Análise de aminoácidos em peptídeos explicada
Análise de aminoácidos em péptidos: composição e quantificação explicadas
Os péptidos são constituídos por cadeias de aminoácidos. A sequência destes aminoácidos determina grande parte das propriedades químicas e estruturais de um péptido.
Na análise da qualidade, são frequentemente utilizadas técnicas como a HPLC e a espectrometria de massa para avaliar a pureza e a massa molecular. Um método de análise complementar é a análise de aminoácidos, frequentemente abreviada como AAA.
A análise de aminoácidos pode ser utilizada para investigar:
- quais os aminoácidos presentes numa amostra;
- como as proporções de aminoácidos medidas correspondem à composição esperada;
- quanto péptido está presente;
- ou se a composição de aminoácidos corresponde ao péptido teórico;
- como pode ser calculado o teor líquido de péptido.
O método funciona de forma diferente da HPLC e da espectrometria de massa. Na análise clássica de aminoácidos, a cadeia peptídica é primeiro decomposta em aminoácidos individuais. Em seguida, estes aminoácidos são separados, detetados e quantificados.
A análise de aminoácidos pode fornecer informações valiosas, mas também apresenta limitações. Durante a decomposição, alguns aminoácidos podem sofrer alterações parciais ou perder-se. Por isso, os resultados devem ser sempre interpretados no contexto do método utilizado.
O que é a análise de aminoácidos?
A análise de aminoácidos é uma técnica laboratorial utilizada para estudar a composição de aminoácidos de uma amostra.
Numa análise clássica, são geralmente realizados os seguintes passos:
- preparação da amostra;
- hidrólise da cadeia peptídica;
- libertação de aminoácidos individuais;
- separação dos aminoácidos;
- deteção e quantificação;
- comparação com a composição esperada.
O resultado pode ser apresentado como:
- quantidade por aminoácido;
- razão molar;
- concentração mássica;
- perfil de aminoácidos;
- teor de péptido calculado.
O que é a hidrólise?
A hidrólise é um processo químico no qual as ligações são quebradas com a ajuda de água.
Na análise de aminoácidos, as ligações peptídicas são quebradas, libertando aminoácidos individuais.
Um método frequentemente utilizado é a hidrólise ácida.
Para tal, a amostra é exposta durante um período controlado a:
- ácido forte;
- temperatura elevada;
- condições controladas.
Após a hidrólise, a cadeia peptídica original já não existe como molécula intacta.
Os aminoácidos libertados podem então ser analisados individualmente.
Por que razão é decomposta a cadeia peptídica?
Um péptido intacto pode conter dezenas de resíduos de aminoácidos diferentes.
Ao quebrar a cadeia, pode medir-se a quantidade total de cada aminoácido.
Suponha-se que um péptido teórico contém:
- quatro resíduos de alanina;
- dois resíduos de glicina;
- três resíduos de leucina;
- um resíduo de tirosina.
Após a hidrólise, pode verificar-se se as proporções medidas correspondem aproximadamente a esta composição teórica.
Isto apoia a avaliação da composição de aminoácidos.
Qual é a diferença entre a composição de aminoácidos e a sequência de aminoácidos?
A análise de aminoácidos mede sobretudo quais os aminoácidos presentes e em que quantidade.
O método não determina automaticamente a sequência exata.
Dois péptidos diferentes podem ter a mesma composição de aminoácidos, mas uma sequência diferente.
Por exemplo:
- Ala-Gly-Leu;
- Leu-Gly-Ala.
Ambos contêm:
- uma alanina;
- uma glicina;
- uma leucina.
Ainda assim, a sequência é diferente.
Para a análise da sequência, são necessárias outras técnicas, tais como:
- espectrometria de massa tandem;
- análise de fragmentos;
- métodos de sequenciação específicos.
A análise de aminoácidos pode confirmar a identidade?
A análise de aminoácidos pode apoiar a composição esperada.
Quando o perfil de aminoácidos medido se desvia significativamente da composição teórica, isso pode justificar uma investigação adicional.
No entanto, um perfil correspondente não prova, por si só, que a sequência exata de aminoácidos está correta.
Para uma avaliação mais abrangente da identidade, podem ser combinados:
- massa molecular;
- LC-MS;
- MS/MS;
- análise de aminoácidos;
- dados cromatográficos.
Como são separados os aminoácidos?
Após a hidrólise, a amostra contém uma mistura de aminoácidos livres.
Estes devem ser separados analiticamente uns dos outros.
As técnicas possíveis incluem:
- cromatografia de permuta iónica;
- HPLC;
- UPLC;
- eletroforese capilar.
A técnica escolhida depende de:
- sensibilidade pretendida;
- método laboratorial;
- tipo de amostra;
- precisão necessária.
O que é a derivatização?
Muitos aminoácidos têm uma detetabilidade limitada sem tratamento adicional.
Por isso, podem ser quimicamente ligados a um grupo detetável.
A isto chama-se derivatização.
A derivatização pode ocorrer:
- antes da separação cromatográfica;
- após a separação cromatográfica.
Os derivados formados podem ser medidos de forma mais eficaz, por exemplo, através de:
- deteção por UV;
- deteção por fluorescência;
- espectrometria de massa.
Derivatização pré-coluna
Na derivatização pré-coluna, os aminoácidos são marcados antes da separação cromatográfica.
Em seguida, os derivados formados são separados através de uma coluna.
As possíveis vantagens incluem:
- elevada sensibilidade;
- deteção por fluorescência adequada;
- análise de vários aminoácidos.
A reação deve ocorrer de forma reprodutível.
A derivatização incompleta pode afetar a quantificação.
Derivatização pós-coluna
Na derivatização pós-coluna, os aminoácidos são primeiro separados.
Após a coluna, reagem com um reagente de deteção.
Um exemplo conhecido é a análise com ninhidrina.
Os produtos de reação formados podem depois ser medidos opticamente.
Como é determinada a quantidade de aminoácido?
Para a quantificação, são utilizados padrões de referência.
As soluções-padrão contêm quantidades conhecidas de aminoácidos.
Estes são medidos para estabelecer uma relação entre:
- concentração;
- sinal do detetor.
Em seguida, mede-se a amostra desconhecida.
Com base nos dados de calibração, pode ser calculada a quantidade de cada aminoácido.
O que é um padrão interno?
Um padrão interno é uma substância conhecida que é adicionada às amostras e às soluções de calibração.
Esta pode ajudar a corrigir a variação durante a:
- preparação da amostra;
- injeção;
- derivatização;
- análise.
O padrão interno deve ser analiticamente distinguível dos aminoácidos analisados.
Como pode a análise de aminoácidos determinar o teor de péptido?
Quando a composição de aminoácidos de um péptido é conhecida, podem ser utilizados aminoácidos selecionados para calcular a quantidade de péptido.
Suponha-se que cada cadeia peptídica contém exatamente quatro resíduos de alanina.
Quando é medida a quantidade total de alanina, pode estimar-se a partir daí quantas cadeias peptídicas estavam presentes.
O cálculo tem em conta:
- número de resíduos por péptido;
- massa molecular;
- quantidade de aminoácido medida;
- método analítico.
Isto pode ser utilizado para um ensaio quantitativo de péptidos.
Por que motivo nem sempre são utilizados todos os aminoácidos?
Nem todos os aminoácidos são igualmente adequados para a quantificação.
Alguns aminoácidos podem, durante a hidrólise:
- degradação parcial;
- alteração química;
- libertação incompleta;
- ser medidos de forma fiável.
Por isso, são frequentemente selecionados aminoácidos estáveis.
A escolha depende da sequência peptídica e do método analítico.
Que aminoácidos podem sofrer alterações durante a hidrólise?
A hidrólise ácida pode ter vários efeitos.
Triptofano
O triptofano pode ser em grande parte degradado durante a hidrólise ácida padrão.
Por isso, são necessários métodos adaptados quando é necessário medir especificamente o triptofano.
Asparagina
Durante a hidrólise, a asparagina pode ser convertida em aspartato.
Por conseguinte, a asparagina e o aspartato nem sempre são reportados separadamente na análise clássica.
Glutamina
A glutamina pode ser convertida em glutamato.
Desta forma, a glutamina e o glutamato podem ser apresentados em conjunto.
Serine
A serina pode perder-se parcialmente durante uma hidrólise prolongada.
Treonina
A treonina também pode degradar-se parcialmente.
Cisteína
A cisteína pode sofrer alterações oxidativas.
Para uma análise fiável, pode ser necessária uma oxidação prévia ou um método adaptado.
Porque é importante o tempo de hidrólise?
As ligações peptídicas devem ser suficientemente quebradas.
Uma hidrólise demasiado curta pode causar:
- degradação incompleta;
- valores de aminoácidos medidos demasiado baixos.
Uma hidrólise demasiado prolongada pode causar:
- degradação adicional de aminoácidos sensíveis;
- perda de medição.
Por isso, o tempo e a temperatura de hidrólise são controlados.
Por vezes, utilizam-se vários tempos de hidrólise para investigar perdas ou uma degradação incompleta.
O que é uma proporção molar?
Uma proporção molar descreve os números relativos de aminoácidos.
Suponha-se que um péptido contém teoricamente:
- duas alaninas;
- uma glicina;
- três leucinas.
A proporção molar teórica é:
2 : 1 : 3
Após a análise, os valores medidos podem ser normalizados.
Quando a proporção se aproxima do valor teórico, isso sustenta a composição de aminoácidos esperada.
Podem surgir pequenos desvios devido a:
- incerteza de medição;
- perda por hidrólise;
- derivatização;
- integração dos picos cromatográficos.
O que significa normalização?
Na normalização, os valores medidos dos aminoácidos são convertidos em proporções relativas.
Um aminoácido adequado pode ser utilizado como referência.
Deste modo, o perfil medido pode ser comparado com a composição teórica.
A normalização é útil para estudar a composição, mas não fornece automaticamente a quantidade absoluta de péptido.
Análise de aminoácidos versus pureza por HPLC
A pureza por HPLC e a análise de aminoácidos medem propriedades diferentes.
A pureza por HPLC examina geralmente:
- pico cromatográfico principal;
- quantidade relativa de picos secundários.
A análise de aminoácidos examina:
- composição de aminoácidos;
- quantidade de aminoácidos selecionados;
- possível quantificação de péptidos.
Uma elevada pureza por HPLC não prova automaticamente que a composição de aminoácidos está correta.
Uma composição de aminoácidos adequada não prova automaticamente que não estão presentes impurezas relacionadas com péptidos.
As técnicas complementam-se.
Análise de aminoácidos versus espectrometria de massa
A espectrometria de massa examina a relação massa-carga das moléculas.
Uma medição da massa intacta pode ajudar a confirmar que a massa molecular corresponde ao valor teórico.
A análise de aminoácidos examina a quantidade e a proporção de aminoácidos após a hidrólise.
Ambas as técnicas têm diferentes pontos fortes.
Uma combinação pode fornecer mais informações sobre:
- identidade;
- composição;
- teor de péptidos.
Análise de aminoácidos versus ensaio de péptidos
A análise de aminoácidos pode ser utilizada como método de ensaio.
Um ensaio de péptidos descreve o objetivo:
determinar a quantidade de péptido.
A análise de aminoácidos é uma das técnicas que podem ser utilizadas para atingir este objetivo.
Outros métodos de ensaio possíveis são:
- HPLC quantitativo;
- espectrofotometria UV;
- quantificação por LC-MS;
- balanço de massa.
Que influência têm os contraíons?
Contraíons como:
- acetato;
- cloreto;
- TFA;
contribuem para a massa total do material liofilizado.
Na análise de aminoácidos, são analisados sobretudo os componentes de aminoácidos do péptido.
Assim, o método pode ajudar a distinguir entre:
- massa total do material;
- quantidade real de péptidos.
Para um balanço de massa completo, podem ser necessárias análises adicionais.
Que influência tem a humidade residual?
A humidade residual contribui para o peso total, mas não para a composição de aminoácidos.
Ao calcular o teor líquido de péptidos, a análise da humidade pode fornecer informações adicionais.
Um balanço de massa abrangente pode incluir:
- teor de péptidos;
- teor de água;
- teor de contraíons;
- outros componentes.
A análise de aminoácidos pode detetar contaminações?
Alguns sinais anómalos de aminoácidos podem indicar componentes inesperados.
No entanto, o método não foi concebido para detetar todas as possíveis impurezas.
Podem ser necessárias outras técnicas para:
- impurezas orgânicas;
- solventes residuais;
- metais;
- contaminação microbiológica;
- endotoxinas.
O que pode constar num COA?
Um certificado de análise pode conter informações como:
- ensaio: análise de aminoácidos;
- método analítico;
- proporções de aminoácidos medidas;
- proporções teóricas;
- teor de péptidos calculado;
- data do ensaio;
- número do lote.
Nem todos os COA incluem uma análise de aminoácidos.
Quando apenas foram realizados HPLC e MS, não é possível obter uma quantificação completa dos aminoácidos a partir desses dados.
Por que é importante associar a análise ao lote?
Uma análise de aminoácidos deve estar associada ao lote analisado.
Os dados importantes são:
- número do lote;
- nome do produto;
- data da análise;
- laboratório;
- método analítico.
Um relatório de análise sem uma ligação clara ao lote tem menos valor para a rastreabilidade.
O que significa incerteza de medição?
Todas as análises quantitativas incluem incerteza de medição.
Na análise de aminoácidos, podem existir as seguintes fontes de variação:
- preparação da amostra;
- hidrólise;
- perda de aminoácidos;
- derivatização;
- calibração;
- separação cromatográfica;
- integração dos picos.
Por isso, os resultados não devem ser considerados absolutamente isentos de erros.
Por que é importante validar um método?
Um método deve ser adequado à finalidade pretendida.
Na análise quantitativa de aminoácidos, podem ser relevantes as seguintes características de validação:
- exatidão;
- precisão;
- linearidade;
- especificidade;
- intervalo de medição;
- robustez;
- repetibilidade.
Um método adequado para obter um perfil qualitativo de aminoácidos não é automaticamente suficiente para a quantificação exata de péptidos.
Limitações científicas
A análise de aminoácidos tem limitações importantes.
O método não determina, por si só:
- sequência exata de aminoácidos;
- massa molecular;
- pureza por HPLC;
- estrutura tridimensional;
- atividade biológica;
- esterilidade;
- teor de endotoxinas.
Além disso, alguns aminoácidos podem sofrer alterações durante a hidrólise.
Para uma avaliação abrangente da qualidade, é necessário combinar várias técnicas analíticas.
Resumo
A análise de aminoácidos examina a composição e a quantidade de aminoácidos num péptido.
Na análise clássica, a cadeia peptídica é primeiro decomposta por hidrólise.
Em seguida, os aminoácidos são:
- separados;
- detetados;
- quantificados;
- comparada com a composição teórica.
A análise de aminoácidos pode ser utilizada para:
- controlo da composição de aminoácidos;
- avaliação das proporções molares;
- quantificação do teor de péptido;
- confirmação da identidade.
O método tem limitações, uma vez que determinados aminoácidos podem sofrer alterações durante a hidrólise.
Por isso, a análise de aminoácidos é preferencialmente combinada com:
- HPLC;
- LC-MS;
- MS/MS;
- ensaio de péptidos;
- análise da humidade residual;
- análise de contra-iões.
Exclusão de responsabilidade relativa à investigação
Os péptidos de investigação da Peptidera são disponibilizados exclusivamente para Research Use Only (RUO) e destinam-se à investigação laboratorial e a aplicações analíticas.
Não se destina ao consumo humano ou animal, a utilização para diagnóstico, aplicações terapêuticas ou autoadministração.
Conhecimento sobre péptidos e controlo de qualidade
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