łączy chromatografię cieczową ze spektrometrią mas.

Składniki są najpierw rozdzielane chromatograficznie.

Następnie poszczególne sygnały są analizowane przez spektrometr mas.

LC-MS może łączyć informacje dotyczące:

• czas retencji;
• profil chromatograficzny;
• masa cząsteczkowa;
• potencjalne zanieczyszczenia;
• produkty degradacji.

Dzięki temu LC-MS może dostarczyć więcej informacji niż oddzielna analiza HPLC lub MS.

---

Jaka jest różnica między HPLC a spektrometrią mas?

HPLC i spektrometria mas odpowiadają na różne pytania analityczne.

HPLC

HPLC może dostarczyć informacji o:

• dokładna ilość;
• względna ilość wykrytych składników;
• czasy retencji;
• zmiany w profilu chromatograficznym.

Spektrometria mas

Spektrometria mas może dostarczyć informacji o:

• masa cząsteczkowa;
• możliwa tożsamość;
• modyfikacje chemiczne;
• niektóre produkty rozpadu.

Uproszczone porównanie:

Dlatego obie techniki są często łączone.

---

Czy różne peptydy mogą mieć taką samą masę cząsteczkową?

Tak.

Różne sekwencje aminokwasów mogą mieć taką samą lub prawie taką samą masę całkowitą.

Struktury te są czasami nazywane strukturami izobarycznymi.

Odpowiadająca masa nie zawsze dowodzi zatem, że cała sekwencja aminokwasowa jest prawidłowa.

W celu dokładniejszej identyfikacji mogą być potrzebne dodatkowe techniki, takie jak:

• tandemowa spektrometria mas;
• analiza fragmentacyjna;
• analiza aminokwasowa;
• analiza sekwencji;
• porównanie ze standardem referencyjnym.

Wymagana metoda analityczna zależy od oczekiwanego poziomu pewności.

---

Czym jest tandemowa spektrometria mas?

Tandemową spektrometrię mas zwykle zapisuje się jako:

MS/MS

Podczas MS/MS wybrany jon peptydowy ulega dalszej fragmentacji.

Powstałe fragmenty są następnie ponownie mierzone.

Wzorzec fragmentacji może dostarczyć informacji o:

• sekwencja aminokwasów;
• lokalizacja modyfikacji;
• tożsamość peptydu;
• struktura produktów rozpadu.

MS/MS może dzięki temu dostarczyć więcej informacji strukturalnych niż sama masa nienaruszonej cząsteczki.

---

Czym są fragmenty peptydowe?

Gdy łańcuch peptydowy pęka w określonych miejscach podczas MS/MS, powstają jony fragmentacyjne.

Najczęściej spotykane typy fragmentów to:

• jony b;
• jony y.

Masy tych fragmentów można wykorzystać do odtworzenia części sekwencji aminokwasowej.

Interpretacja może być złożona.

Nie każdy peptyd ulega fragmentacji w taki sam sposób.

Czynniki, które mogą mieć wpływ, to:

• skład aminokwasowy;
• ładunek elektryczny;
• wielkość peptydu;
• metoda fragmentacji;
• modyfikacje chemiczne.

---

Czy spektrometria mas może wykrywać utlenianie?

Niektóre zmiany oksydacyjne powodują mierzalną zmianę masy.

Na przykład dodanie jednego atomu tlenu często prowadzi do zwiększenia masy o około 16 Da.

Dzięki temu spektrometria mas może pomóc w identyfikacji niektórych produktów utleniania.

Detekcja zależy od:

• stężenie;
• rozdzielczość aparatury;
• metoda analityczna;
• rozdzielenie składników.

Nie każdą zmianę oksydacyjną można w pełni zlokalizować wyłącznie na podstawie pojedynczego sygnału masowego.

W tym celu może być potrzebna dodatkowa analiza fragmentacyjna.

---

Czy spektrometria mas może określić ilość peptydu?

Nie automatycznie.

Na intensywność sygnału masowego wpływają:

• wydajność jonizacji;
• właściwości cząsteczki;
• rozpuszczalnik;
• ustawienia przyrządu;
• obecność innych składników.

Dlatego sygnał dwukrotnie silniejszy nie oznacza automatycznie, że peptydu jest dwa razy więcej.

Wiarygodne oznaczenie ilościowe wymaga zwalidowanych metod i odpowiednich wzorców.

Możliwe techniki to:

• ilościowa LC-MS;
• wzorce wewnętrzne;
• izotopowo znakowane wzorce;
• skalibrowane testy HPLC.

---

Czy spektrometria mas może potwierdzić jałowość?

Nie.

Spektrometria mas służąca do identyfikacji peptydu nie jest testem jałowości.

Wynik nie dostarcza bezpośrednich informacji o:

• bakterie;
• grzyby;
• wzrost mikrobiologiczny;
• jałowość produktu.

Jałowość wymaga zastosowania specjalnych mikrobiologicznych metod badawczych.

Endotoksyny również nie są automatycznie oznaczane podczas standardowej analizy peptydu metodą MS.

---

Czy spektrometria mas może mierzyć endotoksyny?

Nie za pomocą standardowej analizy tożsamości.

Endotoksyny są złożonymi składnikami bakterii.

Do badania endotoksyn stosuje się specjalne metody, takie jak:

• test lizatowy amebocytów Limulus;
• metody z użyciem rekombinowanego czynnika C.

Dlatego prawidłowe widmo masowe peptydu nie dowodzi, że materiał ma niską zawartość endotoksyn.

Tożsamość, czystość, jałowość i endotoksyny to odrębne parametry jakościowe.

---

Dlaczego wyniki laboratoryjne mogą się różnić?

Różne laboratoria mogą raportować nieznacznie różne wartości masy.

Możliwe przyczyny to:

• typ przyrządu;
• kalibrację;
• metodę jonizacji;
• przygotowanie próbki;
• addukty soli;
• użyte oprogramowanie;
• rozdzielczość;
• metodę interpretacji.

Niewielkie różnice nie oznaczają automatycznie, że wynik jest nieprawidłowy.

Zmierzoną wartość należy oceniać w kontekście:

• dokładność przyrządu;
• oczekiwaną postać cząsteczki;
• używaną metodę analityczną.

---

Czym są addukty?

Podczas spektrometrii mas jony peptydowe mogą łączyć się z innymi naładowanymi cząstkami.

Przykłady:

• sód;
• potas;
• amon.

W rezultacie mogą powstawać dodatkowe piki.

Na przykład addukt sodowy ma inną masę niż prosty protonowany jon peptydowy.

Addukty nie oznaczają automatycznie obecności innego peptydu.

Interpretacja wymaga znajomości:

• przygotowanie próbki;
• użyte bufory;
• oczekiwane formy jonów.

---

Jakie informacje powinny znaleźć się w raporcie MS?

Profesjonalny raport analityczny może zawierać między innymi:

• nazwę peptydu;
• numer partii lub serii;
• teoretyczną masę cząsteczkową;
• zmierzoną masę cząsteczkową;
• metodę jonizacji;
• typ spektrometru mas;
• widmo masowe;
• datę analizy;
• nazwę laboratorium.

W bardziej rozbudowanej analizie można również podać:

• zakres pomiarowy;
• rozdzielczość;
• dokładność masy;
• dane fragmentacji;
• użyte oprogramowanie.

De benodigde rapportage hangt af van het onderzoeksdoel.

---

Zakres wymaganej dokumentacji zależy od celu badania.

Spektrometria mas a kontrola partii

Każda partia produkcyjna może być badana oddzielnie.

• Analiza MS specyficzna dla partii wspiera:
• kontrola tożsamości;
• porównanie między partiami;
• identyfikowalność;

badanie odchyleń.

Numer partii na raporcie z analizy musi odpowiadać oznaczeniu na fiolce.

---

Wynik spektrometrii mas bez wyraźnego powiązania z partią ma ograniczoną wartość w zakresie identyfikowalności.

Ograniczenia naukowe

Spektrometria mas jest zaawansowaną techniką analityczną, ale nie stanowi pełnej oceny jakości.

• Zgodna masa cząsteczkowa nie dowodzi automatycznie:
• pełna sekwencja aminokwasowa;
• wysoka czystość chromatograficzna;
• czystość chromatograficzna;
• właściwa ilość peptydu;
• niska zawartość endotoksyn;
• aktywność biologiczna;

długoterminowa stabilność.

• Do szerszej oceny może być potrzebnych kilka metod:
• MALDI-TOF;
• HPLC;
• MS/MS;
• oznaczenie ilościowe;
• badanie stabilności;
• analiza wilgotności;

dodatkowe testy specyficzne dla produktu.

---

Wyniki należy interpretować łącznie.

Podsumowanie

Spektrometria mas służy do badania masy cząsteczkowej peptydów badawczych.

Technika mierzy stosunek masy do ładunku zjonizowanych cząsteczek.

W analizie peptydów zmierzoną masę można porównać z teoretycznie oczekiwaną masą.

Zgodność potwierdza identyfikację molekularną.

• Ważne techniki analityczne to:
• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;

MS/MS.

• Spektrometria mas nie dostarcza jednak automatycznie informacji o:
• dokładna ilość;
• czystość chromatograficzna;
• endotoksyny;
• aktywność biologiczna.

Dlatego MS często łączy się z HPLC i dodatkowymi analizami jakościowymi.

---

Zastrzeżenie dotyczące badań

Peptydy badawcze firmy Peptidera są oferowane wyłącznie do Research Use Only (RUO) i przeznaczone do badań laboratoryjnych oraz zastosowań analitycznych.

Nieprzeznaczone do spożycia przez ludzi ani zwierzęta, do celów diagnostycznych, zastosowań terapeutycznych ani samodzielnego podawania.

---

Kategoria:
Wiedza o peptydach i kontrola jakości

Powiązane produkty Peptidera:
Liofilizowane peptydy badawcze z identyfikacją partii i dostępnymi danymi analitycznymi dotyczącymi jakości

Powiązane blogi wewnętrzne:

• PB-0227 — Peptydy liofilizowane i liofilizacja
• PB-0228 — Fiolki z peptydami i integralność opakowania
• PB-0229 — Numery partii i identyfikowalność
• PB-0230 — Czystość peptydów i HPLC
• Czym jest Certificate of Analysis?

Propozycje linków wewnętrznych:

• Link do PB-0230 dotyczącego różnicy między HPLC a MS
• Link do PB-0229 dotyczącego analizy specyficznej dla partii
• Link do strony COA z wynikami badań metodą spektrometrii mas
• Link do kolekcji peptydów badawczych
• Link do strony dotyczącej niezależnej analizy laboratoryjnej