Wyjaśnienie standardów odniesienia peptydów
Peptide-referentiestandaarden: waarom analytische vergelijking belangrijk is
Bij de kwaliteitsanalyse van onderzoekspeptiden worden vaak technieken gebruikt zoals:
- HPLC;
- LC-MS;
- oznaczenie peptydu;
- analiza aminokwasowa;
- UV-spectrofotometrie.
Deze instrumenten produceren meetgegevens, maar een detectorsignaal of chromatografische piek heeft niet automatisch een exacte betekenis.
Om een onbekend monster betrouwbaar te identificeren of kwantificeren, kan het worden vergeleken met een materiaal waarvan relevante eigenschappen al zorgvuldig zijn vastgesteld.
Zo’n materiaal wordt een referentiestandaard genoemd.
Een goed gekarakteriseerde peptide-referentiestandaard kan worden gebruikt voor:
- identyfikacja;
- porównanie czasów retencji;
- kwantyfikacja;
- kalibracja;
- beoordeling van HPLC-methoden;
- onderzoek naar onzuiverheden;
- analyse van degradatieproducten;
- ondersteuning van meettraceerbaarheid.
De kwaliteit van een analytisch resultaat hangt daardoor niet alleen af van het laboratoriuminstrument. Ook de identiteit, zuiverheid, het peptidegehalte, de opslag en de documentatie van de gebruikte referentiestandaard zijn belangrijk.
Een referentiestandaard is bovendien niet automatisch hetzelfde als een willekeurig monster met een hoog HPLC-percentage. Voor kwantitatief gebruik moet duidelijk zijn hoeveel werkelijke peptide aanwezig is en welke niet-peptidecomponenten bijdragen aan de totale massa.
In deze blog bespreken we wat peptide-referentiestandaarden zijn, hoe primaire en secundaire standaarden verschillen en waarom analytische vergelijking belangrijk is voor betrouwbare peptideanalyse.
Wat is een peptide-referentiestandaard?
Een peptide-referentiestandaard is een zorgvuldig gekarakteriseerd materiaal dat als vergelijkingsbasis wordt gebruikt tijdens laboratoriumanalyse.
Afhankelijk van het onderzoeksdoel kunnen eigenschappen zijn vastgesteld zoals:
- aminozuursequentie;
- moleculaire massa;
- tożsamość;
- czystość HPLC;
- zawartość peptydu;
- zawartość wody;
- zawartość przeciwjonów;
- aanwezigheid van relevante onzuiverheden;
- opslagstabiliteit.
De standaard kan vervolgens worden gebruikt om een onbekend monster analytisch te vergelijken.
De benodigde karakterisering hangt af van de toepassing.
Een standaard voor identificatie hoeft niet altijd aan exact dezelfde eisen te voldoen als een standaard voor kwantitatieve assay.
Waarom is analytische vergelijking nodig?
Een laboratoriuminstrument meet een fysisch of chemisch signaal.
Przykłady obejmują:
- UV-absorptie;
- fluorescentie;
- chromatografische piekoppervlakte;
- massa-ladingverhouding;
- ionintensiteit.
Een signaal is niet automatisch gelijk aan een exacte hoeveelheid peptide.
Daarvoor is een betrouwbare relatie nodig tussen:
- bekende hoeveelheid;
- gemeten signaal;
- onbekend monster.
Een referentiestandaard kan helpen deze relatie vast te stellen.
Een eenvoudig voorbeeld
Stel dat een laboratorium de hoeveelheid van een peptide met kwantitatieve HPLC wil bepalen.
Het laboratorium bereidt verschillende oplossingen van een gekarakteriseerde referentiestandaard:
- 0,1 mg/ml;
- 0,25 mg/ml;
- 0,5 mg/ml;
- 0,75 mg/ml;
- 1,0 mg/ml.
Elke oplossing wordt geanalyseerd.
Zmierzony pola powierzchni pików nanosi się względem znanych stężeń.
Na tej podstawie powstaje krzywa kalibracyjna.
Następnie mierzy się nieznaną próbkę.
Stężenie można obliczyć, porównując sygnał próbki z krzywą kalibracyjną.
Wiarygodność tego obliczenia zależy między innymi od:
- jakość wzorca referencyjnego;
- prawidłowe obliczenie stężenia;
- dokładne ważenie;
- dokładne pipetowanie;
- liniowość metody;
- stabilność roztworów.
Czym jest pierwotny wzorzec referencyjny?
Pierwotny wzorzec referencyjny to materiał, którego istotne właściwości zostały szczegółowo określone.
Wzorzec można scharakteryzować za pomocą wielu niezależnych technik analitycznych.
Możliwe analizy obejmują:
- HPLC;
- LC-MS;
- analiza aminokwasowa;
- oznaczanie zawartości wody;
- analiza jonów przeciwstawnych;
- NMR;
- analiza pierwiastkowa;
- bilans masy.
Celem jest określenie z wysoką wiarygodnością:
- jaki materiał jest obecny;
- jak czysta jest substancja;
- ile pożądanego składnika jest obecne;
- jakie współczynniki korekcyjne są potrzebne.
Wzorzec pierwotny można następnie wykorzystać do kwalifikacji innych wzorców.
Czym jest wtórny wzorzec referencyjny?
Wzorzec referencyjny wtórny nazywa się również:
- wzorzec roboczy;
- wzorzec roboczy;
- wewnętrzny wzorzec referencyjny.
Wzorzec ten kwalifikuje się przez porównanie ze wzorcem pierwotnym lub oficjalnie uznanym wzorcem referencyjnym.
Wzorzec wtórny może być stosowany do rutynowych analiz laboratoryjnych.
Możliwe korzyści obejmują:
- większa dostępność;
- niższe koszty;
- zachowanie wzorca pierwotnego;
- bardziej efektywne wykorzystanie rutynowe.
Wzorzec wtórny należy jednak okresowo kontrolować i prawidłowo przechowywać.
Dlaczego wzorzec pierwotny nie jest zawsze stosowany?
Wzorce pierwotne mogą:
- być dostępne w ograniczonych ilościach;
- być kosztowne;
- być dostarczane w małych ilościach;
- być przeznaczone do określonych oficjalnych metod analitycznych.
Kwalifikacja wzorca wtórnego względem wzorca pierwotnego umożliwia rutynowe badania bez konieczności ciągłego stosowania wzorca pierwotnego.
Wiarygodność zależy od jakości kwalifikacji.
Co oznacza kwalifikacja wzorca roboczego?
Kwalifikacja oznacza systematyczne badanie właściwości wzorca roboczego i porównywanie ich z odpowiednim wzorcem referencyjnym.
Program kwalifikacji może obejmować:
- kontrola tożsamości;
- czystość HPLC;
- oznaczenie peptydu;
- zawartość wody;
- zawartość przeciwjonów;
- porównanie chromatogramów;
- porównanie widm masowych;
- ocena stabilności.
Wymagane badania zależą od zamierzonego zastosowania.
Tożsamość a oznaczanie ilościowe
Wzorzec referencyjny może pełnić różne funkcje analityczne.
Wzorzec tożsamości
Wzorzec tożsamości służy do sprawdzenia, czy nieznana próbka odpowiada oczekiwanemu peptydowi.
Możliwe porównania obejmują:
- Czas retencji HPLC;
- moleculaire massa;
- massaspectrometrisch profiel;
- spectroscopische eigenschappen.
Kwantitatieve standaard
Een kwantitatieve standaard wordt gebruikt om de hoeveelheid peptide te bepalen.
Daarvoor moet het werkelijke peptidegehalte voldoende betrouwbaar bekend zijn.
Een hoge HPLC-zuiverheid alleen is daarvoor meestal niet voldoende.
Waarom is HPLC-zuiverheid niet voldoende?
Een peptide kan bijvoorbeeld een HPLC-zuiverheid van 99% hebben.
Dat betekent niet automatisch dat 99% van de totale massa uit het peptide bestaat.
Het materiaal kan daarnaast bevatten:
- water;
- acetaat;
- chloride;
- TFA;
- zouten;
- andere niet-chromatografisch gemeten componenten.
Voor een kwantitatieve standaard moet daarom onderscheid worden gemaakt tussen:
- chromatografische zuiverheid;
- totale materiaalmassa;
- netto peptidegehalte.
Wat is de toegewezen waarde?
Een referentiestandaard kan een toegewezen waarde hebben.
Deze waarde beschrijft bijvoorbeeld:
- zawartość peptydu;
- czystość;
- concentratie;
- potentie;
- hoeveelheid per verpakking.
De toegewezen waarde moet gebaseerd zijn op geschikte analytische gegevens.
Ook kan een correctiefactor worden vermeld.
Wat is een correctiefactor?
Een correctiefactor wordt gebruikt om de gewogen hoeveelheid materiaal om te rekenen naar de werkelijke hoeveelheid peptide.
Stel:
- gewogen materiaal: 10,0 mg;
- toegewezen peptidegehalte: 85%;
- werkelijke hoeveelheid peptide: 8,5 mg.
Wanneer deze correctie niet wordt toegepast, kan de berekende concentratie worden overschat.
Waarom is het netto peptidegehalte belangrijk?
Het netto peptidegehalte beschrijft het aandeel van het werkelijke peptide in het onderzochte materiaal.
Bij de berekening kunnen factoren worden meegenomen zoals:
- restvocht;
- tegenionen;
- organische componenten;
- anorganische componenten.
Voor kwantitatieve analyse is dit vaak relevanter dan alleen de HPLC-zuiverheid.
Welke rol speelt aminozuuranalyse?
Aminozuuranalyse kan worden gebruikt om het peptidegehalte te bepalen.
De peptideketen wordt daarbij gehydrolyseerd tot afzonderlijke aminozuren.
Geselecteerde aminozuren worden vervolgens gekwantificeerd.
Wanneer bekend is hoeveel van deze aminozuren in iedere peptideketen aanwezig zijn, kan de hoeveelheid peptide worden berekend.
Aminozuuranalyse kan daardoor bijdragen aan de waardetoekenning van een referentiestandaard.
Welke rol speelt massaspectrometrie?
Massaspectrometrie kan helpen bij het bevestigen van:
- moleculaire massa;
- tożsamość;
- bepaalde modificaties;
- afbraakproducten.
LC-MS kan chromatografische scheiding combineren met massadetectie.
Een overeenkomstige moleculaire massa ondersteunt de identiteit, maar bewijst niet zelfstandig:
- dokładna ilość peptydu;
- volledige sequentie;
- brak wszystkich zanieczyszczeń.
Daarom worden vaak meerdere technieken gecombineerd.
Welke rol speelt MS/MS?
Bij tandem-massaspectrometrie wordt een geselecteerd peptide-ion gefragmenteerd.
De fragmenten kunnen informatie geven over de aminozuursequentie.
MS/MS kan daardoor aanvullende ondersteuning bieden voor:
- bevestiging van de sequentie;
- lokalizacja modyfikacji;
- identyfikacja produktów degradacji.
Zdolność analityczna zależy od:
- wielkość peptydu;
- fragmentacja;
- rozdzielczość aparatury;
- przetwarzanie danych.
Jaką rolę odgrywa HPLC?
HPLC można wykorzystać do:
- porównanie czasów retencji;
- ocena czystości chromatograficznej;
- badanie pików dodatkowych;
- oznaczenie ilościowe;
- badanie stabilności.
Podczas porównania wzorzec i próbkę należy analizować tą samą kontrolowaną metodą.
Najważniejsze parametry to:
- typ kolumny;
- faza ruchoma;
- temperatura;
- prędkość przepływu;
- długość fali detekcji.
Czym jest krzywa kalibracyjna?
Krzywa kalibracyjna opisuje zależność między znanymi stężeniami a zmierzonymi sygnałami detektora.
Wiarygodną krzywą kalibracyjną należy ocenić pod kątem:
- liniowość;
- zakres pomiarowy;
- odtwarzalność;
- odchylenia;
- przydatność do metody analitycznej.
Nieznane stężenie oblicza się w zwalidowanym zakresie pomiarowym.
Ekstrapolacja poza ten zakres może powodować dodatkową niepewność.
Czym jest liniowość?
Liniowość opisuje, w jakim stopniu mierzony sygnał zmienia się proporcjonalnie do stężenia.
Gdy stężenie się podwaja, w zakresie liniowym oczekuje się odpowiadającej mu zmiany sygnału.
Zależność nie musi być liniowa dla każdej metody w całym zakresie stężeń.
Dlatego odpowiedni zakres pomiarowy bada się eksperymentalnie.
Co oznacza identyfikowalność analityczna?
Identyfikowalność analityczna lub metrologiczna opisuje, w jaki sposób wynik pomiaru jest powiązany z uznanym wzorcem za pośrednictwem udokumentowanego łańcucha porównań.
Najważniejsze elementy to:
- użyty wzorzec;
- certyfikat;
- przypisana wartość;
- kalibracja;
- metoda analityczna;
- niepewność pomiaru;
- dokumentacja.
Identyfikowalność wspiera porównywalność wyników między:
- różne dni pomiarowe;
- laboratoria;
- aparatura;
- serie.
Czym jest identyfikowalność metrologiczna?
Metrologia jest nauką o pomiarach.
Identyfikowalność metrologiczna wymaga udokumentowanego i nieprzerwanego łańcucha porównań do określonego wzorca. Każdy etap przyczynia się do całkowitej niepewności pomiaru.
W przypadku analizy peptydów praktyczna identyfikowalność metrologiczna może między innymi zależeć od:
- standard referencyjny;
- przypisana zawartość peptydu;
- skalibrowana waga;
- wyposażenie objętościowe;
- metoda analityczna.
Czym jest niepewność pomiaru?
Każdy pomiar analityczny wiąże się z niepewnością.
Możliwe źródła to:
- niepewność wzorca referencyjnego;
- ważenie;
- pipetowanie;
- rozcieńczanie;
- zmienność aparatury;
- kalibracja;
- integracja pików;
- przygotowanie próbki.
Niepewność pomiaru nie oznacza, że wynik jest niewiarygodny.
Opisuje szacowany przedział, w którym rzeczywista wartość może się racjonalnie mieścić.
Dlaczego wzorce muszą być specyficzne dla danej serii?
Wzorce referencyjne również są produkowane w seriach.
Różne serie mogą różnić się pod względem:
- zawartość peptydu;
- zawartość wody;
- zawartość przeciwjonów;
- profil czystości;
- stabilność.
Dlatego należy jasno określić, którego numeru serii wzorca referencyjnego użyto.
Co znajduje się na certyfikacie wzorca referencyjnego?
Certyfikat może zawierać informacje o:
- nazwa;
- numer katalogowy;
- numer serii;
- przypisana wartość;
- zamierzone zastosowanie;
- warunki przechowywania;
- informacje dotyczące ważności;
- metody analityczne;
- współczynnik korekcyjny.
Nie każdy certyfikat zawiera te same dane.
Wzorca należy używać zgodnie z dołączonymi instrukcjami.
Dlaczego warunki przechowywania są ważne?
Wzorzec referencyjny może zmieniać się podczas przechowywania.
Możliwe procesy obejmują:
- utleniania;
- deamidacji;
- absorpcji wilgoci;
- agregacji;
- degradacji.
Dlatego można określić warunki dotyczące:
- temperatura;
- ochrona przed światłem;
- ochrona przed wilgocią;
- użycie po otwarciu;
- okres przechowywania.
Wzorzec przechowywany w niewłaściwy sposób może prowadzić do nieprawidłowych porównań.
Czym jest data ważności?
Niektóre wzorce referencyjne mają ustaloną datę ważności.
Inne wzorce mają:
- kontrola ważności;
- data rekwalifikacji;
- aktualny status serii.
Laboratorium musi sprawdzić, czy wzorzec jest odpowiedni i ważny w momencie użycia.
Czym jest rekwalifikacja?
Rekwalifikacja to ponowna ocena wzorca referencyjnego.
Możliwe analizy obejmują:
- HPLC;
- LC-MS;
- oznaczenie peptydu;
- zawartość wody;
- porównaniu ze wzorcem pierwotnym.
Rekwalifikacja może być konieczna po:
- wcześniej określony okres użytkowania;
- długotrwałe przechowywanie;
- zmiana wyglądu;
- odchylony wynik analizy.
Dlaczego wzorce zanieczyszczeń są ważne?
Jako wzorzec można stosować nie tylko pożądany peptyd.
Jako materiał referencyjny mogą służyć również znane zanieczyszczenia lub produkty degradacji.
Przykłady obejmują:
- produkty utleniania;
- warianty zdeamidowane;
- fragmenty;
- sekwencje delecyjne;
- składniki związane z agregacją.
Wzorce te mogą pomóc w identyfikacji i oznaczaniu ilościowym pików dodatkowych.
Czym są wzorce degradacji?
Wzorzec degradacji reprezentuje znany wariant degradacji.
Można go wykorzystać do zbadania:
- gdzie eluowany jest produkt degradacji;
- jaka masa cząsteczkowa jest obecna;
- czułość metody analitycznej;
- ilość obecnego produktu degradacji.
Nie każdy produkt degradacji jest dostępny jako czysty wzorzec.
Wzorce referencyjne i walidacja metody
Należy wykazać, że metoda analityczna jest odpowiednia do zamierzonego zastosowania.
Wytyczna ICH Q2(R2) opisuje zasady walidacji procedur analitycznych. Odpowiednie właściwości mogą obejmować między innymi specyficzność, dokładność, precyzję, liniowość i zakres pomiarowy.
Wzorce referencyjne można wykorzystać do badania:
- dokładność;
- specyficzność;
- liniowość;
- zakres ilościowy;
- parametry metody.
Czym jest dokładność?
Dokładność opisuje, jak blisko zmierzony wynik znajduje się względem zaakceptowanej wartości referencyjnej.
Dobrze scharakteryzowany wzorzec można wykorzystać do zbadania dokładności metody analitycznej.
Czym jest precyzja?
Precyzja opisuje, jak blisko siebie znajdują się powtarzane wyniki pomiarów.
Metoda może dawać bardzo precyzyjne wyniki, które mimo to systematycznie odbiegają od wartości rzeczywistej.
Dlatego zarówno precyzja, jak i dokładność mają znaczenie.
Czym jest swoistość?
Swoistość opisuje, czy metoda analityczna pozwala wystarczająco odróżnić pożądany składnik od innych składników.
Przykłady obejmują:
- zanieczyszczenia;
- produkty degradacji;
- składniki formulacji;
- przeciwjony.
Odpowiedni standard referencyjny może pomóc w identyfikacji głównego piku.
Czy dwa laboratoria mogą uzyskać różne wyniki?
Tak.
Różnice mogą wynikać z:
- standard referencyjny;
- metoda analityczna;
- przygotowanie próbki;
- aparatura;
- kalibracja;
- przetwarzanie danych;
- niepewność pomiaru.
Stosowanie dobrze scharakteryzowanych standardów i zwalidowanych metod może poprawić porównywalność.
Czy komercyjny peptyd jest automatycznie standardem referencyjnym?
Nie.
Komercyjny peptyd może być odpowiedni jako materiał badawczy, ale nie jest automatycznie kwalifikowanym standardem referencyjnym.
Przed użyciem jako standardu należy jasno określić:
- tożsamość;
- zawartość peptydu;
- czystość;
- zawartość wody;
- zawartość przeciwjonów;
- stabilność podczas przechowywania;
- dokumentacja.
Wymagania zależą od celu analitycznego.
Oficjalne farmakopealne standardy referencyjne
Oficjalne organizacje udostępniają standardy referencyjne do określonych zastosowań kompendialnych.
Przykłady obejmują:
- Standardy referencyjne USP;
- Standardy referencyjne Farmakopei Europejskiej;
- Międzynarodowe chemiczne substancje referencyjne WHO.
Standardy te są przeznaczone do zastosowań opisanych w odpowiednich oficjalnych metodach lub dokumentacji.
Nie dla każdego peptydu badawczego istnieje oficjalny standard farmakopealny.
Ograniczenia naukowe
Standard referencyjny poprawia porównywalność analityczną, ale nie rozwiązuje wszystkich problemów pomiarowych.
Wiarygodność nadal zależy od:
- metoda analityczna;
- przygotowanie próbki;
- aparatura;
- kalibracja;
- przechowywanie;
- przetwarzanie danych;
- niepewność pomiaru.
Odpowiadający czas retencji HPLC nie potwierdza samodzielnie pełnej tożsamości molekularnej.
Odpowiadająca masa cząsteczkowa nie dowodzi automatycznie:
- prawidłowa pełna sekwencja;
- dokładna ilość peptydu;
- brak wszystkich zanieczyszczeń.
Dlatego stosuje się wiele uzupełniających się technik analitycznych.
Podsumowanie
Referencyjny standard peptydowy to dobrze scharakteryzowany materiał stosowany jako analityczna podstawa porównawcza.
Standardy referencyjne mogą być stosowane do:
- identyfikacja;
- porównanie HPLC;
- kalibracja;
- oznaczenie peptydu;
- kwantyfikacja;
- walidacja metody;
- analiza zanieczyszczeń.
Standard pierwotny jest szczegółowo charakteryzowany.
Wtórny standard lub standard roboczy jest kwalifikowany względem odpowiedniego standardu pierwotnego i może być stosowany do rutynowych analiz.
Voor kwantitatieve toepassingen is HPLC-zuiverheid alleen meestal onvoldoende. Ook peptidegehalte, water, tegenionen en andere relevante componenten moeten worden beoordeeld.
Wiarygodne porównanie analityczne wymaga:
- odpowiedni standard odniesienia;
- prawidłowe przypisanie wartości;
- identyfikowalność partii;
- kontrolowane przechowywanie;
- zwalidowana metoda analityczna;
- ocena niepewności pomiaru.
Oficjalne źródła i odniesienia naukowe
-
ICH Q2(R2) — walidacja procedur analitycznych
Międzynarodowa wytyczna dotycząca walidacji procedur analitycznych, obejmująca między innymi swoistość, dokładność, precyzję, liniowość i zakres pomiarowy. -
USP — oficjalne standardy odniesienia
USP opisuje standardy odniesienia jako kompleksowo scharakteryzowane materiały przeznaczone między innymi do badań tożsamości, mocy, czystości i jakości. -
Standardy odniesienia Farmakopei Europejskiej — EDQM
Katalog EDQM zawiera oficjalnie obowiązujące standardy odniesienia dla zastosowań opisanych w Farmakopei Europejskiej. -
WHO — międzynarodowe chemiczne substancje odniesienia
WHO-ICRS są ustanawiane zgodnie z procedurami odpowiadającymi wytycznym WHO dotyczącym chemicznych substancji odniesienia. -
NIST — spójność metrologiczna
NIST definiuje spójność metrologiczną jako udokumentowany, nieprzerwany łańcuch wzorcowań prowadzący do określonych odniesień. -
NIST — standardowe materiały odniesienia
NIST opracowuje i certyfikuje materiały odniesienia o dobrze scharakteryzowanym składzie lub właściwościach, aby wspierać wiarygodne i porównywalne pomiary. -
FDA — procedury i walidacja metod analitycznych dla leków i produktów biologicznych
Wytyczne FDA dotyczą stosowania i kwalifikacji wzorców odniesienia w ramach walidacji metod analitycznych.
Zastrzeżenie dotyczące zastosowań badawczych
Peptydy badawcze Peptidera są oferowane wyłącznie do Research Use Only (RUO) i są przeznaczone do badań laboratoryjnych oraz zastosowań analitycznych.
Nieprzeznaczone do spożycia przez ludzi ani zwierzęta, do zastosowań diagnostycznych, terapeutycznych ani do samodzielnego podawania.
Kategoria:
Wiedza o peptydach i kontrola jakości
Powiązane produkty Peptidera:
Peptydy badawcze z identyfikacją partii i dostępnymi niezależnymi danymi dotyczącymi jakości analitycznej
Powiązane blogi wewnętrzne:
- PB-0230 — Czystość peptydu i HPLC
- PB-0231 — Spektrometria mas peptydów
- PB-0233 — Oznaczenie peptydu: czystość a zawartość peptydu
- PB-0238 — Przeciwjony w peptydach
- PB-0239 — Analiza aminokwasów w peptydach
- PB-0241 — Łańcuch nadzoru w analizie peptydów
Propozycje linków wewnętrznych:
- Link do PB-0230 dotyczącego czasu retencji HPLC i porównania chromatograficznego
- Link do PB-0231 dotyczącego LC-MS, masy cząsteczkowej i MS/MS
- Link do PB-0233 dotyczącego ilościowych oznaczeń peptydów
- Link do PB-0238 dotyczącego przeciwjonów i netto zawartości peptydu
- Link do PB-0239 dotyczącego analizy aminokwasów i przypisywania wartości
- Link do PB-0241 dotyczącego identyfikowalności standardów i próbek
- Link do strony Peptidera z niezależnymi certyfikatami analiz
- Link do kolekcji peptydów badawczych