Espectrometria de massas aplicada a peptídeos explicada

Espectrometria de massa em péptidos: como é investigada a identidade molecular?

No controlo de qualidade de péptidos de investigação, combinam-se frequentemente várias técnicas analíticas. A HPLC pode fornecer informações sobre a pureza cromatográfica, mas um pico principal elevado não prova automaticamente que o péptido correto está presente.

Para investigar mais aprofundadamente a identidade molecular, utiliza-se frequentemente a espectrometria de massa.

A espectrometria de massa, geralmente abreviada como MS, é uma técnica analítica que mede a relação massa-carga de moléculas ionizadas. Na análise de péptidos, a massa molecular medida pode ser comparada com a massa teoricamente esperada da sequência de aminoácidos.

Quando estes valores coincidem, isso apoia a identificação do péptido analisado. Ainda assim, a espectrometria de massa, por si só, também não fornece uma visão completa da qualidade.

Neste blogue, explicamos como funciona a espectrometria de massa, por que motivo os péptidos podem produzir vários sinais de massa e como os resultados de MS são interpretados em conjunto com a HPLC e outros métodos analíticos.

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O que é a espectrometria de massa?

A espectrometria de massa é uma técnica analítica através da qual as moléculas são convertidas em partículas carregadas, ou seja, iões.

Estes iões são depois separados e medidos com base na sua relação massa-carga.

Esta relação é apresentada como:

m/z

Isto significa:

• m para massa;
• z para carga elétrica.

Assim, um espectrómetro de massa nem sempre mede diretamente a massa molecular completa. O instrumento mede a relação entre massa e carga.

No caso de moléculas maiores, incluindo muitos péptidos, podem formar-se múltiplas cargas. Por conseguinte, o mesmo péptido pode ser visível em diferentes posições do espectro de massa.

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Por que motivo se utiliza a espectrometria de massa na análise de péptidos?

Um péptido é constituído por uma sequência específica de aminoácidos.

Cada combinação de aminoácidos tem uma massa molecular teoricamente calculável.

A espectrometria de massa pode ser utilizada para investigar se a massa medida corresponde a este valor teórico.

A análise por MS pode contribuir para:

• confirmação da identidade molecular;
• comparação com a massa molecular teórica;
• deteção de determinadas modificações químicas;
• análise de produtos de degradação;
• investigação de variantes do péptido;
• comparação entre lotes de produção.

Uma massa correspondente apoia a identidade de um péptido.

No entanto, o resultado deve ser sempre avaliado em conjunto com o método analítico e outros dados de qualidade.

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O que é a massa molecular teórica?

A massa molecular teórica é calculada com base em:

• a sequência de aminoácidos;
• o número de aminoácidos;
• eventuais modificações químicas;
• a forma molecular;
• grupos terminais específicos.

Quando os aminoácidos formam uma cadeia peptídica, formam-se ligações peptídicas.

Durante a formação de cada ligação peptídica, é eliminada uma molécula de água. Por isso, a massa de um péptido completo não é simplesmente a soma das massas de todos os aminoácidos individuais.

As modificações também podem influenciar a massa.

Exemplos:

• amidificação;
• acetilação;
• fosforilação;
• oxidação;
• adição de cadeias de ácidos gordos;
• formação de pontes dissulfureto.

Por isso, a massa teórica tem de ser calculada para a estrutura molecular exacta.

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O que significa peso molecular?

Os termos massa molecular e peso molecular são frequentemente utilizados como sinónimos.

Nos relatórios laboratoriais, o valor é normalmente apresentado em:

• dalton, abreviado como Da;
• quilodalton, abreviado como kDa.

Um dalton corresponde aproximadamente à massa de um átomo de hidrogénio.

Um péptido com uma massa molecular de 3 000 Da tem, portanto, uma massa de aproximadamente 3 kDa.

A massa molecular dos péptidos pode variar bastante, dependendo de:

• comprimento da cadeia;
• composição de aminoácidos;
• modificações químicas.

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Como funciona um espectrómetro de massas?

Um espectrómetro de massas é normalmente constituído por vários componentes.

1. Introdução da amostra

O péptido é primeiro preparado e introduzido no instrumento.

A preparação da amostra pode influenciar:

• intensidade do sinal;
• detectabilidade;
• formação de iões;
• sinais de fundo.

2. Ionização

As moléculas são carregadas electricamente.

As técnicas mais utilizadas para a análise de péptidos são:

• ionização por electropulverização;
• ionização/dessorção por laser assistida por matriz.

3. Análise de massas

Os iões formados são separados com base na sua razão massa/carga.

4. Detecção

O detector regista os iões.

5. Processamento de dados

Os sinais medidos são convertidos num espectro de massas.

Este espectro contém picos correspondentes aos iões detectados.

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O que é a ionização por electropulverização?

Ionização por electropulverização, abreviada como ESI, é uma técnica de ionização muito utilizada para péptidos.

Durante a ESI, uma amostra líquida é conduzida através de uma abertura fina enquanto é aplicada uma tensão eléctrica.

Deste modo, formam-se gotículas electricamente carregadas.

Quando o solvente evapora, permanecem moléculas carregadas.

Uma característica importante da ESI é o facto de moléculas maiores poderem adquirir várias cargas eléctricas.

Um péptido pode, por exemplo, apresentar-se como:

• [M+H]⁺;
• [M+2H]²⁺;
• [M+3H]³⁺.

Aqui, M representa a massa molecular do péptido.

Várias cargas originam sinais m/z diferentes para a mesma molécula.

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Porque é que um péptido tem vários picos?

Quando um péptido capta vários protões, formam-se diferentes estados de carga.

Suponha que um péptido tenha uma massa molecular de aproximadamente 3 000 Da.

Os sinais possíveis são aproximadamente:

• uma carga positiva: m/z aproximadamente 3.001;
• duas cargas positivas: m/z aproximadamente 1.501;
• três cargas positivas: m/z aproximadamente 1.001.

Todos estes sinais podem corresponder ao mesmo péptido.

O software pode utilizar esta distribuição de cargas para calcular a massa molecular original.

Este processo é designado por desconvolução.

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O que é um espetro de massa desconvoluído?

Uma medição ESI bruta pode conter vários picos de carga.

Isso pode tornar a interpretação complexa.

Com um software de desconvolução, as diferentes formas de carga são convertidas numa única massa molecular estimada.

O espetro desconvoluído pode, assim, ser comparado mais facilmente com:

• a massa teórica;
• um padrão de referência;
• especificações do produto.

A qualidade do cálculo depende de:

• intensidade do sinal;
• resolução;
• ruído de fundo;
• definições do software;
• presença de componentes sobrepostos.

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O que é MALDI?

A dessorção/ionização a laser assistida por matriz, abreviada como MALDI, é outra técnica de ionização.

O péptido é misturado com um material de matriz e aplicado numa placa de medição.

Um laser ativa a matriz, originando iões de péptidos.

A MALDI produz frequentemente sobretudo iões com carga unitária.

Deste modo, o espetro pode parecer mais simples do que um espetro de ESI.

A MALDI é frequentemente combinada com um analisador de massa de tempo de voo.

Esta combinação é designada por:

MALDI-TOF

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O que é o tempo de voo?

Num analisador de massa de tempo de voo, os iões são acelerados por um campo elétrico.

Em seguida, atravessam um tubo de medição.

Os iões com uma razão massa-carga inferior chegam normalmente ao detetor mais rapidamente do que os iões com uma razão superior.

O tempo de voo é utilizado para calcular o valor m/z.

Os sistemas TOF podem ser utilizados para:

• identificação de péptidos;
• determinação da massa;
• comparação de variantes moleculares.

A precisão final depende da calibração, das definições do instrumento e da preparação da amostra.

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O que é LC-MS?

A cromatografia líquida-espetrometria de massa, abreviada como LC-MS, combina a cromatografia líquida com a espetrometria de massa.

Os componentes são primeiro separados cromatograficamente.

Em seguida, os sinais individuais são analisados pelo espetrómetro de massa.

A LC-MS pode combinar informações sobre:

• tempo de retenção;
• perfil cromatográfico;
• massa molecular;
• possíveis impurezas;
• produtos de degradação.

Deste modo, a LC-MS pode fornecer mais informações do que uma análise HPLC ou MS isolada.

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Qual é a diferença entre HPLC e a espetrometria de massa?

A HPLC e a espetrometria de massa respondem a diferentes questões analíticas.

HPLC

A HPLC pode fornecer informações sobre:

• pureza cromatográfica;
• quantidade relativa dos componentes detetados;
• tempos de retenção;
• alterações no perfil cromatográfico.

Espectrometria de massa

A espectrometria de massa pode fornecer informações sobre:

• massa molecular;
• identidade possível;
• modificações químicas;
• determinados produtos de degradação.

Uma comparação simplificada:

Por isso, ambas as técnicas são frequentemente combinadas.

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Pode a mesma massa molecular ocorrer em péptidos diferentes?

Sim.

Diferentes sequências de aminoácidos podem ter a mesma massa total ou uma massa total quase igual.

Estas são por vezes designadas por estruturas isobáricas.

Por conseguinte, uma massa correspondente nem sempre prova que a sequência completa de aminoácidos está correta.

Para uma identificação mais abrangente, poderão ser necessárias técnicas adicionais, tais como:

• espectrometria de massa em tandem;
• análise de fragmentação;
• análise de aminoácidos;
• análise de sequência;
• comparação com um padrão de referência.

O método analítico necessário depende do grau de certeza pretendido.

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O que é a espectrometria de massa em tandem?

A espectrometria de massa em tandem é geralmente escrita como:

MS/MS

Durante a MS/MS, um ião peptídico selecionado é posteriormente fragmentado.

Os fragmentos formados são depois novamente medidos.

O padrão de fragmentação pode fornecer informações sobre:

• sequência de aminoácidos;
• localização das modificações;
• identidade do péptido;
• estrutura dos produtos de degradação.

A MS/MS pode, assim, fornecer mais informações estruturais do que apenas a massa molecular intacta.

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O que são fragmentos peptídicos?

Quando uma cadeia peptídica se quebra em locais específicos durante a MS/MS, formam-se iões fragmento.

Os tipos de fragmentos mais utilizados são:

• iões b;
• iões y.

As massas destes fragmentos podem ser utilizadas para reconstruir partes da sequência de aminoácidos.

A interpretação pode ser complexa.

Nem todos os péptidos se fragmentam da mesma forma.

Os fatores que podem influenciar incluem:

• composição de aminoácidos;
• carga elétrica;
• tamanho do péptido;
• método de fragmentação;
• modificações químicas.

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A espectrometria de massa pode detetar oxidação?

Determinadas alterações oxidativas provocam uma alteração de massa mensurável.

Por exemplo, a adição de um átomo de oxigénio conduz frequentemente a um aumento de massa de aproximadamente 16 Da.

Deste modo, a espectrometria de massa pode ajudar a identificar determinados produtos de oxidação.

A deteção depende de:

• concentração;
• resolução do instrumento;
• método analítico;
• separação de componentes.

Nem todas as alterações oxidativas podem ser totalmente localizadas apenas com base num único sinal de massa.

Para tal, poderá ser necessária uma análise de fragmentação adicional.

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A espectrometria de massa pode determinar a quantidade de péptido?

Não automaticamente.

A intensidade de um sinal de massas é influenciada por:

• eficiência de ionização;
• propriedades moleculares;
• solvente;
• definições do instrumento;
• presença de outros componentes.

Por conseguinte, um sinal duas vezes mais intenso não significa automaticamente que esteja presente o dobro da quantidade de péptido.

Para uma quantificação fiável, são necessários métodos validados e padrões adequados.

As técnicas possíveis incluem:

• LC-MS quantitativa;
• padrões internos;
• referências marcadas isotopicamente;
• ensaios de HPLC calibrados.

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A espectrometria de massas pode demonstrar a esterilidade?

Não.

A espectrometria de massas para a identificação de péptidos não é um teste de esterilidade.

O resultado não fornece informações diretas sobre:

• bactérias;
• fungos;
• crescimento microbiológico;
• esterilidade do produto.

A esterilidade requer métodos de ensaio microbiológicos específicos.

As endotoxinas também não são determinadas automaticamente durante uma análise padrão de EM de péptidos.

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A espectrometria de massas pode medir endotoxinas?

Não através de uma análise de identidade padrão.

As endotoxinas são componentes bacterianos complexos.

Para a análise de endotoxinas, são utilizados métodos específicos, tais como:

• teste de lisado de amebócitos de Limulus;
• métodos de fator C recombinante.

Por conseguinte, um espectro de massas correto de um péptido não prova que o material tenha um baixo teor de endotoxinas.

A identidade, a pureza, a esterilidade e as endotoxinas são parâmetros de qualidade distintos.

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Por que motivo os resultados laboratoriais podem diferir?

Diferentes laboratórios podem comunicar valores de massa ligeiramente diferentes.

As causas possíveis incluem:

• tipo de instrumento;
• calibração;
• método de ionização;
• preparação da amostra;
• adutos salinos;
• software utilizado;
• resolução;
• método de interpretação.

Pequenas diferenças não significam automaticamente que um resultado esteja incorreto.

O valor medido deve ser avaliado no contexto de:

• exatidão do instrumento;
• forma molecular esperada;
• método de análise utilizado.

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O que são adutos?

Durante a espectrometria de massas, os iões peptídicos podem ligar-se a outras partículas carregadas.

Exemplos:

• sódio;
• potássio;
• amónio.

Isto pode originar picos adicionais.

Por exemplo, um aduto de sódio tem uma massa diferente da de um ião peptídico simplesmente protonado.

Os adutos não significam automaticamente que esteja presente outro péptido.

A interpretação requer conhecimentos sobre:

• preparação da amostra;
• tampões utilizados;
• formas iónicas esperadas.

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Que informações devem constar de um relatório de EM?

Um relatório de análise profissional pode incluir, entre outros:

• nome do péptido;
• número do lote;
• massa molecular teórica;
• massa molecular medida;
• método de ionização;
• tipo de espectrómetro de massas;
• espectro de massas;
• data da análise;
• nome do laboratório.

Numa análise mais abrangente, também podem ser indicados:

• intervalo de medição;
• resolução;
• exatidão da massa;
• dados de fragmentação;
• software utilizada.

A documentação necessária depende do objetivo da investigação.

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Espectrometria de massa e controlo de lotes

Cada lote de produção pode ser analisado separadamente.

A análise por MS específica do lote apoia:

• controlo da identidade;
• comparação entre lotes;
• rastreabilidade;
• investigação de desvios.

O número do lote indicado no relatório de análise deve corresponder à identificação no frasco.

Um resultado de espectrometria de massa sem uma associação clara ao lote tem um valor mais limitado para a rastreabilidade.

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Limitações científicas

A espectrometria de massa é uma técnica analítica poderosa, mas não constitui uma avaliação completa da qualidade.

Uma massa molecular correspondente não prova automaticamente:

• sequência completa de aminoácidos;
• elevada pureza cromatográfica;
• quantidade correta de péptido;
• esterilidade;
• baixo teor de endotoxinas;
• atividade biológica;
• estabilidade a longo prazo.

Para uma avaliação mais abrangente, podem ser necessários vários métodos:

• HPLC;
• LC-MS;
• MS/MS;
• ensaio quantitativo;
• estudo de estabilidade;
• análise da humidade;
• testes adicionais específicos do produto.

Os resultados devem ser interpretados em conjunto.

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Resumo

A espectrometria de massa é utilizada para investigar a massa molecular de péptidos para investigação.

A técnica mede a relação massa-carga de moléculas ionizadas.

Na análise de péptidos, a massa medida pode ser comparada com a massa teoricamente esperada.

Uma correspondência apoia a identificação molecular.

As principais técnicas analíticas incluem:

• ESI-MS;
• MALDI-TOF;
• LC-MS;
• MS/MS.

No entanto, a espectrometria de massa não fornece automaticamente informações sobre:

• quantidade exata;
• pureza cromatográfica;
• esterilidade;
• endotoxinas;
• atividade biológica.

Por isso, a MS é frequentemente combinada com HPLC e análises de qualidade adicionais.

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Declaração de exoneração de responsabilidade relativa à investigação

Os péptidos para investigação da Peptidera são disponibilizados exclusivamente para Research Use Only (RUO) e destinam-se a investigação laboratorial e aplicações analíticas.

Não destinado ao consumo humano ou animal, a utilização para diagnóstico, aplicações terapêuticas ou autoadministração.

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Categoria:
Conhecimento sobre péptidos & controlo de qualidade

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Sugestões de ligações internas:

• Ligação para PB-0230 sobre a diferença entre HPLC e MS
• Ligação para PB-0229 sobre análise específica do lote
• Ligação para a página do COA com resultados de testes por espectrometria de massa
• Ligação para a coleção de péptidos para investigação
• Ligação para a página sobre análise laboratorial independente