Jonizacja peptydów: octan, chlorek i TFA
W przypadku syntetycznych peptydów badawczych często mówi się o czystości, masie cząsteczkowej i zawartości peptydu. Mniej widoczne, ale ważne z analitycznego punktu widzenia, są przeciwjony.
Podczas syntezy i oczyszczania peptydy mogą występować w postaci soli. W takim przypadku dodatnio lub ujemnie naładowane grupy peptydu są związane z jonem o przeciwnym ładunku. Jony te nazywa się przeciwjonami.
Typowe przeciwjony występujące w peptydach to:
- octany;
- chlorki;
- trifluorooctan, w skrócie TFA.
Przeciwjony mogą wpływać na:
- masa całkowita;
- zawartość netto peptydu;
- rozpuszczalność;
- pH roztworów;
- interpretacja analityczna;
- porównanie partii.
Czystość HPLC wynosząca 99% zwykle nie mówi bezpośrednio nic o ilości przeciwjonów. Dlatego przeciwjony należy rozumieć osobno i, jeśli ma to znaczenie, analizować oddzielnie.
Czym jest przeciwjon?
Przeciwjon to jon, który kompensuje ładunek elektryczny cząsteczki.
Peptydy często zawierają naładowane grupy, na przykład:
- grupy aminowe;
- grupy karboksylowe;
- łańcuchy boczne naładowanych aminokwasów.
Gdy peptyd ma ładunek netto dodatni, może być obecny ujemny przeciwjon.
Gdy peptyd ma ładunek netto ujemny, może być obecny dodatni przeciwjon.
W przypadku wielu soli peptydowych chodzi głównie o ujemne przeciwjony związane z dodatnio naładowanymi grupami.
Dlaczego peptydy mają przeciwjony?
Przeciwjony często powstają w wyniku zastosowanych metod produkcji i oczyszczania.
Podczas produkcji peptydów mogą być stosowane kwasy, bufory i odczynniki jonowe.
Przykłady:
- kwas trifluorooctowy podczas RP-HPLC;
- kwas octowy dla postaci octanowej;
- kwas solny dla postaci chlorkowej.
Po oczyszczaniu i liofilizacji jony te mogą częściowo pozostać w materiale końcowym.
Nie oznacza to automatycznie, że produkt jest złej jakości. Oznacza to, że peptyd występuje w określonej postaci soli.
Octan jako przeciwjon
Octan jest jonem kwasu octowego.
Peptydy w postaci octanu są często stosowane, gdy pożądane jest mniejsze obciążenie TFA.
Octan może mieć znaczenie dla:
- postać soli;
- właściwości pH;
- bilans masy analitycznej;
- zawartość peptydu.
Octan przyczynia się do całkowitej suchej masy, ale nie jest częścią łańcucha peptydowego.
Dlatego zawartość netto peptydu może być niższa niż całkowita masa fiolki.
Chlorek jako przeciwjon
Chlorek jest ujemnym jonem kwasu solnego.
Niektóre peptydy są dostarczane w postaci chlorowodorku.
Chlorek może wpływać na:
- siła jonowa;
- właściwości rozpuszczania;
- pH;
- masa całkowita.
Chlorek również wlicza się do całkowitej masy, ale nie do masy netto łańcucha peptydowego.
TFA jako przeciwjon
TFA oznacza trifluorooctan.
TFA jest powszechnie stosowany w chemii peptydów i RP-HPLC, ponieważ może zapewniać dobre właściwości chromatograficzne.
Może to pomóc w:
- kształt piku;
- rozdzielanie;
- parowanie jonów;
- oczyszczanie.
TFA może jednak pozostać w materiale końcowym jako jon przeciwny.
Dlatego w niektórych zastosowaniach wybiera się wymianę jonową na octan lub chlorek.
Dlaczego TFA jest ważne analitycznie?
TFA może mieć stosunkowo duży udział w całkowitej masie.
Gdy peptyd ma wiele dodatnio naładowanych miejsc, może zawierać wiele jonów TFA.
Może to wpływać na:
- zawartość netto peptydu;
- bilans masy;
- obliczeniach stężenia;
- interpretacji zawartości fiolki.
Peptyd może więc mieć bardzo wysoką czystość HPLC, a mimo to zawierać znaczny udział jonu przeciwnego.
Jony przeciwne a czystość HPLC
Czystość HPLC zwykle opisuje względną powierzchnię głównego piku chromatograficznego.
Jony przeciwne nie zawsze są widoczne w ten sam sposób w standardowej metodzie HPLC dla peptydów.
Dlatego:
99% czystości HPLC
nie oznacza automatycznie:
99% zawartości netto peptydu
Jony przeciwne należy uwzględniać osobno w ocenie ilościowej.
Jony przeciwne a oznaczenie zawartości peptydu
W oznaczaniu zawartości peptydu określa się rzeczywistą ilość peptydu.
Jony przeciwne mogą mieć przy tym znaczenie, ponieważ przyczyniają się do całkowitej masy.
Prawidłowe oznaczenie zawartości może rozróżnić:
- masa brutto materiału liofilizowanego;
- ilość netto peptydu;
- zawartość wody;
- zawartość jonów przeciwnych;
- pozostałe składniki.
Dlatego oznaczenie zawartości, analiza wilgotności i analiza jonów przeciwnych uzupełniają się.
Jak analizuje się jony przeciwne?
Możliwe metody obejmują:
- chromatografia jonowa;
- elektroforeza kapilarna;
- NMR;
- analiza pierwiastkowa;
- podejście oparte na bilansie masy;
- specyficzne oznaczanie TFA.
Wybrana metoda zależy od jonu przeciwnego i wymaganej dokładności.
Czym jest chromatografia jonowa?
Chromatografia jonowa jest techniką analityczną służącą do rozdzielania i oznaczania jonów.
Metodę tę można stosować między innymi do:
- chlorki;
- octany;
- trifluorooctan;
- inne małe jony.
Wynik może pomóc w obliczeniu postaci solnej i zawartości netto peptydu.
Jony przeciwne a rozpuszczalność
Postać solna peptydu może wpływać na jego rozpuszczalność.
Peptyd w postaci octanowej może zachowywać się inaczej niż ten sam peptyd w postaci TFA lub chlorkowej.
Na rozpuszczalność wpływają również:
- sekwencja aminokwasów;
- pH;
- stężenie;
- temperatura;
- rozpuszczalnik;
- siła jonowa.
Dlatego rozpuszczalność należy zawsze oceniać dla konkretnego produktu.
Jony przeciwne a pH
Po rozpuszczeniu peptydu jony przeciwne mogą wpływać na pH roztworu.
Octany, chlorki i TFA mają różne właściwości chemiczne.
Wartość pH może mieć znaczenie dla:
- stabilność;
- deamidacja;
- agregacja;
- rozpuszczalność;
- metody analityczne.
Przeciwjony i różnice między partiami
Zawartość przeciwjonów może różnić się między partiami.
Możliwe przyczyny to:
- metoda oczyszczania;
- zastosowana faza ruchoma;
- wymiana jonowa;
- etapy płukania;
- proces liofilizacji.
Dlatego analiza konkretnej partii jest ważna, gdy przeciwjony mają znaczenie dla celu badania.
Czy przeciwjon jest podany w certyfikacie analizy?
Czasami tak, ale nie zawsze.
Certyfikat analizy może zawierać:
- forma peptydu;
- octany;
- chlorki;
- TFA;
- procentowa zawartość przeciwjonów;
- oznaczenie;
- zawartość netto peptydu.
Jeśli certyfikat analizy zawiera tylko wyniki HPLC i MS, zawartość przeciwjonów zwykle nie została w pełni oceniona.
Dlaczego jest to ważne w obliczeniach?
Podczas obliczania ilości peptydu naukowcy powinni uwzględnić różnicę między masą brutto a netto.
Na przykład:
- 10 mg całkowitej masy materiału liofilizowanego;
- 85% zawartości netto peptydu;
- rzeczywista ilość peptydu: 8,5 mg.
Bez korekty ilość peptydu może zostać zawyżona.
Ograniczenia naukowe
Analiza przeciwjonów zależy od zastosowanej metody.
Nie każdy raport w pełni określa formę soli.
Mogą również występować liczne składniki jonowe.
Dlatego wnioski należy opierać na rzeczywistych analizach, a nie tylko na nazwie produktu lub wartości procentowej HPLC.
Podsumowanie
Przeciwjony to jony, które kompensują ładunek elektryczny peptydów.
Typowe przykłady to:
- octany;
- chlorki;
- TFA.
Mogą wpływać na:
- masa całkowita;
- zawartość netto peptydu;
- rozpuszczalność;
- pH;
- stabilność;
- interpretacja analityczna.
Wysoka czystość HPLC nie oznacza automatycznie wysokiej zawartości netto peptydu.
Do pełnej oceny jakości aniony przeciwjonowe należy analizować łącznie z wynikami HPLC, spektrometrii mas, oznaczenia, wilgotności resztkowej i danymi partii.
Zastrzeżenie dotyczące badań
Peptydy badawcze firmy Peptidera są oferowane wyłącznie do użytku badawczego (RUO) i są przeznaczone do badań laboratoryjnych oraz zastosowań analitycznych.
Nieprzeznaczone do spożycia przez ludzi ani zwierzęta, do użytku diagnostycznego, zastosowań terapeutycznych ani samodzielnego podawania.
Kategoria:
Wiedza o peptydach i kontrola jakości
Powiązane blogi wewnętrzne:
- PB-0233 — Oznaczenie peptydu
- PB-0234 — Wilgotność resztkowa
- PB-0230 — Czystość peptydu i HPLC
- PB-0232 — Certyfikat analizy
- PB-0237 — Deamidacja peptydów
Nazwa pliku obrazu:PB-0238-tegenionen-peptiden-acetaat-chloride-tfa.jpg
Tekst alternatywny:
Naukowa wizualizacja form soli peptydów z anionami octanowymi, chlorkowymi i TFA w nowoczesnym laboratorium analitycznym.