Ensaio de peptídeos: pureza versus teor de peptídeos
Ensaio de peptídeo: a diferença entre pureza e conteúdo real de peptídeo
Na avaliação da qualidade de peptídeos de pesquisa, o primeiro foco é frequentemente a percentagem de pureza. Nos certificados de análise, aparecem regularmente valores como 98%, 99% ou 99,5% de pureza HPLC.
Uma percentagem elevada pode fornecer informações importantes sobre a composição cromatográfica de uma amostra. No entanto, não responde automaticamente a outra questão importante:
Quanto peptídeo real está presente no frasco?
Pureza HPLC e conteúdo de peptídeo são frequentemente confundidos. Por exemplo, um peptídeo de pesquisa pode ter uma pureza cromatográfica de 99%, enquanto a proporção real de peptídeo no material liofilizado total é menor.
Isso não indica necessariamente um problema de qualidade. Um produto liofilizado pode conter, além do peptídeo, água, contraíons, sais ou componentes da formulação.
Para investigar a quantidade real de peptídeo, pode ser realizada uma análise quantitativa. Isto é frequentemente chamado de ensaio de peptídeo.
Neste blog discutimos o que é um ensaio de peptídeo, como difere da pureza HPLC e por que podem ser necessários vários métodos de análise para uma avaliação completa da qualidade.
O que é um ensaio de peptídeo?
Um ensaio de peptídeo é uma determinação analítica que investiga a quantidade de um peptídeo específico numa amostra.
Dependendo do método utilizado, o resultado pode ser apresentado como:
- miligramas de peptídeo por frasco;
- miligramas de peptídeo por grama de material;
- percentagem de conteúdo de peptídeo;
- concentração numa solução;
- quantidade em relação a um padrão de referência.
Um ensaio foca-se, portanto, na quantidade.
A questão central é:
Quanto do peptídeo desejado está realmente presente?
Isto difere de uma análise padrão de pureza HPLC.
Na pureza cromatográfica, a questão central é:
Qual parte do sinal cromatográfico medido pertence ao componente principal?
Ambas as análises podem ser valiosas, mas descrevem propriedades diferentes.
O que significa pureza HPLC?
HPLC significa Cromatografia Líquida de Alto Desempenho.
Durante uma análise HPLC, uma amostra dissolvida é passada por uma coluna cromatográfica. Diferentes componentes moleculares movem-se a velocidades diferentes através desta coluna.
Isto permite que sejam separados uns dos outros.
O resultado é apresentado num cromatograma.
Um cromatograma geralmente contém:
- um eixo de tempo horizontal;
- uma resposta vertical do detector;
- um pico principal;
- eventuais picos secundários menores.
Por exemplo, quando um certificado de análise indica uma pureza por HPLC de 99%, isso geralmente significa que cerca de 99% do sinal cromatográfico integrado é atribuído ao pico principal.
Não significa automaticamente que 99% da massa total no frasco seja do peptídeo desejado.
Por que a pureza por HPLC não é o mesmo que o teor de peptídeo?
Uma análise padrão de pureza por HPLC geralmente compara as áreas relativas dos picos cromatográficos detectados.
Nem todos os componentes num frasco liofilizado são necessariamente medidos da mesma forma.
O conteúdo total pode, por exemplo, consistir em:
- o peptídeo desejado;
- resíduo líquido;
- água ligada;
- íons acetato;
- íons trifluoroacetato;
- íons cloreto;
- sais;
- excipientes.
Alguns desses componentes produzem pouco ou nenhum sinal detector semelhante sob as condições de HPLC utilizadas.
Por isso, uma amostra pode ter alta pureza cromatográfica, enquanto o teor real de peptídeo é mais baixo.
Isto não é uma contradição. As análises medem propriedades diferentes.
Um exemplo de cálculo simplificado
Suponha que uma amostra liofilizada pese no total 10 miligramas.
A composição é hipotética:
- 8,5 mg de peptídeo desejado;
- 0,8 mg de contra-íons;
- 0,5 mg de água;
- 0,2 mg de outros componentes.
Uma análise por HPLC pode mostrar que 99% dos sinais relacionados ao peptídeo detectados pertencem ao pico principal.
No entanto, 99% da massa seca total não consiste em peptídeo.
O teor real de peptídeo neste exemplo simplificado é:
8,5 mg de 10 mg = 85%
O resultado do HPLC e o ensaio podem, portanto, estar ambos corretos.
Eles apenas descrevem diferentes características de qualidade.
O que significa teor líquido de peptídeo?
O termo teor líquido de peptídeo é usado para a quantidade real de peptídeo após a contabilização de certos componentes não peptídicos.
Exemplos desses componentes são:
- água;
- contraíons;
- sais residuais;
- componentes da formulação.
O teor líquido de peptídeo pode ser apresentado como uma percentagem.
Por exemplo, quando um material liofilizado tem um teor líquido de peptídeo de 85%, isso significa que aproximadamente 85% da massa analisada é atribuída ao peptídeo.
O cálculo exato depende de:
- métodos de análise utilizados;
- composição do produto;
- fatores corretivos;
- especificações.
O termo deve, portanto, ser interpretado no contexto do relatório de análise.
Quais fatores influenciam o teor de peptídeo?
O teor real de peptídeo pode ser influenciado por vários fatores.
Humidade residual
Após a liofilização, geralmente permanece uma pequena quantidade de água.
Isto é chamado de humidade residual.
A quantidade pode depender de:
- processo de congelação;
- fase primária de secagem;
- fase secundária de secagem;
- formulação;
- condições de armazenamento;
- integridade da embalagem.
A humidade residual contribui para a massa total, mas não é um peptídeo.
Contra-íons
Peptídeos podem estar presentes na forma de sal durante a produção e purificação.
Contra-íons comuns são:
- acetato;
- trifluoroacetato;
- cloreto.
Estes iões contribuem para a massa total do material.
A quantidade de contra-íon pode variar entre lotes de produção e métodos de purificação.
Sais
Sais residuais podem originar-se de:
- buffers;
- processos de purificação;
- troca iónica;
- etapas de formulação.
Excipientes
Em alguns processos de liofilização, são usados excipientes para suportar a estrutura física ou a estabilidade.
Estas substâncias podem fazer parte do material total liofilizado.
Como pode ser determinado o conteúdo peptídico?
Não existe um único método de análise universal que seja ótimo para todos os peptídeos.
O método adequado depende de:
- sequência de aminoácidos;
- estrutura molecular;
- quantidade de material;
- precisão desejada;
- objetivo da investigação.
Técnicas possíveis são:
- HPLC quantitativa;
- análise de aminoácidos;
- quantificação por LC-MS;
- espectrofotometria ultravioleta;
- cálculo do balanço de massa.
Cada método tem suas próprias vantagens e limitações.
HPLC quantitativa
A HPLC não pode ser usada apenas para análise de pureza relativa.
Com um padrão de referência adequado, a HPLC também pode ser aplicada quantitativamente.
Aqui, o sinal do detector da amostra é comparado com sinais de concentrações conhecidas.
Normalmente, é feita uma curva de calibração para isso.
Um procedimento simplificado consiste em:
- preparar soluções de referência;
- medir concentrações conhecidas;
- elaborar uma curva de calibração;
- medir a amostra desconhecida;
- calcular a concentração de peptídeos.
Para resultados fiáveis, o método deve estar suficientemente validado.
Por que um padrão de referência é importante?
Um padrão de referência é um material bem caracterizado cujas propriedades relevantes são conhecidas.
Na HPLC quantitativa, o padrão pode ser usado para comparar o sinal medido com uma quantidade conhecida.
A qualidade do padrão influencia a fiabilidade do ensaio.
Propriedades importantes são:
- identidade confirmada;
- pureza conhecida;
- conteúdo peptídico conhecido;
- armazenamento adequado;
- rastreabilidade.
Um padrão mal caracterizado pode levar a desvios sistemáticos na medição.
O que é uma curva de calibração?
Uma curva de calibração descreve a relação entre:
- concentração conhecida;
- sinal do detector medido.
São analisadas várias soluções padrão.
Os sinais medidos são então plotados contra as concentrações conhecidas.
Quando o método é linear dentro do intervalo de medição utilizado, a concentração de uma amostra desconhecida pode ser calculada.
A fiabilidade depende, entre outros fatores, de:
- linearidade;
- exatidão;
- precisão;
- qualidade do padrão;
- preparação da amostra.
Análise de aminoácidos
A análise de aminoácidos pode ser usada para investigar a composição de aminoácidos ou a quantidade de peptídeo.
Durante uma análise clássica, a cadeia peptídica é decomposta em aminoácidos individuais.
Isto ocorre frequentemente por hidrólise.
Os aminoácidos libertados são depois separados e medidos.
A análise de aminoácidos pode fornecer informação sobre:
- composição de aminoácidos;
- relação entre aminoácidos;
- quantidade estimada de peptídeo.
O método pode ser útil para quantificação, mas tem limitações.
Limitações da análise de aminoácidos
Nem todos os aminoácidos permanecem totalmente estáveis durante a hidrólise.
Desafios possíveis são:
- degradação parcial;
- hidrólise incompleta;
- conversão de certos aminoácidos;
- perdas durante a preparação da amostra.
Por isso, frequentemente são selecionados aminoácidos específicos para cálculos quantitativos.
O método deve ser adaptado ao peptídeo em estudo.
LC-MS para análise quantitativa
A cromatografia líquida-espectrometria de massas combina separação cromatográfica com espectrometria de massas.
LC-MS pode ser usado para:
- identificação;
- análise de modificações;
- detecção de produtos de degradação;
- quantificação.
Para uma quantificação fiável são geralmente necessários:
- padrões de calibração adequados;
- condições de medição validadas;
- padrões internos;
- preparação controlada da amostra.
A intensidade de um sinal de massa não pode ser traduzida diretamente numa quantidade exata sem calibração.
Por que a intensidade do sinal não é automaticamente a quantidade?
Diferentes moléculas não ionizam todas com a mesma eficiência.
A intensidade do sinal na espectrometria de massas é influenciada por:
- estrutura molecular;
- carga elétrica;
- solvente;
- concentração de sal;
- configurações do instrumento;
- presença de outros componentes.
Um sinal de massa duas vezes maior não significa automaticamente que há o dobro de peptídeo.
LC-MS quantitativo requer um método analítico controlado.
Espectrofotometria ultravioleta
Alguns peptídeos absorvem luz ultravioleta.
Esta absorção pode ser usada para determinação de concentração em certas condições.
A adequação depende da composição de aminoácidos.
Principalmente aminoácidos aromáticos podem contribuir para a absorção UV, incluindo:
- triptofano;
- tirosina;
- fenilalanina.
Nem todos os peptídeos contêm aminoácidos suficientes para uma quantificação fiável.
Outros componentes também podem influenciar o sinal UV.
O que é uma balança de massa?
Numa balança de massa, vários componentes medidos são combinados.
Um cálculo simplificado pode considerar:
- pureza por HPLC;
- teor de água;
- teor de contra-íon;
- componentes inorgânicos;
- outras substâncias medidas.
Isto permite uma estimativa do teor líquido de peptídeo.
A fiabilidade depende da completude das análises.
Componentes não medidos podem influenciar o resultado.
O que é o conteúdo do frasco?
A quantidade indicada num frasco é frequentemente expressa em miligramas.
Por exemplo:
10 mg de peptídeo de investigação
Para uma avaliação quantitativa fiável, deve estar claro o que este valor descreve.
As interpretações possíveis são:
- quantidade nominal;
- quantidade de material pesada;
- quantidade líquida de peptídeo calculada;
- quantidade de peptídeo medida.
Estes valores não são automaticamente os mesmos.
Especificações transparentes do produto esclarecem como a quantidade foi determinada.
O que é o controlo do peso de enchimento?
Durante a produção, pode ser verificado quanto material é distribuído em cada frasco.
Isto é por vezes chamado controlo do peso de enchimento.
O método pode fornecer informações sobre:
- consistência entre frascos;
- quantidade total de material liofilizado;
- variação durante o processo de enchimento.
Uma determinação de peso sozinha não mostra, no entanto, quanto desse material é constituído pelo peptídeo desejado.
Para isso, são necessárias informações analíticas adicionais.
Por que é que os frascos dentro de um lote podem variar?
Os processos de produção são concebidos para manter a variação o mais pequena possível.
Ainda assim, pode ocorrer alguma dispersão.
As causas possíveis são:
- variação no enchimento;
- diferenças na liofilização;
- resíduo líquido;
- incerteza de medição;
- perda de material.
Por isso, os controlos de qualidade podem analisar várias amostras de um lote.
Um frasco testado não descreve automaticamente cada frasco individual na totalidade.
O que significa incerteza de medição?
Cada medição analítica contém um certo grau de incerteza.
As fontes possíveis são:
- variação do instrumento;
- preparação da amostra;
- erros de pipetagem;
- calibração;
- padrão de referência;
- processamento de dados.
Por isso, uma quantidade medida não deve ser considerada absolutamente isenta de erro.
Laboratórios profissionais avaliam:
- exatidão;
- precisão;
- repetibilidade;
- reprodutibilidade.
O que é exatidão?
A exatidão descreve o quão próximo um valor medido está do valor real ou do valor de referência aceite.
Um método pode, por exemplo, ser testado com amostras cuja quantidade é conhecida.
Quando os resultados medidos estão próximos dos valores esperados, isso apoia a exatidão.
O que é precisão?
A precisão descreve o quão próximas estão as medições repetidas umas das outras.
Um método pode fornecer resultados muito precisos que, no entanto, desviam sistematicamente do valor real.
Por isso, tanto a exatidão como a precisão são importantes.
Por que é necessária a validação do método?
Um método de análise deve ser comprovadamente adequado para o propósito pretendido.
Numa análise peptídica quantitativa, as características de validação relevantes podem ser:
- especificidade;
- exatidão;
- precisão;
- linearidade;
- intervalo de medição;
- robustez;
- limite de quantificação.
Um método adequado para investigação de identidade não é automaticamente adequado para quantificação exata.
Como interpretar os dados da análise num COA?
Verifique pelo menos o seguinte numa análise peptídica:
- Qual método de análise foi utilizado?
- O resultado é apresentado em miligramas ou em percentagem?
- Foi utilizado um padrão de referência?
- Está claro o que o valor medido descreve?
- O resultado é específico para o lote?
- A data da análise está indicada?
- O método é adequado para quantificação?
Uma percentagem isolada sem método ou contexto oferece informação limitada.
Por que pureza e ensaio devem ser avaliados em conjunto?
Pureza e ensaio complementam-se.
Uma alta pureza por HPLC pode indicar que poucos componentes secundários relacionados ao peptídeo foram detectados.
Um ensaio quantitativo pode indicar quanto do peptídeo desejado está presente.
Juntos fornecem mais informação sobre:
- composição relativa;
- quantidade real;
- consistência do lote;
- especificações do produto.
Nenhum dos dois parâmetros fornece sozinho uma visão completa da qualidade.
Limitações científicas
Um ensaio de peptídeo tem sempre limitações específicas do método.
Os resultados podem ser influenciados por:
- preparação da amostra;
- padrão de referência;
- configurações do instrumento;
- componentes interferentes;
- incerteza de medição;
- estabilidade da amostra.
Mesmo um ensaio preciso não fornece automaticamente informação sobre:
- esterilidade;
- endotoxinas;
- atividade biológica;
- estabilidade prolongada;
- sequência completa de aminoácidos.
Análises separadas são necessárias para isso.
Resumo
Pureza por HPLC e teor de peptídeo são parâmetros de qualidade diferentes.
A pureza por HPLC geralmente descreve a proporção relativa do pico principal dentro dos sinais cromatográficos detectados.
Um ensaio de peptídeo investiga quanto do peptídeo desejado está realmente presente.
O material liofilizado total pode ainda conter:
- água;
- contraíons;
- sais;
- excipientes.
Por isso, 99% de pureza por HPLC não significa automaticamente que 99% da massa total do frasco é peptídeo.
Métodos possíveis para quantificação incluem:
- HPLC quantitativa;
- análise de aminoácidos;
- LC-MS;
- Espectrofotometria UV;
- balanço de massa.
Para uma avaliação ampla da qualidade, pureza, identidade, teor de peptídeo, informação do lote e testes analíticos adicionais devem ser interpretados em conjunto.
Aviso de investigação
Os peptídeos de investigação da Peptidera são oferecidos exclusivamente para Research Use Only (RUO) e destinam-se a investigação laboratorial e aplicações analíticas.
Não destinado ao consumo humano ou animal, uso diagnóstico, aplicação terapêutica ou autoadministração.
Produtos Peptidera relacionados:
Peptídeos de investigação liofilizados com identificação de lote e dados analíticos de qualidade disponíveis
Blogs internos relacionados:
- PB-0229 — Números de lote e rastreabilidade
- PB-0230 — Pureza de peptídeos e HPLC
- PB-0231 — Espectrometria de massa para peptídeos
- PB-0232 — Certificado de Análise para peptídeos
- PB-0227 — Peptídeos liofilizados e liofilização
Propostas de ligações internas:
- Ligação para PB-0230 na pureza por HPLC
- Ligação para PB-0231 na LC-MS e identidade molecular
- Ligação para PB-0232 nos dados do ensaio num COA
- Ligação para PB-0229 no controlo de qualidade específico do lote
- Ligação para a página Peptidera com certificados de análise
- Ligação para a coleção de peptídeos de investigação